專利名稱：一種真核蛋白表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體，具體涉及一種真核蛋白表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白表達(dá)是實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用非常廣泛的技術(shù)，目前主要有原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)兩種。原核表達(dá)系統(tǒng)能夠在較短時間內(nèi)獲得大量目的蛋白，成本也比較低廉。但無法對表達(dá)時間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控；細(xì)菌產(chǎn)生的致熱原致使表達(dá)產(chǎn)物難以應(yīng)用于臨床；目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，致產(chǎn)物純化困難；原核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工修飾體系不完善；表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。
真核表達(dá)系統(tǒng)能夠彌補(bǔ)原核表達(dá)系統(tǒng)的不足，能誘導(dǎo)基因高效表達(dá)，嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)，即不僅可控制基因表達(dá)的“開關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達(dá)量；表達(dá)后修飾，使蛋白更接近體內(nèi)型。但是成本相對高，并且表達(dá)量比原核要低。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。能使目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆載體叫表達(dá)載體，可以是質(zhì)粒、曬菌體或病毒等。典型的表達(dá)載體帶有能使基因表達(dá)的調(diào)控序列，并在適當(dāng)位置有可插入外源基因的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，常用細(xì)菌質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建，構(gòu)建過程中運(yùn)用限制性核酸內(nèi)切酶將目的基因與載體基因連接，導(dǎo)入生物體實(shí)現(xiàn)表達(dá)。標(biāo)記基因可幫助識別質(zhì)粒并檢測是否成功整合到染色體DNA中。Invitrogen公司的pcDNA3. I系列表達(dá)載體在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞里均能夠高水平、穩(wěn)定表達(dá)，其CMV啟動子能夠保證在廣泛的哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行高水平表達(dá)，多克隆位點(diǎn)是插入外源基因的部位，有很多種限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，可產(chǎn)生粘性末端，便于插入外源基因。Neomycin用于篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,Ampicillin用來篩選目的質(zhì)粒。其中pcDNA3. I帶有his,myc標(biāo)簽基因,his可以用于表達(dá)蛋白的純化及鑒定,但購買pcDNA3. I帶有his標(biāo)簽的真核表達(dá)載體，就要購買相應(yīng)配套的蛋白純化體系及鑒定體系的相關(guān)試劑，價格昂貴。而pcDNA3. 3 TOPO表達(dá)載體是在pcDNA3. I的基礎(chǔ)上對啟動子進(jìn)行了修飾，所以表達(dá)水平高于pcDNA3. 1，能獲得極高的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，適于大規(guī)模蛋白制備。但pcDNA3. 3T0P0表達(dá)載體不帶有任何標(biāo)簽基因，表達(dá)的蛋白無法進(jìn)行富集純化和鑒定。因此，要獲得既能高效表達(dá)，又能易于富集純化、鑒定目的蛋白的真核蛋白表達(dá)載體，還需要進(jìn)一步的研究和創(chuàng)新。發(fā)明目的為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種新型真核蛋白表達(dá)載體，該表達(dá)載體不僅能高水平表達(dá)蛋白、執(zhí)行翻譯后修飾、維護(hù)蛋白天然結(jié)構(gòu)，并可同時表達(dá)用于表達(dá)蛋白鑒定和純化的標(biāo)簽蛋白，而且鑒定及純化蛋白所用的試劑不依賴于生物試劑公司，價格低廉。本發(fā)明的另一目的是提供所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第三個目的是提供所述表達(dá)載體在表達(dá)目的蛋白中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的一種真核蛋白表達(dá)載體，所述表達(dá)載體為在PCDNA3. 3T0P0表達(dá)載體的TOPO位點(diǎn)上插有Human IgGl-Fc基因，得到結(jié)構(gòu)如下的所述真核蛋白表達(dá)載體pcDNA3. 3-IgG-Fc 質(zhì)粒
權(quán)利要求
1.一種真核蛋白表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為在pcdna3. 3T0P0表達(dá)載體的TOPO位點(diǎn)上插入Human IgGl-Fc基因，得到蛋白表達(dá)載體pcDNA3. 3_I gG_Fc質(zhì)粒。
2.按照權(quán)利要求I所述的真核蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括步驟(I) human IgGl-Fc基因擴(kuò)增引物設(shè)計，⑵以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增humanIgGl-Fc基因，(3)將human IgGl-Fc PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pcDNA3. 3T0P0載體連接，從中選擇CMV forward引物測序human IgGl-Fc為正向的pcDNA3. 3_IgG_Fc質(zhì)粒,得到所述真核蛋白表達(dá)載體。
3.按照權(quán)利要求I所述的真核蛋白表達(dá)載體在表達(dá)目的蛋白中的應(yīng)用，其特征在于其步驟包括(I)目的蛋白基因的特異引物設(shè)計，(2)以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以所設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(3)目的蛋白基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pcDNA3. 3-IgG-Fc用HindII I、BgLII及BamHI同時來酶切，連接具有相同粘性末端的pcDNA3. 3-IgG-Fc部分和目的基因部分(4)目的蛋白富集用所述目的蛋白基因插入pcDNA3. 3-IgG-Fc構(gòu)建的真核蛋白表達(dá)質(zhì)粒通過Lipofectin轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞,培養(yǎng)上清中加入蛋白A瓊脂糖懸液,雜交爐中低溫緩慢搖動混勻2. 5-3. 5小時，離心棄去上清，沉淀為蛋白A-目的蛋白復(fù)合物，加入上樣緩沖液煮沸3-6分鐘，取上清獲得含目的蛋白和標(biāo)簽蛋白的融合蛋白。
4.按照權(quán)利要求I所述的真核蛋白表達(dá)載體在表達(dá)目的蛋白中的應(yīng)用，其特征在于其步驟包括(I)目的蛋白基因的特異引物設(shè)計，(2)以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以所設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(3)目的蛋白基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接于T-easy載體，(4)用BamHI、HindIII及BgLII同時來酶切所述pcDNA3. 3-IgG-Fc和帶目的蛋白基因的T_easy兩種質(zhì)粒，連接具有相同粘性末端的pcDNA3. 3-IgG-Fc部分和目的基因部分，(5)目的蛋白富集用所述的pcDNA3. 3-IgG-Fc-4-lBB表達(dá)質(zhì)粒通過Lipofectin轉(zhuǎn)染cos_7細(xì)胞，培養(yǎng)上清中加入蛋白A瓊脂糖懸液，雜交爐中低溫緩慢搖動混勻2. 5-3. 5小吋，離心棄去上清，沉淀為蛋白A-目的蛋白復(fù)合物，加入上樣緩沖液煮沸3-6分鐘，取上清獲得含目的蛋白和標(biāo)簽蛋白的融合蛋白。
5.按照權(quán)利要求3或4所述的真核蛋白表達(dá)載體在表達(dá)目的蛋白中的應(yīng)用，其特征在于還包括步驟(6)目的蛋白鑒定以獲得的目的融合蛋白進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn),用辣根酶標(biāo)記的抗人IgG抗體與融合蛋白中的IgG-Fc部分結(jié)合顯色表明目的蛋白的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及真核蛋白表達(dá)載體，所述表達(dá)載體為在pcDNA3.3TOPO表達(dá)載體的TOPO位點(diǎn)上插入Human IgG1-Fc基因，得到真核蛋白表達(dá)載體pcDNA3.3-IgG-Fc質(zhì)粒。本發(fā)明構(gòu)建的真核蛋白表達(dá)載體，不僅能引入外源基因進(jìn)行蛋白表達(dá)，執(zhí)行翻譯后修飾，維護(hù)蛋白天然結(jié)構(gòu)；獲得極高的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，適合用于大規(guī)模蛋白制備；并可同時表達(dá)標(biāo)簽蛋白IgG-Fc，利用其可以對表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定和純化，且純化及鑒定蛋白所用試劑為實(shí)驗(yàn)室常備試劑，價格低廉，擺脫了對生物公司配套產(chǎn)品的依賴及配套產(chǎn)品價格昂貴的困擾。
文檔編號C12N15/66GK102676571SQ20111036628
公開日2012年9月19日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者張洪濤, 易玲, 許紹發(fā), 趙雁林 申請人:北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所