專利名稱：一種豬水泡病病毒vp1 蛋白分泌表達重組質(zhì)粒及其應(yīng)用的制作方法
—種豬水泡病病毒VP1蛋白分泌表達重組質(zhì)粒及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本申請涉及蛋白質(zhì)表達領(lǐng)域，特別涉及一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達的重組質(zhì)粒、該重組質(zhì)粒的構(gòu)建，以及采用該重組質(zhì)粒進行的豬水泡病病毒VPl蛋白的分泌表達。
背景技術(shù)：
豬水泡病(Swinevesicular disease, SVD)是由豬水泡病毒(swine vesiculardisease virus, SVDV)引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以口和蹄部產(chǎn)生水泡性損傷為特征，其臨床癥狀與口蹄疫、水泡性口炎和豬水泡疹相似，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病。SVDV為小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬 (Enterovirus)。與人類柯薩奇病毒(Human coxsackievirus) B5型有非常相近的理化特性、生物學(xué)特性及血清學(xué)關(guān)系。
目前，我國已經(jīng)消滅了豬水泡病，因此利用完整病毒粒子建立診斷方法存在潛在的散毒危險，在實踐中不可取。SVDV基因組為一單股正鏈RNA分子，全長為7400bp-7401bp， 基因組含一個大的開放閱讀框(0RF)，編碼一條由2185個氨基酸組成的多聚蛋白，經(jīng)翻譯后加工成為各種功能蛋白。SVDV結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(Pl區(qū))編碼病毒特異性結(jié)構(gòu)蛋白VPl (1D)、VP2 (1B)、VP3 (IC)和VP4 (IA),外殼蛋白VP1、VP2、和VP3包含中和性抗原位點。 非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(即P2和P3)編碼參與病毒復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白。對SVDV結(jié)構(gòu)蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，病毒的中和性抗原位點在病毒的外殼蛋白上，其中VP3和VPl是誘導(dǎo)中和性抗體產(chǎn)生的主要抗原蛋白。進一步研究證實，VP3和VPl不僅為序列依賴性抗原多肽，而且還具有抗變性作用。有的研究者認為結(jié)構(gòu)蛋白VPl的87、88位殘基為一中和性抗原位點；有的認為VPl的I 40位氨基酸殘基為一中和性抗原位點；還有人認為VPl的95、98位氨基酸殘基為一中和性抗原位點。以上研究成果表明SVDV的抗原中和位點應(yīng)集中在結(jié)構(gòu)蛋白VPl 上。
昆蟲細胞表達系統(tǒng)是外源蛋白表達系統(tǒng)的一種，它以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體、昆蟲細胞為受體的表達系統(tǒng)。與細菌、酵母和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)相比，它具有以下特點安全性高，狀病毒對脊椎動物無感染性；能夠容納較大的外源基因，承載的外源片段可以大到38kb ;高效表達外源基因，與其它真核表達系統(tǒng)相比較，桿狀病毒表達系統(tǒng)最突出的特點就是可以便重組蛋白獲得高水平的表達，最高可使目的蛋白的量達到細胞總蛋白的50% ;具有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)，桿狀病毒表達系統(tǒng)具有對蛋白質(zhì)完整的翻譯后加工能力，包括糖基化、磷酸化、航基化、信號膚切除及膚段的切割和分解等；重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，外源蛋白在細胞內(nèi)可以進行正確折疊、二硫鍵的搭配，表達產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白。
目如最常用的桿狀病毒表達系統(tǒng)是Bac_to_Bac系統(tǒng)，是Luckow等利用曬菌體復(fù)制子構(gòu)建的一種AcMNPV載體(苜猜銀蟻夜蛾多核型多角體病毒，autogra-phacalifornica multiple nuclear polyhedron-sisvirus),是由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的桿狀病毒重組系統(tǒng)，即用外源基因替代多角體蛋白基因而構(gòu)建重組病毒，所用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號是單一或多個桿狀病毒的啟動子，其中最常用的是PPH啟動子和PlO啟動子。轉(zhuǎn)座過程是在大腸桿菌內(nèi)進行的，由供體質(zhì)粒、Bacmid穿梭載體和輔助質(zhì)粒三部分組成。Bacmid穿梭載體含有F因子復(fù)制子(可在大腸桿菌中復(fù)制)、卡那霉素抗性基因及Tn7轉(zhuǎn)座位點attTn7。在供體質(zhì)粒中，外源基因置于桿狀病毒啟動子之下，兩端分別為Tn7的左右端。以其轉(zhuǎn)化含Bacmid的大腸桿菌菌株 DHlOBac,由輔助質(zhì)粒提供反式作用發(fā)生轉(zhuǎn)座，而將外源基因轉(zhuǎn)到Bacmid的attTn7位置。供體質(zhì)粒中的外源基因在轉(zhuǎn)座酶作用下，干擾LacZ的表達，所以含有重組質(zhì)粒(重組Bacmid) 的DHlOBac細菌在有IPTG、Χ-gal的培養(yǎng)板上形成白色菌落。從菌落培養(yǎng)物提取含外源基因的重組Bacmid DNA，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染昆蟲細胞即可獲得重組病毒以進行外源基因的表達。昆蟲細胞系主要包括Sf9，Sf2I和High 5細胞，三種細胞均為規(guī)則的球形，Sf9細胞大小較規(guī)則，需要貼壁生辰，Sf21細胞大小不規(guī)則，需要貼壁生長，而High 5細胞大小不規(guī)則，可以進行懸浮培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)時附著比較松散。Sf9或Sf21因具有較高的轉(zhuǎn)染效率常用來制備重組病毒，也可以用來擴增重組蛋白5細胞轉(zhuǎn)染效率低，但可以利用其懸浮培養(yǎng)特性利用轉(zhuǎn)瓶大量擴增重組蛋白。
目如利用桿狀病毒白表達系統(tǒng)表達外源蛋白，基本上都是細胞內(nèi)表達，表達載體不含有蛋白質(zhì)信號膚分泌信號，使得表達的重組蛋白無法分泌出細胞外，由于細胞自身蛋白含量高、成分復(fù)雜，給蛋白純化帶來困難，也增加了成本，也不利于重組蛋白的純化。
原蜂毒溶血肽(bee promellitin)是蜜蜂毒腺分泌的毒液中的一種主要多肽毒素，由26個氨基酸組成，能與細胞膜結(jié)合改變其通透性，有溶血作用。發(fā)明內(nèi)容
本申請的目的是，提供一種新的適用于豬水泡病病毒VPl蛋白胞外分泌表達的重組質(zhì)粒。
本申請的另一目的是，提供一種上述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
本申請的再一目的是，提供一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達方法。
本申請的再一目的是，提供一種可以用于豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達的試劑盒。
為了實現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術(shù)方案
本申請的一方面公布了一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒含有表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號妝基因序列。
進一步的，本申請的實施方式中，蜂毒信號肽基因序列含有Seq ID No. I所示序列。
進一步的，表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因含有Seq ID No. 2所不序列。
優(yōu)選的,本申請的重組質(zhì)粒以pFastBac I質(zhì)粒為載體。
本申請的另一面公布了一種以pFastBac I質(zhì)粒為載體的豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其中包括，將表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號肽基因序列分別插入到PFastBac I質(zhì)粒的多克隆位點之間。
本申請的實施方式中，表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因插入到pFastBacl質(zhì)粒的EcoR I和HindIII克隆位點之間；蜂毒信號肽基因序列插入到pFastBac I質(zhì)粒的BamHI和EcoR I克隆位點之間。
本申請的再一面公布了一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達方法，包括以下步驟
A.將本申請?zhí)峁┑闹亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DHlOBac中；
B.提取轉(zhuǎn)座有表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號妝基因序列的重組Bacmid質(zhì)粒；
C.以步驟B提取的重組Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞獲得重組病毒；
D.以步驟C獲得的重組病毒感染昆蟲細胞，培養(yǎng)感染的昆蟲細胞，收獲細胞培養(yǎng)物的上清液，其中即含有豬水泡病病毒VPl蛋白。
進一步的，本申請的實施方式中，昆蟲細胞優(yōu)選為sf9昆蟲細胞。
更進一步的，上述步驟C中的轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法。
本申請的再一面公布了一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達試劑盒，該試劑盒含有本申請?zhí)峁┑闹亟M質(zhì)粒，用以對豬水泡病病毒VPl蛋白進行胞外分泌表達。
由于采用以上技術(shù)方案，本申請的有益效果在于
本申請的重組質(zhì)?？梢詫崿F(xiàn)豬水泡病病毒VPl蛋白在昆蟲細胞外的分泌表達，解決了豬水泡病病毒VPl蛋白在胞內(nèi)表達存在的胞內(nèi)蛋白成分復(fù)雜、蛋白純化困難等問題。 本申請?zhí)峁┑闹亟M質(zhì)粒使得豬水泡病病毒VPl蛋白被分泌到培養(yǎng)液中，而培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)相對簡單，利于豬水泡病病毒VPl蛋白的提取純化，不僅提高了蛋白質(zhì)的純化效率，還有效的降低了豬水泡病病毒VPl蛋白的生產(chǎn)成本，為基于豬水泡病病毒VPl蛋白的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。
此外，在本申請?zhí)峁┑闹亟M質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，本申請還提供了豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達的方法，該方法操作簡單，在一般的細胞實驗室均可進行，采用該方法制備豬水泡病病毒VPl蛋白，可直接從細胞培養(yǎng)液中純化豬水泡病病毒VPl蛋白，效率高、成本低。


圖I是本申請實施例中豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖中圓圈結(jié)構(gòu)表示pFastBac I質(zhì)粒載體,頂端引出部分表示由該處插入外源序列。
具體實施方式
本申請的基本構(gòu)思是，針對目前豬水泡病病毒VPl蛋白尚不能胞外分泌表達的問題，構(gòu)建出一個適合用于豬水泡病病毒VPl蛋白胞外分泌表達的重組質(zhì)粒。具體的，本申請?zhí)峁┝艘环N豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒含有表達豬水泡病病毒 VPl蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號肽基因序列。需要說明的是，蜂毒信號肽是蜜蜂毒腺分泌的毒液中的一種主要多肽毒素，本申請發(fā)明人經(jīng)過大量的實驗證實，將蜂毒信號肽基因序列與豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因一起構(gòu)建成重組質(zhì)粒后，在蜂毒信號肽的作用下可以實現(xiàn)豬水泡病病毒VPl蛋白的分泌表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，除了本申請實施方式中具體采用的PFastBac I質(zhì)粒載體以外，其它常規(guī)使用的質(zhì)粒載體也是本申請發(fā)明構(gòu)思下的一種延伸，同樣在本申請的保護范圍內(nèi)。
本申請的實施方式中，具體采用了 Seq ID No. I所示序列的蜂毒信號肽基因序列CN 102978227 A書明說4/7頁用以表達蜂毒信號肽,采用Seq ID No. 2所示序列的基因用以表達豬水泡病病毒VPl蛋白。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，根據(jù)基因的多態(tài)性，只要是能夠表達蜂毒信號肽和豬水泡病病毒VPl蛋白，其基因序列并不僅限于Seq ID No. I所不序列和Seq ID No. 2所不序列，比如序列中的堿基發(fā)生同義突變或發(fā)生不影響蜂毒信號肽、VPl蛋白活性和結(jié)構(gòu)的突變等。
在本申請的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法中提到，以pFastBac I質(zhì)粒為載體，將表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號肽基因序列分別插入到pFastBac I質(zhì)粒的多克隆位點之間。需要說明的是，在選擇克隆位點時，需要考慮外源基因序列本身的克隆位點不與質(zhì)粒載體的克隆位點沖突，即在酶切時不會對外源基因序列造成影響；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，根據(jù)上述分析，除了本申請實施方式中具體選擇的EcoR I和HindIII克隆位點之間插入表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)，BamH I和EcoR I克隆位點之間插入蜂毒信號肽基因序列以外，pFastBac I質(zhì)粒載體上可選用的其它克隆位點也是本申請發(fā)明構(gòu)思下的一種延伸，同樣在本申請的保護范圍內(nèi)。
在本申請的豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達方法中提到使用感受態(tài)大腸桿菌 DHlOBac,該DHlOBac菌是含有穿梭質(zhì)粒Bacmid質(zhì)粒的，以便于將外源基因轉(zhuǎn)座到Bacmid 質(zhì)粒上；而Bacmid質(zhì)粒作為一種穿梭質(zhì)粒，其作用是穿梭于細菌和昆蟲細胞之間，將外源基因引入昆蟲細胞。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除了本申請具體實施方式
中所用的 Bacmid質(zhì)粒、大腸桿菌DHlOBac以外，其它常規(guī)用于昆蟲細胞外源基因表達研究的質(zhì)粒、細菌等也是本申請發(fā)明構(gòu)思下的一種延伸，同樣在本申請的保護范圍內(nèi)。此外，本申請的實施方式中具體采用了脂質(zhì)體法對sf9昆蟲細胞進行轉(zhuǎn)染，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除了本申請使用的昆蟲細胞和轉(zhuǎn)染方法以外，其它常規(guī)用于外源基因表達的昆蟲細胞或轉(zhuǎn)染方法同樣也是本申請發(fā)明構(gòu)思下的一種延伸。
另外，本申請還要求保護一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達試劑盒；需要說明的是，本申請的試劑盒對于豬水泡病病毒VPl蛋白的分泌表達而言是一種全新的試劑盒， 其全新就在于含有本申請?zhí)峁┑呢i水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，只要本申請試劑盒提供了豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒，采用常規(guī)的蛋白質(zhì)分泌表達實驗方法即可得到分泌表達的豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)；當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以參照本申請?zhí)峁┑呢i水泡病病毒VPl蛋白分泌表達方法從市場上購買相應(yīng)的試劑，從而制備分泌表達的豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)。
下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請進一步的說明，不應(yīng)理解為對本申請的限制。
實施例
一、材料與方法
I. I菌株與質(zhì)粒
大腸桿菌(E.coli) DH5 a、DHlOBac (含 Bacmid 和 Helper 兩種質(zhì)粒)、pFastBac I 質(zhì)粒均為Invitrogen公司產(chǎn)品；pMD18_T質(zhì)粒為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；豬水泡病病毒核酸、昆蟲細胞Sf9傳代細胞由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫 技術(shù)中心提供。
I. 2主要試劑
豬水泡病病毒陽性、陰性血清由英國動物衛(wèi)生研究所(IAH)提供；生物素標(biāo)記的6抗豬二抗為Abcom公司產(chǎn)品；SF-900 II培養(yǎng)基和脂質(zhì)體II均為Invitrogen公司產(chǎn)品。
I. 3重組轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建
I. 3. I加入蜂毒信號肽序列的載體構(gòu)建
在蜂毒信號肽基因序列的N端加入BamH I酶切位點序列，在C端加入EcoR I酶切位點序列后進行人工合成，將該人工合成的帶有酶切位點的蜂毒信號肽基因序列克隆至 PMD18-T質(zhì)粒中，提取插入蜂毒信號肽基因的pMD18-T-BMP單克隆質(zhì)粒。用BamH I和EcoR I雙酶切，分別對提取的蜂毒信號肽基因單克隆質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座載體pFastBac I進行酶切處理，分別回收兩端帶酶切位點的蜂毒信號肽基因片段和線性化的PFastBac I。用T連接酶連接回收的蜂毒信號肽基因片段和線性化的pFastBac 1，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac 1-BMP，即含有蜂毒信號肽基因的pFastBac I重組質(zhì)粒。將該含有蜂毒信號肽基因的 pFastBac I重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 α，接種于含氨芐青霉素的營養(yǎng)瓊脂上，37 °C培養(yǎng)24h，挑取單菌落，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。
1.3. 2加入VPl基因序列的載體構(gòu)建
采用上游引物5’ -AGTCGACTGGGCCCCCAGGAGAGGTGATG-3 ’和下游引物5 ’ -AAAGC TTGTGATGGTGATGGTGATGAGTGGTTTTCATGGTTGTTATATC-3’ 擴增豬水泡病病毒核酸中的 VPl 蛋白基因序列，并將該段基因克隆至PMD18-T質(zhì)粒中，提取插入VPl蛋白基因的pMD18-T-VPl 單克隆質(zhì)粒。用EcoR I和Hind III雙酶切，分別對提取的插入VPl蛋白基因的單克隆質(zhì)粒和I. 3. I構(gòu)建好的載體pFastBac I-BMP進行酶切處理，分別回收兩端帶酶切位點的VPl 蛋白基因片段和線性化的pFastBac 1-BMP，用T連接酶將兩者連接，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒 pFastBacl-BMP-VPl，即同時含有蜂毒信號肽基因片段和VPl蛋白基因片段的pFastBac I 重組質(zhì)粒。將pFastBac 1_BMP_VP1轉(zhuǎn)化DH5 α，接種于含氨芐青霉素的營養(yǎng)瓊脂上，37°C培養(yǎng)24h，挑取單菌落，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。
需要說明的是，其中上游引物和下游引物中是帶有EcoR I和HindIII酶切位點的， 且在C端加入了用于重組蛋白純化的六組氨酸和終止密碼子。
I. 4質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)座
將重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac 1_BPM_VPI轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DHlOBac中，涂于含慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的篩選平板上，37°C培養(yǎng)48h，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，并用PUC/M13引物做PCR鑒定，同時進行酶切鑒定，其中pUC/M13引物為市售引物， PCR鑒定也是常規(guī)方法即可。
I. 5重組Bacmid DNA的提取與制備
將上述鑒定為陽性的單個白色菌落接種于含慶大霉素、卡那霉素及四環(huán)素的LB 培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，離心收集菌體，提取重組Bacmid質(zhì)粒DNA，用TE緩沖液溶解質(zhì)粒。
I. 6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞
將8 μ L脂質(zhì)體II加入到100 μ L不含添加劑、抗生素和血清的SF-900 II昆蟲細胞培養(yǎng)液中，室溫放置O. 5h以上。同時取I μ L上述重組Bacmid質(zhì)粒DNA加入到100 μ L不含抗生素和血清的SF-900 II昆蟲細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻。將上述兩種溶液混合，輕輕混勻，并在室溫下孵育15 30min。將約210 μ L的Bacmid-脂質(zhì)體混合物逐滴加入無培養(yǎng)液的Sf9細胞上，27°C培養(yǎng)3 5h，棄含Bacmid-脂質(zhì)體的培養(yǎng)液，加入不含抗生素和血清的SF-900 II昆蟲細胞培養(yǎng)液，27°C繼續(xù)培養(yǎng)，3d后收集含桿狀病毒的培養(yǎng)上清，用其感染正常Sf9細胞，至出現(xiàn)細胞病變后，收集細胞培養(yǎng)液。
I. 7ffestern-blot 檢測
將I. 6中收集的細胞培養(yǎng)液濃縮，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，即SDS-PAGE電泳， 將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用豬水泡病陽性血清作為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗豬IgG作為二抗，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，觀察特異性條帶。
二、結(jié)果
2. IVPl基因的獲得
采用VPl基因上下游引物擴增出含EcoR I和Hind III酶切位點序列及六組氨酸和終止密碼子的VPl基因，并將其克隆至PMD18-T質(zhì)粒中。經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切后，結(jié)果在約870bp處出現(xiàn)一條特異性的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果一致。對其進行了核酸序列測定， 并與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，確定為豬水泡病病毒VPl蛋白的基因。
2. 2重組轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建
將pMD18-T-BMP轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒pFastBac I用BamH I和EcoR I雙酶切后，回收BMP基因片段及線性化的pFastBac 1，用T連接酶連接，構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac 1-BMP，經(jīng)PCR及酶切鑒定正確。然后再將PMD18-T-VP1質(zhì)粒及重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac I-BMP分別用EcoR I和Hind III雙酶切后，回收VPl基因片段及線性化的pFastBac 1-BMP，用T連接酶連接，構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac I-BMP-VPl，經(jīng)PCR及酶切鑒定正確，目的片段包括BMP基因、VPl基因、六組氨酸及終止密碼子，大小為942bp。
2. 3重組Bacmid的篩選與鑒定
將重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac 1_BMP_VP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)菌后，在含有慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的平板上進行藍白菌落篩選，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，用PUC/M13引物做PCR鑒定，結(jié)果擴增產(chǎn)物大小約為3372bp左右，結(jié)果與預(yù)期的一致。
2. 4重組桿狀病毒感染細胞的病變
將重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，同時設(shè)立轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒pFastBacl_CAT陽性對照及正常Sf9細胞對照，72h后觀察細胞病變。顯微鏡下可見病變細胞體積變大，細胞核也增大，似乎要填滿整個細胞。與正常細胞比較，病變細胞生長停滯，有的甚至出現(xiàn)溶解。
2. 5 表達產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析和 Western-blotting 鑒定
分別對培養(yǎng)上清和細胞沉淀進行重組蛋白的鑒定，結(jié)果顯示，表達的重組蛋白在細胞內(nèi)和培養(yǎng)上清液中均有檢測到。收集上述上清液，進行SDS-PAGE電泳，之后進行考馬斯亮藍染色，結(jié)果含VP7重組蛋白的病變細胞樣品在38ku附近有特異性條帶，但表達量較低。Western-blotting結(jié)果顯示,在38ku處出現(xiàn)特異的雜交帶,表明VPl基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達的產(chǎn)物具有抗原性。
在以上研究的基礎(chǔ)上，本例將制備的豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒凍干，以便于制備成試劑盒。凍干的豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒用TE溶液溶解， 米用本例中公開的豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達方法進行豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達，以驗證重組質(zhì)粒凍干制劑的活性。結(jié)果顯示，經(jīng)過凍干處理的豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒效果與新鮮制備的重組質(zhì)粒相當(dāng)，均可有效的用于豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本申請所作的進一步詳細說明，不能認定本申請的具體實施只局限于這些說明。對于本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本申請構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本申請的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒含有表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號肽基因序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述蜂毒信號肽基因序列含有SeqID No. I所示序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因含有Seq ID No. 2所不序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒以PFastBacI質(zhì)粒為載體。
5.—種權(quán)利要求4所述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于所述構(gòu)建方法包括，以PFastBac I質(zhì)粒為載體，將所述表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和所述蜂毒信號肽基因序列分別插入到pFastBac I質(zhì)粒的多克隆位點之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因插入到pFastBac I質(zhì)粒的EcoR I和Hind III克隆位點之間；所述蜂毒信號肽基因序列插入到pFastBac I質(zhì)粒的BamH I和EcoR I克隆位點之間。
7.一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達方法，包括以下步驟 A.將權(quán)利要求1-4任一項所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DHlOBac中； B.提取轉(zhuǎn)座有所述表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和所述蜂毒信號肽基因序列的重組Bacmid質(zhì)粒； C.以步驟B提取的重組Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞獲得重組病毒； D.以步驟C獲得的重組病毒感染昆蟲細胞，培養(yǎng)感染的昆蟲細胞，收獲細胞培養(yǎng)物的上清液，其中即含有豬水泡病病毒VPl蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述昆蟲細胞為sf9昆蟲細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟C中的轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法。
10.一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含權(quán)利要求1-4任一項所述的重組質(zhì)粒，用以對豬水泡病病毒VPl蛋白進行胞外分泌表達。
全文摘要
本申請涉及蛋白質(zhì)表達領(lǐng)域，具體公開了一種豬水泡病病毒VP1蛋白分泌表達重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒含有表達豬水泡病病毒VP1蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號肽基因序列。本申請的重組質(zhì)?？梢詫崿F(xiàn)豬水泡病病毒VP1蛋白在昆蟲細胞外的分泌表達，從而直接從細胞培養(yǎng)液中提取豬水泡病病毒VP1蛋白，有效的提高了蛋白純化效率，降低了豬水泡病病毒VP1蛋白的制備成本，為基于豬水泡病病毒VP1蛋白的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。
文檔編號C07K14/08GK102978227SQ20121046494
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者曹琛福, 李中圣, 楊俊興, 花群義 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心