專利名稱：：檢測(cè)水泡性口炎抗體試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒抗體檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：水泡性口炎是由彈狀病毒科水泡病毒屬的水泡性口炎病毒(VesicularstomatitisVirus,VSV)引起的人畜共患的重大動(dòng)物疫病，目前有印第安納(Indiana,IN型)和新澤西(NewJersey,NJ型)兩個(gè)血清型。牛、豬、馬、羊和其它多種野生動(dòng)物可感染水泡性口炎病毒，人感染該病毒后出現(xiàn)類似流感和登革熱的癥狀。VSV基因組編碼N，NS，M，G，L等5種病毒蛋白，其中N蛋白是該病毒核衣殼的主要蛋白，為VSV的群特異性抗原。由于水泡性口炎的臨床癥狀與口蹄疫(FMD)相似，因此該病的存在和流行直接影響人類及動(dòng)物健康，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，影響社會(huì)穩(wěn)定。1950年證實(shí)此病為人畜共患病。1958年1978年我國(guó)陜西省鳳縣暴發(fā)，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。1995年美國(guó)西南部發(fā)生牛、馬水泡性口炎，波及到6個(gè)州的367個(gè)牧場(chǎng)，造成的損失高達(dá)5000萬(wàn)美元1億美元。1996年，拉美有11個(gè)國(guó)家報(bào)告發(fā)生VS。2004年美國(guó)發(fā)生259起水泡性口炎，涉及的易感動(dòng)物幾萬(wàn)頭/匹/只，有牛、馬、綿羊、山羊和豬等。2006年6月巴拿馬有4個(gè)地區(qū)的水泡性口炎發(fā)病率突然升高，涉及的易感動(dòng)物有19733頭/匹/只。目前，水泡性口炎最常用的診斷方法是病毒分離鑒定、病毒中和試驗(yàn)(VN)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)、液相阻斷ELISA(LP-ELISA)、競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(c-ELISA)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等。然而，上述方法普遍存在試驗(yàn)復(fù)雜、麻煩、不安全、耗時(shí)的問題，不易推廣使用。尤其是VN和CF兩種方法，其需在生物安全三級(jí)(P3)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，且有時(shí)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，其應(yīng)用受到極大限制。..
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對(duì)上述水泡性口炎診斷中存在的試驗(yàn)復(fù)雜、麻煩、不安全、耗時(shí)的問題，提供一種檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒及其制備方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是，提供一種檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒，包括分別放置的試劑i和試劑n，其中所述試劑i為水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板，所述試劑II為單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物，其中所述單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗水泡性口炎病毒病毒的特異性單克隆抗體。在本發(fā)明所述的檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒中，還包括分別放置的陽(yáng)性血清、陰性血清、20倍濃縮洗滌液、IO倍濃縮洗滌液、底物I、底物II、底物m以及終止液。在本發(fā)明所述的檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒中，所述20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05%Tween-20的O.Olmol/LpH7.4PBS/PBST;10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1%明膠的PBST;底物I為pH6.0的乙酸一檸檬酸緩沖液；底物II為3.3'—5.5'—四甲基聯(lián)苯胺溶液；底物III為雙氧水溶液；終止液為lmol/LH2S04硫酸溶液。在本發(fā)明所述的檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒中，各組成部分的體積或數(shù)量如下試劑盒組成部分名稱體積或數(shù)量水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板2板96孔酶標(biāo)板單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物0.5ml陽(yáng)性血清lml陰性血清lml20倍濃縮洗滌液50ml10倍濃縮稀釋液30ml20ml2mllml20ml。Inn液物物物t底底底終、在本發(fā)明所述的檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒中，所述水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板通過以下方法制備將純化后的水泡性口炎病毒抗原用優(yōu)化好的包被緩沖液稀釋成4.0pg/mL，以50|117孔加入酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板，置4'C冰箱中過夜包被后拍干酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板；然后以200pL/孔加入優(yōu)化好的封閉液，置4X:冰箱中封閉過夜后徹底拍干。在本發(fā)明所述的檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒中，所述水泡性口炎病毒抗原通過以下方法制備BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種水泡性口炎病毒并使用無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，在細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次后以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清液，加入終濃度為1/3000的甲醛滅活病毒，采用20%、60%的不連續(xù)蔗糖密度梯度20000轉(zhuǎn)/分鐘4"C超速離心3小時(shí)，收獲提純的病毒條帶作為抗原。本發(fā)明還提供一種如上所述的試劑盒的制備方法，包括(1)使用水泡性口炎病毒制備水泡性口炎病毒抗原；(2)使用提純的水泡性口炎病毒抗原免疫小鼠并取免疫小鼠的脾細(xì)胞，將所述脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在融合劑下融合后篩選獲得雜交瘤細(xì)胞，將所述雜交瘤細(xì)胞注入小鼠制備抗水泡性口炎病毒單克隆抗體腹水；(3)使用抗水泡性口炎病毒單克隆抗體腹水制備抗水泡性口炎病毒單克隆抗體辣根過氧化酶酶結(jié)合物；(4)制備水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板將純化后的水泡性口炎病毒抗原用優(yōu)化好的包被緩沖液稀釋成4.0pg/mL后加入酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板，置冰箱中過夜包被后拍干酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板；然后在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板的孔內(nèi)加入優(yōu)化好的封閉液，置冰箱中封閉過夜后徹底拍干。在本發(fā)明所述的試劑盒的制備方法中，所述步驟(1)中的水泡性口炎病毒抗原通過以下方法制備BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種水泡性口炎病毒并使用無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，在細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次后以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清液，加入終濃度為1/3000的甲醛滅活病毒，采用20%、60%的不連續(xù)蔗糖密度梯度20000轉(zhuǎn)/分鐘4"C超速離心3小時(shí)，收獲提純的病毒條帶作為抗原。在本發(fā)明所述的試劑盒的制備方法中，還包括陽(yáng)性血清、陰性血清、20倍濃縮洗滌液、10倍濃縮洗滌液、底物I、底物II、底物III以及終止液，并將所述陽(yáng)性血清、陰性血清、20倍濃縮洗滌液、IO倍濃縮洗滌液、底物I、底物n、底物m以及終止液與水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板、單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物分開放置。在本發(fā)明所述的試劑盒的制備方法中，所述20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05%Tween-20的0.01mol/LpH7.4PBS/PBST;10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1。/。明膠的PBST;底物I為pH6.0的乙酸一擰檬酸緩沖液；底物II為3.3，一5.5'—四甲基聯(lián)苯胺溶液；底物III為雙氧水溶液；終止液為lmo1/LH2S04硫酸溶液。本發(fā)明的檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)血清中抗水泡性口炎抗體，可用于水泡性口炎的快速診斷、檢測(cè)、檢疫和流行病學(xué)調(diào)查。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒，該試劑盒包括分別放置的試劑I和試劑II，其中試劑I為水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板，試劑II為單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物，其中所述單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗水泡性口炎病毒病毒的特異性單克隆抗體。此外，在上述試劑盒中，還可包括分別放置的陽(yáng)性血清、陰性血清、20倍濃縮洗滌液、10倍濃縮洗滌液、底物I、底物II、底物III以及終止液。其中20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05%Tween-20的0.01mol/LpH7.4PBS/PBST;10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1%明膠的PBST;底物I為pH6.0的乙酸一檸檬酸緩沖液；底物II為3.3，_5.5，一四甲基聯(lián)苯胺溶液；底物m為雙氧水溶液；終止液為lmol/LH2S04硫酸溶液。為了便于使用，上述試劑盒的各組成部分的體積或數(shù)量如下試劑盒組成部分名稱體帛或數(shù)量水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板2板96孔酶標(biāo)板單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物0.5ml陽(yáng)性血清lml陰性血清lml20倍濃縮洗滌液50ml.10倍濃縮稀釋液30mlI20mlII2mlIIIlml液20ml上述試劑盒中的水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板通過以下方法制備將純化后的水泡性口炎病毒抗原用優(yōu)化好的包被緩沖液稀釋成4.0|Jg/mL，以50pL/孔加入酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板，置4'C冰箱中過夜包被后拍干酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板；然后以200)LiL/孔加入優(yōu)化好的封閉液，置4'C冰箱中封閉過夜后徹底拍干。其中水泡性口炎病毒抗原通過以下方法制備BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種水泡性口炎病毒并使用無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，在細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次后以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清液，加入終濃度為1/3000的甲醛滅活病毒，采用20%、60%的不連續(xù)蔗糖密度梯度20000轉(zhuǎn)/分鐘4'C超速離心3小時(shí)，收獲提純的病毒條帶作為抗原。以下提供制備上述試劑盒的具體實(shí)例(當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可在以下方法的啟發(fā)下，通過其他方法制備包含上述組成部分的試劑盒)1、制備水泡性口炎病毒抗體ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))包被抗原在BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種水泡性口炎病毒，37。C反應(yīng)1小時(shí)后加入無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，34天后細(xì)胞病變(CPE)達(dá)75%以上時(shí)，收獲病毒。將收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清液，加入終濃度為1/3000的甲醛滅活病毒。以28000轉(zhuǎn)/分鐘4'C超速離心3小時(shí)。沉淀用1/100原體積的PBS溶解，然后采用20%、60%(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度20000轉(zhuǎn)/分鐘4t超速離心3小時(shí)，收獲提純的病毒條帶作為抗i底繊終原，用DU800核酸蛋白分析儀測(cè)定蛋白含量，-2ox:保存?zhèn)溆??！?、檢定水泡性口炎病毒ELISA包被抗原安全性將純化的病毒抗原用維持液作適當(dāng)稀釋(1:101:100)接種到已長(zhǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞上，同時(shí)作正常細(xì)胞對(duì)照。37'C培養(yǎng)6天，接種細(xì)胞與正常細(xì)胞相同，無(wú)CPE出現(xiàn)；取培養(yǎng)液上清(包括正常細(xì)胞培養(yǎng)液上清)包被酶標(biāo)板，用陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，病毒培養(yǎng)液和正常細(xì)胞培養(yǎng)液顯色情況一致，均為無(wú)色，表明作為包被抗原用的病毒已滅活徹底，不具感染性，ELISA包被抗原是安全的。3、制備抗水泡性口炎病毒單克隆抗體首先進(jìn)行水泡性口炎病毒的培養(yǎng)和純化，即用水泡性口炎病毒接種BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層，收獲的細(xì)胞培養(yǎng)病毒液反復(fù)凍融3次，以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清液并經(jīng)超速離心和不連續(xù)蔗糖密度梯度離心，收獲提純的病毒條帶，用核酸蛋白分析儀測(cè)定蛋白含量為2.63g/L，-20^保存?zhèn)溆?；用提純的水泡性口炎病毒抗原分別加等體積弗氏完全佐劑(FCA)乳化和弗氏不完全佐劑(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠(巴比賽小鼠)三次；取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在50%聚乙二醇(MW4000)融合劑下融合，HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，用間接ELISA方法檢測(cè)分泌抗VSV的陽(yáng)性孔；用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，經(jīng)間接ELISA篩選陽(yáng)性克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗VSV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；將獲得的分泌抗VSV的特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞注射入BALB/c小鼠腹腔制備單克隆抗體腹水。該方法制備的單克隆抗體腹水，其ELISA效價(jià)高達(dá)為1:1024000，用核酸蛋白分析儀測(cè)定純化腹水IgG的含量為2.13g/L。親和力分常數(shù)高達(dá)8.57xl07mol/L。用間接ELISA方法鑒定制備的單克隆抗體僅與水泡性口炎病毒抗原有特異性免疫反應(yīng)，而與其它相關(guān)病毒(如FMDV、SVDV、BTV、EHDV、AKV、PPRV、BVDV等)沒有任何免疫反應(yīng)。4、制備與鑒定抗水泡性口炎病毒單克隆抗體辣根過氧化酶(HRP)酶結(jié)合物將抗水泡性口炎病毒BALB/c小鼠腹水McAb分別經(jīng)1次50%和2次33%飽和硫酸銨沉淀提純，透析除鹽；用改良過的過碘酸氧化法將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記于單克隆抗體。標(biāo)記程序如下將5mgHRP溶于0.5mL0.1mol/LNaHC03溶液中；力B0.5mL10mmol/LNaI04溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時(shí)。力Q0.75mLO.lmol/LNa2C03混勻。加入0.75mL純化單抗(15mg/mL)，混勻。稱取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口墊玻璃棉的5mL注射器外筒內(nèi)；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套，蓋緊，4"C過夜。用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20體積的新鮮配制的5mg/mLNaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘；再加入3/20體積的NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(shí)(或4。C過夜)。將交聯(lián)物過SephadexG200或Sepharose6B(2.6x50cm)層析純化，分管收集第一峰。測(cè)定克分子比值和標(biāo)記率，鑒定酶結(jié)合物質(zhì)量，用ELISA法測(cè)定酶活性和抗體活性。HRP抗體酶結(jié)合物的保存時(shí)，加入等量甘油(或1。/。BSA和50X甘油)后，小量分裝-2(TC存放。5、制備陽(yáng)性血清挑選體格健壯的18個(gè)月以上的山羊23只，將純化后VSV與等體積弗氏完全佐劑(FCA)乳化，充分混勻后經(jīng)背部皮下注射，2mL/只；首免后第2周和第4周分別用VSV相同劑量加等體積弗氏不完全佐劑(FIA)進(jìn)行二免和三免；待山羊血清中抗水泡性口炎抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)效價(jià)達(dá)1:500以上，無(wú)菌采血分離血清，離心或過濾除去沉淀，進(jìn)行56。C加熱30分鐘滅活，用血清保存液配方I按1:2稀釋'(能用正常的山羊血清稀釋更好，因其成份更接近于檢測(cè)標(biāo)本)，抽濾除菌，lmL/管分裝，貼上標(biāo)簽，-80C保存。不可反復(fù)凍融，解凍后只能在4"C保存一周。6、陰性血清的制備選擇體格健壯的18個(gè)月以上的山羊，采血用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SNT1166.2-2002《水泡性口炎微量血清中和試驗(yàn)操作規(guī)程》檢測(cè)方法確認(rèn)血清中是否有赤羽病的抗體，證實(shí)無(wú)水泡性口炎抗體的山羊，無(wú)菌采血分離血清。用血清保存液配方I按1:2稀釋，lmL/管分裝，貼上標(biāo)簽，-80'C保存。7、包被緩沖液的優(yōu)化包被抗原時(shí)，為了得到最佳的包被效果，采用了碳酸鹽緩沖液(0.05mol/LpH9.6)、磷酸鹽緩沖液(0.05mol/LpH7.6)和Tris鹽酸緩沖液(0.05mol/LpH7.6)三種緩沖液作為包被液，抗原包被濃度為5pg/ml和2.5iig/ml，酶標(biāo)抗體工作濃度為1:1000及1:500，用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析，選擇最佳的包被緩沖液系統(tǒng)。同時(shí)為了保證緩沖液能夠長(zhǎng)期保存，在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作為防腐劑。結(jié)果獲得以下最佳的包被液的配方0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液(NaHC031.465g、Na2C030.795g或Na2CO3.10H2O1.2g、水500mL)中含0.01%的硫柳汞、lpg/ml兩性霉素B、谷氨酸鈉1%、1%BSA、30pg/mL蛋白酶抑制劑(胰凝乳蛋白酶)等，溶解后過濾除菌，置于4t:冰箱，一周內(nèi)使用。8、最適抗原包被濃度的優(yōu)化抗原純化后要準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，用優(yōu)化好的上述包被緩沖液，將包被抗原稀釋成0.1lJg/mL，1.0|Jg/mL，2.0|Jg/mL，4.0|Jg/mL，6.0fJg/mL，8.0|Jg/mL，10.0|Jg/mL等6個(gè)濃度，包被ELISA板，每孔100iJL，進(jìn)行ELISA測(cè)定。經(jīng)孵育、顯色、終止后，用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析。顯色的強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與包被的抗原量成正比，但隨著包被抗原濃度的增加，顯色的強(qiáng)度反而降低，選擇濃度最低而OD值最大的包被抗原量作為最適抗原包被濃度(測(cè)得蛋白質(zhì)的最適包被濃度為2.0|Jg/mL4jJg/mL)。9、酶標(biāo)抗體稀釋度的優(yōu)化抗原包被濃度為4pg/mL，將酶標(biāo)抗體做系列稀釋1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，經(jīng)孵育、洗滌后、顯色終止后，用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析，選擇OD值為11.5左右的酶標(biāo)抗體稀釋度為最適工作濃度。結(jié)果表明，將酶標(biāo)抗體做l:1000稀釋時(shí)，OD值為l1.5左右。10、抗原抗體反應(yīng)時(shí)間和McAb競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化以反應(yīng)時(shí)間短、效果最好、背景值最低為原則，反應(yīng)時(shí)間采用20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、60分鐘等8個(gè)點(diǎn)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，抗原抗體反應(yīng)時(shí)間為45分鐘、McAb競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為40分鐘時(shí)，效果最好，背景值低。11、底物作用時(shí)間的優(yōu)化在其它條件相同的情況下，采用5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘等7個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較，獲得15分鐘為最佳的底物作用時(shí)間。12、20倍濃縮洗滌液、IO倍濃縮稀釋液、底物液、終止液的優(yōu)選本發(fā)明通過試驗(yàn)，選定如下最佳的洗滌液、稀釋液、底物液配方。20倍濃縮洗滌液配方NaCL160g，KH2P044g，Na2HP04.12H2058g，KCL4g，Tween-2010mL，蒸餾水1000mL，充分溶解，另加0.01%的硫柳汞作防腐劑，過濾除菌后分裝,。用時(shí)作20倍稀釋。IO倍濃縮稀釋液配方NaCL80g，KH2P042g，Na2HP04.12H2029g，KCL2g，Tween-205mL，明膠100g，蒸餾水1000mL，充分溶解，另加0.01%的硫柳汞作防腐劑，過濾除菌后分裝。用時(shí)作10倍稀釋。底物液的優(yōu)選底物液I配方乙酸一檸檬酸緩沖液(pH6.0):乙酸鈉(A液)——乙酸鈉1.64g、水200mL，溶解后置于4。C冰箱備用；檸檬酸(B液)——檸檬酸2.1g、水100mL，溶解后置于4'C冰箱備用。配制取B液約2mL至A液中調(diào)pH值至6.0，置于4。C冰箱備用。另加0.01%的硫柳汞作防腐劑，過濾除菌分裝。底物液II配方TMB溶液TMB350mg、甲醇100mL，加溫溶解后保存于不透光的棕色瓶中，保存于室溫或在2。C7'C保存。底物液III配方每個(gè)ELISA試劑盒配一管0.5mL的30%11202，臨用時(shí)再按每10ml底物液10)iL。工作底物液配制臨用前配制。取底物液I(37。C)9.7mL、底物液II300pL、底物液m10pL混合。終止液的優(yōu)選采用lmol/LH2S04、1.5%NaF、0.1%疊氮鈉和1%十二烷基硫酸鈉(SDS)作為終止液，進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)果以lmol/LH2S04的終止效果最好。13、封閉液和封閉方法的優(yōu)選本發(fā)明通過試驗(yàn)，選定0.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)中含1%牛血清白蛋白(BSA)、2%明膠、0.01%硫柳汞、兩性霉素B(lpg/ml)、慶大霉素(20ng/ml)，過濾除菌。進(jìn)行4"C冰箱中封閉過夜與37'C2小時(shí)封閉效果比對(duì)試驗(yàn)，封閉和不封閉比對(duì)試驗(yàn)，封閉后洗板和封閉后不洗板比對(duì)試驗(yàn)。結(jié)果4"C冰箱中封閉過夜、封閉后不洗板的方法獲得了最佳的試驗(yàn)結(jié)果。14、血清、抗體、單克隆抗體保存液的優(yōu)選配方I:0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中含0.01%的硫柳汞、兩性霉素B(l|ag/ml)、20pg/ml慶大霉素、谷氨酸鈉1%、1%BSA、1%乳糖(或山梨醇甘油)、含蛋白酶抑制劑(如胰凝乳蛋白酶30pg/mL)，過濾除菌。配方II:將對(duì)乙酰氨基酚1.5g，聚乙二醇(MW20000)10g，小牛血清2g，吐溫(Tween)—20lmL，硫柳汞0.2g和0.02mol/L、pH7.2的鹽酸緩沖鹽水1000mL配制而成，過濾除菌。結(jié)果以配方I作為保存液的保存效果最好。l15、包被ELISA板制備、保存以及保存期限的測(cè)定選擇進(jìn)口優(yōu)質(zhì)的可拆96孔ELISA板，將純化后的VSV抗原，用優(yōu)化好的上述包被緩沖液稀釋成4.0pg/mL，以50iiL/孔加入ELISA板，置4"C冰箱中過夜包被，拍干ELISA板；以200pL/孔加入優(yōu)化好的封閉液，置4'C冰箱中封閉過夜；徹底拍干ELISA板。將已包被好的ELISA板置于鋁簿或簿錫紙中，內(nèi)置2g硅膠干燥劑，封口，置4"C保存，定期用ELISA測(cè)定效果，以測(cè)定保存期。結(jié)果表明，包被ELISA板4"C下保存至8個(gè)月，與新包被的ELISA板檢測(cè)效果完全一致。16、試劑盒的組裝將按上述方法制備好的水泡性口炎病毒抗原包被的ELISA板(封閉于鋁簿/簿錫紙中，內(nèi)置2g硅膠干燥劑，封口)、單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物、IO倍濃縮稀釋液、20倍濃縮洗滌液、底物液I、底物液n、底物液in、終止液、陽(yáng)性血清、陰性血清定量分裝，分別貼上標(biāo)簽與說明。l份詳細(xì)的試劑盒使用操作說明書。裝入專用的試劑盒外殼內(nèi)，外殼上貼上試劑盒標(biāo)簽。18、試劑盒中各種試液的配制與分裝試劑盒中試液的配制分裝表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>使用上述試劑盒進(jìn)行檢測(cè)操作的程序如下(1)、將試劑盒中的VSV抗原包被ELISA板、20倍濃縮洗滌液、10倍濃縮稀釋液、底物液、終止液取出，放置室溫至少30分鐘。(2)、用雙蒸水配制稀釋液、洗滌液。如工作稀釋液10mLIO倍稀釋液十90mL雙蒸水，工作洗滌液25mL20倍洗滌液+475mL雙蒸水。(3)、配制1:10的陽(yáng)性、陰性對(duì)照血清和所有被檢血清，如方法lO)iiL血清+90pL稀釋液，混勻。(4)、單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物的稀釋(均按1:1000稀釋)，如方法20jiL單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物+20mL稀釋液，混勻。(5)、加樣■^在水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板上設(shè)立稀釋液空白對(duì)照、陰性血清對(duì)照、陽(yáng)性血清對(duì)照(每份做兩孔)?！糠荼粰z血清樣品做兩孔?！?00)iiL稀釋液入空白對(duì)照孔，取50^iL陰性、陽(yáng)性血清入相應(yīng)的對(duì)照孔，取50ioL被檢血清樣品入相鄰橫行孔內(nèi)，37。C濕盒感作45分鐘?！靠准?0pL單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物(空白對(duì)照孔不加)，輕輕混勻。(6)、將水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板置37'C濕盒感作40分鐘。(7)、配制底物液取出9.7mL底物液I于棕色瓶中，分別加入底物液II300(^L和底物液in7|iL，充分混勻。(8)、先用洗滌液洗水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板孔4次，每次2分鐘。(9)、加底物液所有板孔加100)LlL底物液，水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板置濕盒暗盒15分鐘。(10)、加終止液加入50pL/孔終止液。(11)、用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm下測(cè)定光密度值(OD值)，按下式計(jì)算抑制百分率(PI)。射/^"為、舉f尸"=〃。。---Jx，厲^j&清"f坊朋值(12)、試劑盒陽(yáng)性判定值的確定按照上述試劑盒的檢測(cè)程序，采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SNT1166.2-2002《水泡性口炎微量血清中和試驗(yàn)操作規(guī)程》檢測(cè)方法確認(rèn)的30份陰性血清和30份陽(yáng)性血清，進(jìn)行c-ELISA試驗(yàn)后，結(jié)果所有陰性血清的百分抑制率250%，所有陽(yáng)性血清的百分抑制率<50%。因此，獲得c-ELISA陽(yáng)性判定值(cut-offvalue)為PI^50%被檢血清VSV抗體陽(yáng)性；PI<50%被檢血清VSV抗體陰性。試劑盒的臨床樣品檢測(cè)與應(yīng)用以及試劑盒敏感性、特異性的評(píng)價(jià)按照上述試劑盒的檢測(cè)程序，用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SNT1166.2-2002《水泡性口炎微量血清中和試驗(yàn)操作規(guī)程》檢測(cè)方法確認(rèn)的30份陰性血清和30份陽(yáng)性血清，進(jìn)行c-ELISA試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)獲得試劑盒的特異性為93%(陰性結(jié)果數(shù)/陰性樣品總數(shù)=28/30)，敏感性為90%(陽(yáng)性結(jié)果數(shù)/陽(yáng)性樣品總數(shù)=27/30)，本試劑盒的特異性、敏感性為良好。上述具體實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的水泡性口炎病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(c-ELISA)試劑盒特異性強(qiáng)，敏感性高，適用于水泡性口炎的快速診斷、檢測(cè)、檢疫和流行病學(xué)調(diào)査。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。1權(quán)利要求1、一種檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，包括分別放置的試劑I和試劑II，其中所述試劑I為水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板，所述試劑II為單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物，其中所述單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗水泡性口炎病毒的特異性單克隆抗體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，還包括分別放置的陽(yáng)性血清、陰性血清、20倍濃縮洗滌液、IO倍濃縮洗滌液、底物I、底物n、底物III以及終止液。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，所述20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05%Tween-20的O.Olmol/LpH7.4PBS/PBST;10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1%明膠的PBST;底物I為pH6.0的乙酸一擰檬酸緩沖液；底物II為3.3，一5.5'—四甲基聯(lián)苯胺溶液；底物III為雙氧水溶液；終止液為lmol/LH2S04硫酸溶液。4、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，各組成部分的體積或數(shù)量如下試劑盒組成部分名稱體積或數(shù)量水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板2板96孔酶標(biāo)板單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物0.5ml陽(yáng)性血清lml陰性血清lml20倍濃縮洗滌液50ml10倍濃縮稀釋液30ml20ml2mllml20ml。5、根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，所述水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板通過以下Inn"1儀_-_I-、"底底底終方法制備將純化后的水泡性口炎病毒抗原用優(yōu)化好的包被緩沖液稀釋成4.0|jg/mL，以50pL/孔加入酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板，置4"C冰箱中過夜包被后拍千酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板；然后以200pL/孔加入優(yōu)化好的封閉液，置4"C冰箱中封閉過夜后徹底拍干。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，所述水泡性口炎病毒抗原通過以下方法制備BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種水泡性口炎病毒并使用無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，在細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次后以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清液，加入終濃度為1/3000的甲醛滅活病毒，采用20%、60%的不連續(xù)蔗糖密度梯度20000轉(zhuǎn)/分鐘fC超速離心3小時(shí)，收獲提純的病毒條帶作為抗原。7、一種如權(quán)利要求1所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括(1)使用水泡性口炎病毒制備水泡性口炎病毒抗原；(2)使用提純的水泡性口炎病毒抗原免疫小鼠并取免疫小鼠的脾細(xì)胞，將所述脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在融合劑下融合后篩選獲得雜交瘤細(xì)胞，將所述雜交瘤細(xì)胞注入小鼠制備抗水泡性口炎病毒單克隆抗體腹水；(3)使用抗水泡性口炎病毒單克隆抗體腹水制備抗水泡性口炎病毒單克隆抗體辣根過氧化酶酶結(jié)合物；(4)制備水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板將純化后的水泡性口炎病毒抗原用優(yōu)化好的包被緩沖液稀釋成4.0|Jg/mL后加入酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板，置冰箱中過夜包被后拍干酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板；然后在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板的孔內(nèi)加入優(yōu)化好的封閉液，置冰箱中封閉過夜后徹底拍干。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的水泡性口炎病毒抗原通過以下方法制備BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種水泡性口炎病毒并使用無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，在細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次后以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清液，加入終濃度為1/3000的甲醛滅活病毒，采用20%、60%的不連續(xù)蔗糖密度梯度20000轉(zhuǎn)/分鐘4"C超速離心3小時(shí)，收獲提純的病毒條帶作為抗原。9、根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，還包括陽(yáng)性血清、陰性血清、20倍濃縮洗滌液、io倍濃縮洗漆液、底物i、底物n、底物ni以及終止液，并將所述陽(yáng)性血清、陰性血清、2o倍濃縮洗滌液、io倍濃縮洗滌液、底物i、底物n、底物m以及終止液與水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板、單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物分開放置。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05%Tween-20的0.01mol/LpH7.4PBS/PBST;10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1%明膠的PBST;底物I為pH6.0的乙酸一檸檬酸緩沖液；底物II為3.3'—5.5'—四甲基聯(lián)苯胺溶液；底物III為雙氧水溶液；終止液為lmol/LH2S04硫酸溶液。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體試劑盒，包括分別放置的試劑I和試劑II，其中所述試劑I為水泡性口炎病毒抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定板，所述試劑II為單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物，其中所述單克隆抗體IgG-HRP酶結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗水泡性口炎病毒的特異性單克隆抗體。本發(fā)明還提供一種上述試劑盒的制備方法。本發(fā)明的試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)血清中抗水泡性口炎抗體，可用于水泡性口炎的快速診斷、檢測(cè)、檢疫和流行病學(xué)調(diào)查。文檔編號(hào)G01N33/577GK101625363SQ200910109418公開日2010年1月13日申請(qǐng)日期2009年8月17日優(yōu)先權(quán)日2009年8月17日發(fā)明者張彩虹,曹琛福,曾少靈,楊俊興,林慶燕,秦智鋒,花群義,阮周曦,陳書琨,虹陶申請(qǐng)人:花群義