專利名稱：體外檢測精子-卵母細(xì)胞相互作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外檢測精子-卵母細(xì)胞相互作用的方法，更具體 地，涉及體外聯(lián)合檢測精子-卯母細(xì)胞相互作用的方法。
背景技術(shù)：
哺乳動物的精子必須具備良好的生理功能才能完成受精過程。受 精是一個復(fù)雜的過程，需要經(jīng)歷精子與卵細(xì)胞透明帶結(jié)合、透明帶誘 發(fā)頂體反應(yīng)和精子穿過透明帶并與卯黃膜結(jié)合等過程才能完成，任何 一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均可導(dǎo)致受精失敗。可通過精子-卵母細(xì)胞相互作 用試驗(yàn)對這些過程進(jìn)行體外評估，從而尋找不孕不育的病因，并為輔 助生殖助孕方式的選擇提供直接的科學(xué)依據(jù)。
精子-卵母細(xì)胞相互作用試驗(yàn)包括精子-透明帶結(jié)合試驗(yàn)、透明帶
誘發(fā)精子頂體反應(yīng)試驗(yàn)和精子-透明帶穿透試驗(yàn)，通常需要分成三個 不同檢測項(xiàng)目分別進(jìn)行檢測，需要消耗4吏多標(biāo)本資源，檢測成本高， 檢測時間長且檢測效率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于減少標(biāo)本資源的消耗，降低檢測成 本，降低檢測時間并提高檢測效率。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種體外檢測精子-卵母細(xì)
胞相互作用的方法，所述方法包括如下步驟a.上泳法或密度梯度法 提取精子；b.在培養(yǎng)液中按一定比例混合經(jīng)步驟a提取后的精子與卵 母細(xì)胞，另設(shè)立卵母細(xì)胞空白對照，并均置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)；c.去除 步驟b中未與卵母細(xì)胞表面結(jié)合的精子，倒置相差顯微鏡下檢測與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子數(shù)量；d.使步驟c中與卯母細(xì)胞透明帶結(jié)合 的精子和卵母細(xì)胞分離，分別收集分離后的精子和卵母細(xì)胞；e.將卵 母細(xì)胞空白對照精子、經(jīng)步驟d分離后的精子涂于載玻片上，干燥， 固定液固定，洗滌，加入熒光素-凝集素標(biāo)記物，反應(yīng)后再次洗滌， 熒光顯微鏡下檢測精子頂體反應(yīng)率；f.倒置相差顯微鏡下檢測經(jīng)步驟 d分離的卵母細(xì)胞胞內(nèi)已穿透進(jìn)入其中的精子數(shù)量。
其中所述步驟c中通過以下方法去除步驟b中未與卵母細(xì)胞表面 結(jié)合的精子將反應(yīng)后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另 一盛有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng) 皿中，反復(fù)吹打卵母細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移精子-卵母細(xì)胞結(jié)合物至另一盛 有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。
其中所述步驟d中通過以下方法使步驟c中與卵母細(xì)胞透明帶結(jié) 合的精子和卵母細(xì)胞分離將精子-卵母細(xì)胞結(jié)合物移入微滴中，反 復(fù)吹打卵母細(xì)胞，然后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一盛有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng) 皿中。
其中所述培養(yǎng)液的NaCl重量含量為0.28-1.11%、 KC1重量含量 為0.02-0.07°/。、 CaCl2'2H20重量含量為0.01-0.05°/。、 1012 04重量含 量為0.01-0.03%、 MgS04.7H20重量含量為0.01-0.06%、酚紅重量含 量為0.0005-0.003%。、 NaHC03重量含量為0.10-0.42%、葡萄糖重量 含量為0.05-0.20%、焦丙酮酸鈉重量含量為0.015-0.060%。、 BSA重量 含量為0.17-0.70%、青霉素的含量為10000-20000單位％、硫酸鏈霉 素重量含量為0.05-0.50%。和乳酸鈉糖漿(600 g/L)體積含量為 0.18-0.74%,余量為蒸餾水。
其中所述步驟b中的卵母細(xì)胞可以是新鮮卵母細(xì)胞或者是保存
在卵細(xì)胞保存液中的卵母細(xì)胞，其中所述卵細(xì)胞保存液的(NH4)2S04
重量含量為6.6-26.4%和Tris重量含量為0.12-0.48%,余量為蒸餾水， 其pH值為7.0-7.8。
其中可在步驟e中焚光顯微鏡下計數(shù)精子頂體反應(yīng)率之前加入熒 光封固液，所述熒光封固液是含對苯二胺的磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.5-9.0。
其中所述步驟e中固定液是多聚曱醛、丙酮和曱醇的混合液。
其中所述步驟e中洗滌所使用的洗滌液是含Tween-20的磷酸鹽 緩沖液，其pH值為7.2-7.6。
其中所述步驟e中熒光素-凝集素標(biāo)記物中的熒光素為異硫氰酸 熒光素(FITC)或四曱基異硫氰酸若丹明(TRITC),凝集素為刀豆蛋白 A、豌豆凝集素或花生凝集素。
本發(fā)明的有益效果在于實(shí)現(xiàn)了精子-透明帶結(jié)合試驗(yàn)、透明帶誘 發(fā)精子頂體反應(yīng)和精子-透明帶穿透試驗(yàn)三個項(xiàng)目的聯(lián)合檢測，并由 此減少了精子標(biāo)本的消耗，尤其是減少了來源困難的卵母細(xì)胞的消 耗，較大程度地節(jié)約了標(biāo)本資源；減少了操作環(huán)節(jié)，較大程度地降低 了檢測成本；減少了操作步驟，降低了操作時間，大大提高了檢測效 率；同時所述4全測方法具有較高的準(zhǔn)確性，有利于臨床常規(guī)應(yīng)用與推 廣。
具體實(shí)施例方式
下文對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。 一樣本
精子來源于新鮮液化精液，也可采用液氮超低溫保存的解凍精子。
卵母細(xì)胞為新鮮卵母細(xì)胞或以卵細(xì)胞保存液2-8。C5fc存的卵母細(xì) 胞。臨用前用培養(yǎng)液洗滌以卵細(xì)胞保存液貯存的卵母細(xì)胞3次。
二試劑 1.培養(yǎng)液
培養(yǎng)液用于提取高活力精子，洗滌活體配子，并為精子和卵母細(xì) 胞提供能量和適宜的反應(yīng)條件。
6本發(fā)明培養(yǎng)液的NaCl重量含量為0.28-1.11%、 KC1重量含量為 0.02-0.07%、 CaCl2'2H20重量含量為0.01-0.05%、 KH2P04重量含量 為0.01-0.03%、 MgSO小7H20重量含量為0.01-0.06%、酚紅重量含量 為0.0005_0.003%。、 NaHC03重量含量為0.10-0.420/。、葡萄糖重量含 量為0.05-0.20%、焦丙酮酸鈉重量含量為0.015-0.060%。、 BSA重量含 量為0.17-0.70%、青霉素的含量為10000-20000單位％、硫酸鏈霉素 重量含量為0.05-0.50%。和乳酸鈉糖漿(600 g/L)體積含量為 0.18-0.74%,余量為蒸餾水。
如下配制本發(fā)明培養(yǎng)液稱取NaCl 2.77-11.08 g、KCl 0.17-0.70 g、 CaCl2.2H20 0.12-0.50 g、 KH2P04 0.08-0.32 g、 MgS04.7H20 0.14-0.58 g、酚紅0.5-3 mg置燒杯中，加蒸餾水至1000ml，攪拌溶解備用；稱 取NaHC03 0.10-0.42 g、葡萄糖0.05-0.20 g、焦丙酮酸鈉1.5-6.0 mg、 BSA 0.17-0.70 g、青霉素10000-20000單位和硫酸鏈霉素5-50 mg,向 其加入乳酸鈉糖漿(600 g/L) 0.18-0.74 ml和上述步驟配制好的溶液 100 ml,攪拌溶解即可。
優(yōu)選每1000 ml本發(fā)明培養(yǎng)液包含NaCl 5.54 g、 KC1 0.35 g、 CaCl2.2H20 0.25g、 KH2PO40.16g、 MgS04.7H20 0.29 g、酚紅1 mg、 NaHC032.1 g、葡萄糖1.0g、焦丙酮酸鈉30mg、 BSA 3.5 g、青霉素 100000單位、疏酸鏈霉素100 mg和乳酸鈉糖漿(600 g/L) 3.7 mL。
所述培養(yǎng)液還可用其他培養(yǎng)液^替，例如HTF、 F10和Earle培
養(yǎng)液等。
2.卵細(xì)胞保存液
卯細(xì)胞保存液用于在2-8。C條件下保持卵母細(xì)胞的功能穩(wěn)定性。 本發(fā)明卵細(xì)胞保存液為pH 7.4的三羥甲基氨基曱烷(Tris)緩沖
液。所述卵細(xì)胞保存液的(NH4)2S04重量含量為6.6-26.4%和Tris重量
含量為0.12-0.48%，余量為蒸餾水。
如下配制本發(fā)明卵細(xì)胞保存液稱取(NH4)2S04 66.0-264.2 g和
Tris 1.2-4.8g置燒杯中，加蒸餾水至900 ml,攪拌溶解；調(diào)pH調(diào)至7.0-7.8,加蒸餾水至1000ml， 4。C保存。
優(yōu)選1000 ml本發(fā)明卵細(xì)胞保存液包含(NH4)2S04 132.1 g和Tris 2.4 g， pH為7.4。
所述Tris還可用其他緩沖物質(zhì)代替，而且Tris的含量也可為其他 值，只要能夠確保卵細(xì)胞保存液的pH值為7.0-7.8且不影響卵細(xì)胞保 存液穩(wěn)定卵細(xì)胞功能的作用即可。
3. 熒光封固液
熒光封固液用于延長熒光標(biāo)記物在熒光照射下的淬滅時間。
本發(fā)明熒光封固液為含對苯二胺和甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)。 所述熒光封固液的Na2HPO(12H20重量含量為0.4-0.8%、 KH2P04重 量含量為0.02-0.10%、 NaN3重量含量為0.01-0.5%、對苯二胺重量含 量為0.05-0.5%和甘油體積含量為5-50%,余量為蒸餾水。
如下配制本發(fā)明熒光封固液稱取Na2HP0412H20 0.4-0.8 g、 KH2P04 0.02-0.10 g、 NaN3 0.01-0.5 g、對苯二胺0.05-0.5 g置燒杯中， 加蒸餾水至45ml，攪拌溶解；加入甘油5-50ml;調(diào)pH至7.5-9.0， 加蒸餾水至100ml， 4。C保存。
優(yōu)選每100 ml本發(fā)明熒光封固液包含Na2HP04'12H20 0.6 g、 KH2P04 0.05 g、 NaN3 0.02 g、對苯二胺0.25 g和甘油25 ml, pH為 8.0。
所述NaN3還可用其他防腐劑代替，而且防腐劑的含量也可為其 他值，只要能抑制細(xì)胞生長且對檢測無影響即可；所述PBS還可用 其他緩沖物質(zhì)代替，而且PBS的含量也可為其他值，只要能夠確保 熒光封固液的pH值為7.5-9.0即可，含量的多少基本不會加速熒光素 在熒光照射下的淬滅時間。
4. 固定液
固定液可終止反應(yīng)，使精子的蛋白質(zhì)分子形成交聯(lián)鍵沉淀，從而 達(dá)到穩(wěn)定精子結(jié)構(gòu)和增加精子在載玻片上的粘合力的效果。
本發(fā)明固定液是多聚曱醛、丙酮和曱醇的混合液。所述固定液的多聚曱醛重量含量為1%-3%、丙酮體積含量為40%-50%和曱醇體積 含量為30%-45%，余量為蒸餾水。
如下配制本發(fā)明固定液稱取多聚曱醛1-3 g置燒杯中，加蒸餾 水20ml，攪拌溶解；加入丙酮40-50 ml和曱醇30-45 ml,混勻后室 溫保存。
優(yōu)選本發(fā)明固定液的多聚曱醛重量含量為2°/。、丙酮體積含量為 45%和曱醇體積含量為40%。
本發(fā)明固定液也可用其他能夠使精子蛋白質(zhì)變性并保持精子形 態(tài)結(jié)構(gòu)不變的物質(zhì)代替。
5.洗滌液
洗滌液用于在檢測透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)時洗滌載玻片，以去 除固定液和未結(jié)合的熒光素-凝集素標(biāo)記物，減少非特異性熒光。
本發(fā)明濃縮洗滌液為含Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBS)。所述濃 縮洗滌液的NaCl重量含量為0.5-1.5%、 KH2P04重量含量為 0.21-0.82°/。、 Na2HPCV12H20重量含量為1.63-6.52%、 NaN3重量含量 為0.05-0.20%和Tween-20體積含量為0.5-2.0%,余量為蒸餾水。
如下配制本發(fā)明濃縮洗滌液稱取NaCl 5.0-15.0 g、 KH2P04
2.1- 8.2 g、 Na2HP04'12H20 16.3-65.2 g和NaN3 0.5-2.0 g置燒杯中，加 蒸餾水900 ml，攪拌溶解；加入Tween-20 5-20 ml，混勻；調(diào)pH至
7.2- 7.6，加蒸餾水至1000ml， 4TM呆存。
優(yōu)選每1000 ml本發(fā)明濃縮洗滌液包含NaCl 10.0 g、 KH2P04 4.2 g、 Na2HP04*12H20 32.6 g、 NaN3 1.0 g和Tween-20 10 ml, pH為7.4。 臨用前，以蒸餾水稀釋上述濃縮洗滌液20倍，4""C貯存?zhèn)溆谩?所述NaN3還可用其他防腐劑代替，而且防腐劑的含量也可為其 他值，只要能抑制細(xì)胞生長且對反應(yīng)無影響即可；所述Tween-20還 可用其他表面活性劑代替，只要能去除非特異性反應(yīng)物且對檢測結(jié)果 無影響即可；所述PBS還可用其他緩沖物質(zhì)代替，而且PBS的含量 也可為其他值，只要能夠確保洗滌液的pH值為7.2-7.6即可，含量的多少基本不會影響透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)的檢測結(jié)果。
6.熒光素-凝集素標(biāo)記物
熒光素-凝集素標(biāo)記物用于與精子頂體區(qū)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)從而指示 是否發(fā)生了頂體反應(yīng)。
本發(fā)明熒光素-凝集素標(biāo)記物中的熒光素為異硫氰酸熒光素、四 曱基異硫氰酸若丹明或這兩種熒光染料的代用品，凝集素為刀豆蛋白
A、豌豆凝集素或花生凝集素。臨用前將所述熒光素-凝集素標(biāo)記物加 入到Tris-HCl緩沖液中，標(biāo)記物的加入量視不同標(biāo)記物的不同活性而 有所變化。
Tris-HCl緩沖液的Tris重量含量為1.2-4.8%、 NaCl重量含量為 0.4-1.6%、 BSA重量含量為0.1-0.5。/。和NaN3重量含量為0.01-0.05%,
余量為蒸餾水。
如下配制本發(fā)明熒光素-凝集素標(biāo)記物稱取Tris 1.2-4.8 g、 NaCl 0.4-1.6 g、 BSA 0.1-0.5 g、 NaN3 0.01-0.05g，溶于80毫升蒸餾水中， 攪拌溶解；用1 mol/L HC1調(diào)pH至7.0-7.8,用蒸餾水定容至100毫 升，置4。C保存；在上述溶液中加入熒光素-凝集素標(biāo)記物。
優(yōu)選每100 ml所述Tris-HCl緩沖液包含Tris 2.4 g、 NaCl 0.8 g、 BSA 0.2 g和NaN3 0.02g， pH為7.5。
所述NaN3還可用其他防腐劑代替，而且防腐劑的含量也可為其 他值，只要能抑制細(xì)胞生長且對反應(yīng)無影響即可；所述Tris還可用其 他緩沖物質(zhì)代替，而且Tris的含量也可為其他值，只要能夠確保 Tris-HCl緩沖液的pH值為7.0-7.8即可，含量的多少基本不會影響熒 光素-凝集素標(biāo)記物與精子頂體區(qū)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。
三體外檢測精子-卵母細(xì)胞相互作用 1、上泳法收集高活力精子，提取方法如下 (1)于試管底部加入精液1 ml，輕輕在試管精液上層加入1.5 ml 培養(yǎng)液(培養(yǎng)液:精液=1.5:1 (體積))。(2) 輕輕地將試管置于傾斜45度角的試管架上，置37°C 、 5% C02 培養(yǎng)箱中孵育1小時。
(3) 小心吸取最上層1 ml培養(yǎng)液。
(4) 500g離心5分鐘。
(5) 吸走精子沉淀團(tuán)上方的培養(yǎng)液。
(6) 力口入0.2ml培養(yǎng)液。
2. 在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1 ml培養(yǎng)液、3-6個卵母細(xì)胞和約2xl06 個提取后的高活力精子。在另一細(xì)胞培養(yǎng)亞中加入l ml培養(yǎng)液和約 2xl(^個提取后的高活力精子作為"透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)"空白 對照。
3. 置于C02培養(yǎng)箱(37。C、 5。/。C02)中孵育2小時。
4. 在倒置相差顯微鏡下以200-400 fim內(nèi)徑吸管將反應(yīng)后的卵母 細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另 一盛有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)亞中，反復(fù)吹打卵母細(xì)胞以去 除未與卵母細(xì)胞結(jié)合的精子，然后轉(zhuǎn)移精子-卵母細(xì)胞結(jié)合物至另一 盛有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)mi中。
5. 將洗滌后的卵母細(xì)胞置于倒置相差顯微鏡下，計數(shù)與透明帶 結(jié)合的精子數(shù)量，并依據(jù)下式計算每個卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子的 平均數(shù)
每個卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子的平均數(shù)=與卵母細(xì)胞結(jié)合的 精子總數(shù)+卵母細(xì)胞個數(shù)
此即"精子-透明帶結(jié)合試驗(yàn)，，結(jié)果。
觀察到4個卵母細(xì)胞透明帶共結(jié)合精子160個，則每個卵母細(xì)胞 透明帶結(jié)合的精子的平均數(shù)=160 + 4=40個/透明帶。
6. 將所有精子-卵母細(xì)胞結(jié)合物移入約10 pl的孩￡滴內(nèi)，在倒置相 差顯微鏡下以100-200 (im內(nèi)徑吸管反復(fù)吹打以去除與卵母細(xì)胞透明 帶表面結(jié)合的精子，然后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一盛有培養(yǎng)液的細(xì)胞培
養(yǎng)JD1中。
7. 將步驟6處理過的精子懸液和空白對照精子加到載玻片上，在一定范圍內(nèi)(12-40 mm勺均勻涂片。
8. 載玻片自然干燥后加入固定液室溫覆蓋30分鐘，用洗滌液洗 滌載玻片3次，每次2分鐘。
9. 在載玻片上覆蓋熒光素-凝集素標(biāo)記物，溫室反應(yīng)1-2小時； 用洗滌液洗滌載玻片3次，每次2分鐘；然后吹干或自然干燥。
10. 蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下至少計數(shù)200個精子觀察精 子頂體反應(yīng)率
精子頂體反應(yīng)率(°/。)=(發(fā)生頂體反應(yīng)的精子總數(shù)+被觀察精子總 數(shù))x 100%-空白對照精子反應(yīng)率(°/。)
此即"透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)試驗(yàn)，，結(jié)果。
計數(shù)透明帶誘發(fā)精子300個，其中已發(fā)生頂體反應(yīng)的精子數(shù)72個； 計數(shù)空白對照精子300個，其中已自動發(fā)生頂體反應(yīng)的精子數(shù)18個； 則精子頂體反應(yīng)率(％)=(72 + 300) x 100% - (18 + 300) x 100%=18%。
11. 將步驟6處理過的卵母細(xì)胞置于倒置相差顯微鏡下，計數(shù)頭 部已穿透進(jìn)入卵母細(xì)胞的精子數(shù)量，并依據(jù)下式計算每個卵母細(xì)胞中 穿透精子的平均數(shù)
每個卵母細(xì)胞中穿透精子的平均數(shù)-穿入卯母細(xì)胞的精子個數(shù) +卵母細(xì)胞個數(shù)
此即"精子-透明帶穿透試驗(yàn)"結(jié)果。
觀察到共計20個精子頭部穿透進(jìn)入4個卵母細(xì)胞，則每個卵母 細(xì)胞中穿透精子的平均數(shù)=20 + 4=5個。
其中可任選在上述方法步驟9之后載玻片臨用前，在載玻片上滴 加l滴熒光封固液，然后蓋上蓋玻片，并置于熒光顯《鼓鏡下至少計數(shù) 200個精子觀察精子頂體反生率。
目前認(rèn)為每個卯母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子的平均數(shù)《40個/透明 帶，透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率<16%，將嚴(yán)重影響精子與卵母細(xì)胞 自然受精，從而導(dǎo)致不育，是采取經(jīng)胞漿內(nèi)精子注射(ICSI)輔助生殖 的適應(yīng)癥措標(biāo)。精子-透明帶穿透試驗(yàn)結(jié)果與透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率具有良好的相關(guān)性，當(dāng)透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率<10%時，幾
乎沒有精子可以穿透透明帶；當(dāng)透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率< 16 %時， 精子穿透透明帶的機(jī)率<20% 。
1權(quán)利要求
1. 一種體外檢測精子-卵母細(xì)胞相互作用的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟a. 上泳法或密度梯度法提取精子；b. 在培養(yǎng)液中按一定比例混合經(jīng)步驟a提取后的精子與卵母細(xì)胞，另設(shè)立卵母細(xì)胞空白對照，并均置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)；c. 去除步驟b中未與卵母細(xì)胞表面結(jié)合的精子，倒置相差顯微鏡下檢測與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子數(shù)量；d. 使步驟c中與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子和卵母細(xì)胞分離，分別收集分離后的精子和卵母細(xì)胞；e. 將卵母細(xì)胞空白對照精子、經(jīng)步驟d分離后的精子涂于載玻片上，干燥，固定液固定，洗滌，加入熒光素-凝集素標(biāo)記物，反應(yīng)后再次洗滌，熒光顯微鏡下檢測精子頂體反應(yīng)率；f. 倒置相差顯微鏡下檢測經(jīng)步驟d分離的卵母細(xì)胞胞內(nèi)已穿透進(jìn)入其中的精子數(shù)量。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟c中通過 以下方法去除步驟b中未與卵母細(xì)胞表面結(jié)合的精子將反應(yīng)后的卵 母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一盛有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)亞中，反復(fù)吹打卵母細(xì)胞， 然后轉(zhuǎn)移精子-卵母細(xì)胞結(jié)合物至另一盛有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟d中通 過以下方法使步驟c中與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子和卵母細(xì)胞分 離將精子-卵母細(xì)胞結(jié)合物移入微滴中，反復(fù)吹打卵母細(xì)胞，然后 將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另 一盛有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)亞中。
4. 權(quán)利要求l、 2或3所述的方法，其特征在于，其中所述培養(yǎng) 液的NaCl重量含量為0.28-1.11%、 KC1重量含量為0.02-0.07%、 CaCl2'2H20重量含量為0.01-0.05%、 KH2P04重量含量為0.01-0.03%、 MgS04.7H20重量含量為 0.01-0.06% 、 酚紅重量含量為.0.0005-0.003%。、 NaHC03重量含量為0.10-0.42%、葡萄糖重量含量為 0.05-0.20%、焦丙酮酸鈉重量含量為0.015-0.060%。、 BSA重量含量為 0.17-0.70%、青霉素的含量為10000-20000單位％、碌u酸鏈霉素重量 含量為0.05-0.50%。和乳酸鈉糖漿(600 g/L)體積含量為0.18-0.74%,余量為蒸餾水。
5. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟b中的 卵母細(xì)胞可以是新鮮卵母細(xì)胞或者是保存在卵細(xì)胞保存液中的卵母 細(xì)胞，其中所述卵細(xì)胞保存液的(NH4)2S04重量含量為6.6-26.4%和 Tris重量含量為0.12-0.48%,余量為蒸餾水，其pH值為7.0-7.8。
6. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中可在步驟e中熒光 顯微鏡下計數(shù)精子頂體反應(yīng)率之前加入熒光封固液。
7. 權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述熒光封固液 是含對苯二胺的^#酸鹽緩沖液，其pH值為7.5-9.0。
8. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟e中固定 液是多聚曱醛、丙酮和曱醇的混合液。
9. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟e中洗滌 所使用的洗滌液是含Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.2-7.6。
10. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟e中熒 光素-凝集素標(biāo)記物中的熒光素為異硫氰酸熒光素FITC或四曱基異 硫氰酸若丹明TRITC,凝集素為刀豆蛋白A、豌豆凝集素或花生凝集 素。
全文摘要
一種體外檢測精子-卵母細(xì)胞相互作用的方法，包括a.上泳法或密度梯度法提取精子；b.在培養(yǎng)液中按一定比例混合經(jīng)步驟a提取后的精子與卵母細(xì)胞，另設(shè)立卵母細(xì)胞空白對照，并均置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)；c.去除步驟b中未與卵母細(xì)胞表面結(jié)合的精子，倒置相差顯微鏡下檢測與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子數(shù)量；d.使步驟c中與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子和卵母細(xì)胞分離，分別收集分離后的精子和卵母細(xì)胞；e.將卵母細(xì)胞空白對照精子、經(jīng)步驟d分離后的精子涂于載玻片上，干燥，固定液固定，洗滌，加入熒光素-凝集素標(biāo)記物，反應(yīng)后再次洗滌，熒光顯微鏡下檢測精子頂體反應(yīng)率；f.倒置相差顯微鏡下檢測經(jīng)步驟d分離的卵母細(xì)胞胞內(nèi)已穿透進(jìn)入其中的精子數(shù)量。所述方法減少了標(biāo)本資源的消耗，降低了檢測成本和檢測時間，提高了檢測效率。
文檔編號G01N33/48GK101482555SQ200910104998
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者瑜 劉 申請人:瑜 劉