專利名稱：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)LAMP檢測霍亂弧菌mdh基因及其檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (loop-mediated isothermal amplification LAMP)的食源性病原體快速檢測方法。
背景技術(shù)：
霍亂弧菌的檢測一般采用熒光PCR基因診斷技術(shù)，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足霍亂弧菌快速 診斷的要求。國內(nèi)常用的方法為常規(guī)PCR檢測，但傳統(tǒng)PCR檢測技術(shù)易出現(xiàn)假陽性，人為 因素大，不能達(dá)到快速準(zhǔn)確查清細(xì)菌性食源性疾病病因的目的。基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (LAMP)的檢測試劑盒檢測霍亂弧菌的優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高且成本低。不需要長 時(shí)間的溫度循環(huán)，不需要PCR等昂貴的儀器，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種霍亂弧菌快速檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明通過計(jì) 算機(jī)軟件分析霍亂弧菌保守和特異性基因序列，選擇霍亂弧菌的管家基因mdh gene為靶基 因，設(shè)計(jì)出四條引物與靶基因的六個(gè)區(qū)域完全匹配。mdh gene GenBank登陸號AF 343303， 所述引物與所述靶基因的95位 285位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。本發(fā)明通過 提供一種對霍亂弧菌特定基因片段具有特異性的引物組，及其用包含有上述引物組的試劑 盒檢測標(biāo)本中是否存在霍亂弧菌特定基因片段，進(jìn)而確定標(biāo)本中是否存在霍亂弧菌。本發(fā) 明的優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高且成本低。本發(fā)明涉及的霍亂弧菌快速檢測試劑盒， 其中的試劑包括如下⑴ ⑶(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液含有l(wèi)OXThermopol 反應(yīng)緩沖液、300 500iiMdNTP、6 10mM 硫酸鎂。1. 2 1. 6iiM上游內(nèi)引物、1. 2 1. 6iiM下游內(nèi)引物、0. 2 0. 3iiM上游外引物、0. 2 ~ 0. 3 u M 下游外引物和0. 2 0. 6M甜菜堿；上游內(nèi)引物為5-GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA-3、下游內(nèi)引物為5-TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG-3、上游外引物為GGTGCGGATGTGGTTCTG；
下游外引物為AGCACTTCGGCTGCGATA(2) Bst DNA 聚合酶:8U/u L ；(3)顯色劑為10%的熒光染料SYBR GREEN I。上面所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液每管共有22 y L，其最佳組成為2. L lOXThermopol反應(yīng)緩沖液、lyL 10mmol/LdNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物)、2 y L 20pmol/ii L 上游內(nèi)引物(FIP)、2iiL 20pmol/y L 下游內(nèi)引物(BIP) ,1 U L 5pmol/iiL 上游外引物(F3)、liiL 5pmol/ii L 下游外引物(B3)、8yL 25mmol/LMgS04,2 u L 5mol/L 甜菜堿 和 2. 5ii LddH20。使用上述試劑盒檢測霍亂弧菌的方法，依次包括下列步驟(1) (3)(1)待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在1. 6 2. 0范圍內(nèi)，濃度在 10 100ng/ii L范圍內(nèi)。(2)進(jìn)行霍亂弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)A.在裝有22 ii L LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 u L待檢模板DNA，于恒溫95°C放 置3 5min，立即置于冰上1 3min ；B.然后在反應(yīng)管中加入liiL Bst DNA聚合酶，并于恒溫60 65°C擴(kuò)增反應(yīng)45 90min ；C.將溫度調(diào)到80 95°C中止反應(yīng)，3 5min后取出待檢。(3)顯色檢測在上述待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入1 P L顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液 顏色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品含有或?yàn)榛魜y弧菌。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1按下列配方制作霍亂弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒(1) LAMP 反應(yīng)液2. 5u L 10XThermopol反應(yīng)緩沖液、1 U L 10mmol/L dNTP(四種脫氧核糖核酸的 混合物)、2111^2(^11101/111^上游內(nèi)引物(FIP)、2iiL 20pmol/ii L 下游內(nèi)引物(BIP)、lyL 5pmol/ii L 上游外引物(F3)、liiL 5pmol/y L 下游外引物(B3)、8yL 25mmol/LMgS04,2 u L 5mol/L 甜菜堿和 2. 5 ii L ddH20。其中所述的上游內(nèi)引物5-GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA-3、下游內(nèi)引物5-TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG-3上游外引物5-GGTGCGGATGTGGTTCTG-3、下游外引物5-AGCACTTCGGCTGCGATA-3其中混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP dATP dGTP dCTP =1:1:1:1。(2) BStDNA 聚合酶8U/ ii L ；(3)顯色劑為10%的熒光染料SYBRGREEN I。按照以下(1) (3)程序進(jìn)行檢測(1)樣品DNA的提取檢測霍亂弧菌(Vibrio cholerae)，菌種為標(biāo)準(zhǔn)菌株M045。使用PE公司液體工作 站提取樣品DNA，DNA OD260/OD280能夠達(dá)到1. 8，濃度達(dá)到20ng/y L
(2)進(jìn)行菌樣的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)A.在裝有22 ii L LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 u L待檢模板DNA，于，95°C放置 5min，立即置于冰上lmin ；B.在上述反應(yīng)管中加入1 P L Bst DNA聚合酶，并于恒溫水浴上65°C擴(kuò)增反應(yīng)1 小時(shí)；C.將水浴調(diào)到80°C中止反應(yīng)，3min后取出待檢；(3)顯色檢測在上述待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入1 P L顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液 顏色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品為霍亂弧菌。實(shí)施例2按下列配方制作霍亂弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒(1) LAMP 反應(yīng)液2. 5u L lOXThermopol 反應(yīng)緩沖液、liiL 10mmol/L dNTP(四種脫氧核糖核酸 的混合物)、2 y L20pmol/u L上游內(nèi)引物(FIP)、2 u L20pmol/u L下游內(nèi)引物(BIP) UuL 5pmol/ii L 上游外引物(F3)、liiL 5pmol/y L 下游外引物(B3)、8 y L25讓ol/LMgS04、2 y L 5mol/L 甜菜堿和 2. 5 ii L ddH20。其中所述的上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物同上。上述混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比同上。(2) BStDNA 聚合酶8U/ ii L ；(3)顯色劑為10%的熒光染料SYBRGREEN I。按照以下(1) (3)程序進(jìn)行檢測(1)樣品DNA的提取檢測霍亂弧菌(Vibrio cholerae)，菌種為標(biāo)準(zhǔn)菌株M045。使用水煮法提取樣品 DNA，DNAOD260/OD280 能夠達(dá)到 1. 8，濃度達(dá)到 20ng/ii L。(2)進(jìn)行菌樣的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)A.在裝有22 ii L LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 u L待檢模板DNA，于，95°C放置 5min，立即置于冰上lmin ；B.在上述反應(yīng)管中加入1 P L BstDNA聚合酶，并于恒溫水浴上65°C擴(kuò)增反應(yīng)1小 時(shí)；C.將水浴調(diào)到80°C中止反應(yīng)，3min后取出待檢；(3)顯色檢測在上述待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入1 P L顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液 顏色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品為霍亂弧菌。核苷酸序列表<110>深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120>環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)LAMP檢測霍亂弧菌mdh基因及其檢測試劑盒<160>4<210>1
<211>44
5
<212>DNA<213>人工序列<221>prim_bind<222>(1)... (44)<400>1GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA 44<210>2<211>44<212>DNA<213>人工序列<221>prim_bind<222>(1)... (44)<400>2TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG 44<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<221>prim_bind<222>(1)... (18)<400>3GGTGCGGATGTGGTTCTG 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<221>prim_bind<222>(1)... (18)<400>4AGCACTTCGGCTGCG ATA 18
權(quán)利要求
一種霍亂弧菌快速檢測試劑盒，其特征在于其中的試劑包括下列(1)～(3)(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液包括10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、300～500μM dNTP、6～10mM硫酸鎂(MgSO4)、1.2～1.6μM上游引內(nèi)物(FIP)、1.2～1.6μM下游內(nèi)引物(BIP)、0.2～0.3μM上游外引物(F3)、0.2～0.3μM下游外引物(B3)和0.2～0.6M甜菜堿；其中10×Thermopol反應(yīng)緩沖液含有200mM pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷 鹽酸(Tris HCL)、100mM氯化鉀(KCL)、100mM硫酸銨((NH4)2SO4)、20mM硫酸鎂MgSO4和1％曲拉通X 100(TritonX 100)；其中上游內(nèi)引物5 GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA 3、下游內(nèi)引物5 TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG 3、上游外引物5 GGTGCGGATGTGGTTCTG 3、下游外引物5 AGCACTTCGGCTGCGATA 3、(2)BstDNA聚合酶8U/μL；(3)顯色劑為10％的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的霍亂弧菌快速檢測試劑盒，其特征是上述的dNTP內(nèi)的四種 脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP dATP dGTP dCTP = 1 1 1 1。
3.使用上述試劑盒檢測霍亂弧菌的方法，其特征是依次包括下列步驟(1) (3)(1)待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNAOD260/OD280 在1.6 2. 0范圍內(nèi)，濃度在10 100ng/ y L范圍內(nèi)；(2)進(jìn)行霍亂弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng):A.在裝有22yLLAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中 力口入2 ii L待檢樣品模板DNA，于恒溫95°C放置3 5min，立即置于冰上1 3min ；B.然后 在反應(yīng)管中加入1 P L BStDNA聚合酶，并于恒溫65°C擴(kuò)增反應(yīng)45 90min ；C.將溫度調(diào)到 80°C中止反應(yīng)，3 5min后取出待檢；(3)顯色檢測在待檢的上述每個(gè)反應(yīng)管中加入1PL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變 化，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品含有或?yàn)榛魜y弧菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，用于測定微生物，涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)的霍亂弧菌快速檢測技術(shù)。本發(fā)明通過計(jì)算機(jī)軟件分析霍亂弧菌保守和特異性基因序列，設(shè)計(jì)出四條引物完全與識別的靶序列中六個(gè)結(jié)合區(qū)匹配，該方法利用一種鏈置換DNA聚合酶-Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒溫(65℃)的條件下反應(yīng)1小時(shí)即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過熒光染色直接目測比色就可以得到清晰的反應(yīng)結(jié)果，進(jìn)而確定標(biāo)本中是否存在霍亂弧菌。該試劑盒內(nèi)有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、顯色劑；反應(yīng)液含有反應(yīng)緩沖液、dNTP、硫酸鎂、上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物和甜菜堿；檢測霍亂弧菌的方法包括細(xì)菌DNA的提取、霍亂弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、顯色檢測。其特點(diǎn)是特異性、敏感性高、檢測時(shí)間短和檢測成本比普通PCR低。
文檔編號G01N21/78GK101892293SQ20091010746
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日
發(fā)明者萬志剛, 劉慧玲, 匡燕云, 葉衛(wèi)翔, 呂敬章, 宋志強(qiáng), 朱海, 洪小柳, 范放, 趙芳, 馬淑棉, 黃李華 申請人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心