專利名稱：突變的水泡性口炎病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒領(lǐng)域，尤其是涉及對作為病毒載體和疫苗有用的突變病毒。
背景技術(shù)：
減毒病毒或復(fù)制能力下降的那些病毒已被廣泛用于多種治療應(yīng)用，例如，作為疫苗或疫苗載體，或作為基因治療載體。減毒病毒的生產(chǎn)通常涉及將野生型病毒重復(fù)通過非天然宿主而對機(jī)會突變進(jìn)行分離。重組DNA技術(shù)和遺傳工程技術(shù)的發(fā)展為更好地將病毒開發(fā)為治療劑和預(yù)防劑提供了工具。重組技術(shù)允許將特定的突變導(dǎo)入到病毒基因組的選定區(qū)域，還可以減少突變病毒回復(fù)為野生型病毒的可能性。
許多病毒具有刺激體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的能力，這使得它們成為理想的疫苗載體，因此許多病毒已被開發(fā)為針對很多疾病的疫苗載體，所述疾病包括HIV、HCV和癌癥。病毒還非常適合于用作基因治療載體。基因治療，即通過將功能性基因瞬時或永久地轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞中而改變基因表達(dá)，正在被廣泛地開發(fā)為預(yù)防和治療疾病的新手段。盡管已知各種物理和化學(xué)方法可以將外源核酸導(dǎo)入真核細(xì)胞，但已普遍證明病毒對于這種目的要有效得多。諸如微小病毒、腺病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、彈狀病毒和痘病毒等數(shù)種病毒已被開發(fā)為可能的基因治療載體(例如見專利號為6,440,422、6,531,123和6,451,323的美國專利)。
已記載有對大量病毒的改造以產(chǎn)生具有特殊性質(zhì)的重組病毒。例如，專利號為6,497,873的美國專利記載了表達(dá)副粘病毒SV5株的F蛋白的重組彈狀病毒。在該重組病毒中，所述的F蛋白與彈狀病毒G蛋白的一部分一起作為融合蛋白進(jìn)行表達(dá)。專利號為6,022,726和6,468,544的美國專利描述了改造后的減毒病毒，該減毒病毒包括病毒非結(jié)構(gòu)(NS)基因的非編碼序列或編碼序列中的突變。還記載了表達(dá)改變后的或嵌合的病毒蛋白的嵌合減毒病毒。專利號為6,468,544的美國專利進(jìn)一步記載了能夠在受感染細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素的活的減毒的流感病毒。
還記載了將工程病毒作為溶瘤劑，其利用瘤細(xì)胞特有的遺傳缺陷以在瘤細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和裂解瘤細(xì)胞，但在非瘤細(xì)胞則不能進(jìn)行復(fù)制和裂解。例如，國際專利申請WO 97/26904和WO 96/03997披露了抑制腫瘤細(xì)胞生長的突變的單純皰疹病毒(HSV-1716)，專利號為6,296,845的美國專利記載了據(jù)信可以優(yōu)先在p53陰性腫瘤細(xì)胞中復(fù)制的突變的腺病毒，專利號為6,110,461的美國專利教導(dǎo)了使用呼腸孤病毒治療Ras介導(dǎo)的腫瘤，以及專利號為6,531,456的美國專利記載了攜帶藥物易感性基因和另外的能夠產(chǎn)生輔助作用的基因(例如干擾素或腫瘤抑制基因)的重組腺相關(guān)病毒載體以用于癌癥治療。
作為遺傳工程病毒的替換方案，可以使用非病原性病毒，例如，WO01/19380記載了使用彈狀病毒，尤其是水泡性口炎病毒(VSV)，作為腫瘤細(xì)胞的選擇性溶瘤劑，所述病毒的特征是具有低水平或不具有PKR(雙鏈RNA依賴性激酶)活性。WO 01/19380還記載了對干擾素具有易感性的4種突變VSV的鑒定及其作為溶瘤劑的用途。
提供這些背景信息的目的是使人們了解申請人認(rèn)為可能與本發(fā)明有關(guān)的信息。并不是必然意欲承認(rèn)任何前述信息構(gòu)成破壞本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)，也不能進(jìn)行這樣的解釋。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供突變的病毒及其用途。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供突變的彈狀病毒，該突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種病毒載體，該病毒載體包含突變的彈狀病毒的，該突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種疫苗載體，該疫苗載體包含突變的彈狀病毒和編碼一個或一個以上抗原的異源核酸，所述突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種疫苗佐劑，該疫苗佐劑包含突變的彈狀病毒和選擇性地包含藥學(xué)上可接受的載體，所述突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，所述的突變的彈狀病毒能夠在受感染細(xì)胞中引發(fā)一種或一種以上的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種選擇性溶瘤劑，該選擇性溶瘤劑包含突變的彈狀病毒和選擇性地包含藥學(xué)上可接受的載體，所述突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含突變的彈狀病毒和藥學(xué)上可接受的載體，所述突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含突變的彈狀病毒和藥學(xué)上可接受的載體，所述突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，所述的突變的彈狀病毒能夠在受感染細(xì)胞中引發(fā)一種或一種以上的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供如上所述的突變的彈狀病毒作為病毒藥物制劑的添加劑的用途，以防止所述制劑中產(chǎn)生烈性回復(fù)體。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供如上所述的突變的彈狀病毒在治療疾病或異常中的用途，所述的疾病或異常可由于細(xì)胞因子的釋放而得以減輕。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供如上所述的突變的彈狀病毒作為病毒載體以將所述的異源核酸遞送到需要其的受試對象的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種試劑盒，該試劑盒包含一個或一個以上容器和突變的彈狀病毒，該突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。


圖1描述突變VSV病毒AV1和AV2的降低的體內(nèi)毒性是由干擾素介導(dǎo)的。(A)人前列腺癌細(xì)胞(PC3)和人腎臟癌細(xì)胞(CAKI-1)受到模擬感染或受到VSV的野生型(WT)、AV1或AV2株的感染。用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)對培養(yǎng)基進(jìn)行測定，以檢測在感染后18小時人α-干擾素的產(chǎn)生。(B)通過常規(guī)方法和小鼠品系測定野生型病毒和突變VSV株的體內(nèi)毒性。IN＝鼻內(nèi)；IV＝靜脈內(nèi)；nd＝未測定。(C)AV2可以通過反式作用使小鼠免受致命的WT(野生型)VSV的感染。用各種劑量的WT、AV2或這兩個株系的組合對PKR-/-小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)感染，并監(jiān)測致病率或死亡率。數(shù)值表示每組小鼠表現(xiàn)感染征兆的數(shù)目(致病率)和每組小鼠死于感染的數(shù)目(死亡率)。(D)用WT VSV、AV1或AV2病毒對Balb/C和Balb/C IFNR-/-小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)感染，并監(jiān)測致病率。
圖2描述次級轉(zhuǎn)錄應(yīng)答受到WT VSV的抑制，但沒有受到AV1或AV2的抑制。(A)對病毒感染的初級應(yīng)答由IRF-3、cJUN/ATF-2和NFκB(此處顯示的是在IFN-β啟動子中的增強(qiáng)體(enhansosome)復(fù)合物的形成部分)介導(dǎo)。微矩陣數(shù)據(jù)顯示，初級轉(zhuǎn)錄應(yīng)答基因在WT感染的細(xì)胞和突變病毒感染的細(xì)胞中明顯上調(diào)(a已知ISG15的完全誘導(dǎo)需要ISGF3)。數(shù)值代表相對于模擬感染的誘導(dǎo)倍數(shù)。(B)然后IFN-β被翻譯和分泌從而以自分泌方式刺激JAK/STAT的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以在細(xì)胞核中形成ISGF3復(fù)合物，該ISGF3復(fù)合物介導(dǎo)次級轉(zhuǎn)錄應(yīng)答基因的誘導(dǎo)。盡管受到AV1或AV2感染的細(xì)胞顯示這些基因明顯上調(diào)，但是WT感染的細(xì)胞根本不顯示表達(dá)(A＝缺乏)。(C)如果在WT VSV感染的細(xì)胞中沒有隨之發(fā)生IRF-7的表達(dá)，則包括幾乎所有的IFN-α基因的三級轉(zhuǎn)錄波就不會發(fā)生(b通過矩陣檢測發(fā)現(xiàn)在WT樣品中有少量的IFN-α7)。相反地，AV1和AV2感染的細(xì)胞有效地誘導(dǎo)IFN-α基因的表達(dá)。(D)A549細(xì)胞感染后4小時RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的數(shù)據(jù)顯示，初級應(yīng)答基因RANTES和IFN-β在WT和突變VSV感染細(xì)胞中被誘導(dǎo)到類似水平，但在WT感染的細(xì)胞中MX1(次級應(yīng)答)的上調(diào)受到破壞。(E)Western印跡分析顯示，在WT和突變VSVs之間的IRF-3激活的動力學(xué)是相似的，但是ISG56(初級應(yīng)答)蛋白的表達(dá)在WT感染的細(xì)胞中受到嚴(yán)重破壞。只有在AV1和AV2感染的細(xì)胞中檢測到IRF-7蛋白。IRF-7Δ似乎能夠誘導(dǎo)內(nèi)源IRF-7的表達(dá)。
圖3顯示通過定量RT-PCR測定，IFN-βmRNAs在來自WT VSV感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)組分中顯著減少。(A)對來自WT、AV1或AV2 VSV感染的細(xì)胞的細(xì)胞核(N)和細(xì)胞質(zhì)(C)中的總RNA組分進(jìn)行IFN-βmRNA分析；根據(jù)來自同一個樣品的HPRT mRNA進(jìn)行校正。*表示沒有檢測到IFN-βmRNA。(B)通過ELISA對WT或突變VSV株感染的細(xì)胞進(jìn)行IFN-β產(chǎn)量的分析。AV1和AV2感染的細(xì)胞顯示可檢測到的分泌的IFN-β，但WT VSV感染的細(xì)胞沒有顯示可檢測到的分泌的IFN-β。
圖4描述突變VSV株在各種腫瘤模型中證明具有體內(nèi)效力。(A)突變VSV在通過腹膜內(nèi)治療進(jìn)行異種移植物人卵巢腹水腫瘤的治療中是有效的。將人ES-2卵巢癌細(xì)胞注入CD-1裸鼠的腹膜腔中，以形成腹水腫瘤。注射1×106的ES-2細(xì)胞后12天，用AV2 VSV或UV(紫外線)滅活的AV2 VSV隔天(共3劑量)處理該動物。將各劑量(1×109pfu)施入腹膜腔內(nèi)。評定該動物的致病率和死亡率，并在出現(xiàn)中度腹水形成后對該動物實(shí)施安樂死?！皀”表示每組動物的數(shù)目。(B)對免疫活性動物中的皮下腫瘤的全身治療。通過將1×106CT26結(jié)腸癌細(xì)胞注射到后脅腹區(qū)域，在Balb/C小鼠中形成皮下腫瘤。當(dāng)腫瘤達(dá)到約10mm3時，通過靜脈內(nèi)注射5×108pfu的所示病毒，在10天的時間內(nèi)隔天(共6劑量)治療小鼠?！疤芈逡?Trojan)”是指注射20MOI(感染復(fù)數(shù))的AV1 VSV感染的3×105CT26細(xì)胞。對照小鼠接受6劑量的5×108pfu的UV滅活的AV2 VSV。每天測量腫瘤以計(jì)算腫瘤的體積。當(dāng)認(rèn)為腫瘤負(fù)荷過大時(約750mm3)對該動物實(shí)施安樂死。(C)顯示每天測定的每組小鼠體重的變化，從治療前3天到治療后11天。誤差條表示SEM(標(biāo)準(zhǔn)方差)。(D)對免疫活性小鼠模型中的已擴(kuò)散的肺部腫瘤的治療。通過將3×105CT26細(xì)胞注射到Balb/C小鼠的尾靜脈中形成肺部腫瘤。在第12天，按以下方法對小鼠進(jìn)行治療UV AV2 IV＝1劑量，靜脈內(nèi)(5×108pfu)，AV2 IV＝1劑量的突變3VSV，靜脈內(nèi)(5×108pfu)，AV2 IN＝1劑量的AV2 VSV，鼻內(nèi)(5×107pfu)，AV2 IV & IN＝1劑量的AV2 VSV，靜脈內(nèi)(5×108pfu)和1劑量的AV2 VSV，鼻內(nèi)(5×107pfu)。治療后4天，將所有小鼠殺死，并將它們的肺取出(為了便于測量，使心臟可以看到)。箭頭表示剩余的腫瘤。(E)按以上方式形成肺部腫瘤。在第12天，按所示的那樣通過鼻滴方式遞送5×107pfu而對小鼠進(jìn)行治療，在2周的時間內(nèi)隔天進(jìn)行遞送(共6劑量)。每天監(jiān)測致病率和死亡率，對出現(xiàn)呼吸窘迫的小鼠實(shí)施安樂死，并對它們的腫瘤負(fù)荷進(jìn)行檢測?！皀”表示治療組小鼠的數(shù)目。
圖5表示描述突變的VSV株系是如何能夠防止烈性WT株系從混雜的群體中出現(xiàn)的模型。(A)WT VSV能夠阻斷IFN從感染的細(xì)胞中分泌，使得鄰近的細(xì)胞沒有受到保護(hù)而對新生的病毒體表現(xiàn)出易感性，由此導(dǎo)致病毒傳播。(B)用編碼在阻斷核/質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中具有缺陷的M蛋白的VSV株系感染后，誘導(dǎo)了IFNs和可能的其它細(xì)胞因子的“細(xì)胞因子云”。鄰近的細(xì)胞免于受到企圖在群體中出現(xiàn)的突變VSV和任何推測回復(fù)株的感染。
圖6描述突變的實(shí)施例，該突變可以按照本發(fā)明在編碼VSV的M蛋白的基因中進(jìn)行。
圖7描述用于拯救突變體XNDG M4和M5的VSV的M蛋白的相關(guān)部分的序列。
圖8描述經(jīng)拯救的突變體VSVs XNDG M4和M5具有與Mut2突變VSV類似的噬菌斑大小。
圖9A、B和C描述用與GFP融合的VSV的氨基末端72個氨基酸(WT+72-GFP-N1，綠色)和OCT-DsRed2(線粒體標(biāo)記，紅色)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的圖。C.合并圖顯示M-GFP和OCT-DsRed2的共定位。D、E和F顯示用WT+72-GFP-N1轉(zhuǎn)染并用Mitotraker Red(線粒體示蹤紅)染色的細(xì)胞。箭頭表示典型的顯示斷開的(punctuate)線粒體和的線粒體示蹤紅染色降低的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。星號表示具有網(wǎng)狀(正常)線粒體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該線粒體顯示W(wǎng)T+72-GFP-N1和線粒體示蹤紅染色的共定位(合并圖F)。G和H顯示用WT+72-GFP-N1轉(zhuǎn)染并用線粒體示蹤紅染色的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞具有斷開的線粒體和降低的線粒體示蹤染色(箭頭)。
圖10A、B和C描述用與GFP融合的VSV M的氨基末端72個氨基酸(WT+72-GFP-N1，綠色)和OCT-DsRed2(線粒體標(biāo)記，紅色)共轉(zhuǎn)染的活細(xì)胞的圖。合并圖顯示原來在該細(xì)胞中為網(wǎng)狀的線粒體隨著該細(xì)胞被這種毒性蛋白殺死而出現(xiàn)的共定位和漸進(jìn)性片段化。D是按上述方法進(jìn)行共轉(zhuǎn)染的活細(xì)胞。這再一次顯示W(wǎng)T+72-GFP-N1和與該VSVM-GFP融合蛋白具有相對濃度的OCT-DsRed2的共定位，以及在該線粒體中的突出部分和交叉部分(綠色)。
圖11描述VSV突變體AV1的基因組的核酸序列(SEQ ID NO1)。
圖12描述VSV突變體AV1的突變的M蛋白基因的核酸序列(SEQID NO2)。
圖13描述VSV突變體AV1的突變的M蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO3)。
圖14描述VSV突變體AV2的基因組的核酸序列(SEQ ID NO4)。
圖15描述VSV突變體AV2的突變的M蛋白基因的核酸序列(SEQID NO5)。
圖16描述VSV突變體AV2的突變的M蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO6)。
圖17A和B圖示性地顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案的突變VSV的保護(hù)性作用，其中，圖17A描述在施用致命的顱內(nèi)劑量的VSV后，小鼠的存活百分比；圖17B描述在施用致命的顱內(nèi)劑量的VSV后，小鼠體重隨著時間的變化。
圖18圖示性地描述在用WT VSV或突變VSV(AV1或AV2)感染的OVCAR4、CAKI-1和HOP62細(xì)胞中的IFN-β相對產(chǎn)量。
圖19A和B圖示性地描述來自WT VSV和ΔM51 VSV處理的小鼠的脾細(xì)胞的抗CT-26細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性，所述小鼠具有確定的CT26腫瘤(圖19A)和由來自WT VSV和ΔM51 VSV處理的小鼠的脾細(xì)胞引起的NK依賴性和非依賴性的CT26細(xì)胞裂解(圖19B)。
圖20描述來自攜帶皮下CT26腫瘤的ΔM51 VSV GFP處理的小鼠的CT26腫瘤的免疫組織化學(xué)染色切片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供在基因中攜帶一個或一個以上突變的突變病毒，所述基因編碼在受感染細(xì)胞中負(fù)責(zé)阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白。因此當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，該突變病毒具有降低的阻斷核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，并且在體內(nèi)是減毒的。該突變病毒能夠引發(fā)正常宿主細(xì)胞的抗病毒系統(tǒng)，同時還保持對這些系統(tǒng)作用的敏感性。該突變病毒在廣大范圍內(nèi)應(yīng)用，包括但不限于治療癌癥和慢性感染的治療劑、該治療劑為疫苗和佐劑、病毒載體，以及用于選擇性裂解惡性細(xì)胞或受感染細(xì)胞的溶瘤劑和溶細(xì)胞劑。
定義除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的一般理解相同的含義。在本文，互換使用氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)的三字母和單字母符號。
本文使用的涉及具體病毒的術(shù)語“異源核酸序列”是指源自所述具體病毒之外的來源的核酸序列。
本文使用的術(shù)語“突變”是指缺失、異源核酸的插入、倒位或置換。
本文使用的術(shù)語“基因”是指編碼單獨(dú)的蛋白或RNA(也稱為“編碼序列”或“編碼區(qū)”)以及諸如啟動子、操縱子、終止子等有關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)的核酸片段，所述的調(diào)節(jié)區(qū)可以定位在編碼序列的上游或下游。
本文使用的術(shù)語“突變病毒”是指在其基因組中含有一個或一個以上突變的病毒，所述突變包括但不限于缺失、異源核酸的插入、倒位、置換，或者它們的組合。
本文使用的術(shù)語“天然存在的”，涉及病毒時是指該病毒可以在自然界中找到，即可以從自然界來源中分離到該病毒并且沒有經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室人為的特意修飾。
本文使用的術(shù)語“野生型病毒”是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的具有最常見基因型的病毒，突變體是相對于野生型病毒來進(jìn)行定義的。
本文使用的術(shù)語“抗病毒系統(tǒng)”是指針對病毒感染進(jìn)行細(xì)胞應(yīng)答的組分，包括例如干擾素和其它的細(xì)胞因子、一氧化氮合成酶、雙鏈RNA依賴性激酶(PKR)、寡聚腺苷酸合成酶(OAS)、Mx A和Mx B GTP酶等。
本文使用的術(shù)語“抗病毒應(yīng)答”是指針對病毒感染進(jìn)行的細(xì)胞應(yīng)答，包括例如干擾素的產(chǎn)生、細(xì)胞因子的釋放、趨化因子的產(chǎn)生、淋巴因子的產(chǎn)生，或者它們的組合。
本文使用的術(shù)語“正常宿主細(xì)胞”是指具有完全的抗病毒應(yīng)答的非癌非感染細(xì)胞。
本文使用的術(shù)語“疫苗”是指在動物中能夠刺激免疫應(yīng)答而不引起疾病的物質(zhì)的制劑。
本文使用的術(shù)語“溶瘤劑”是指能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和/或能夠殺死腫瘤細(xì)胞的試劑。
本文使用的術(shù)語“佐劑”是指當(dāng)將其添加到疫苗中時能夠促進(jìn)該疫苗在受試對象中刺激引起的免疫應(yīng)答增強(qiáng)的物質(zhì)。
突變病毒本發(fā)明提供包含在其基因中具有一個或一個以上突變的突變病毒，所述基因編碼涉及在感染宿主細(xì)胞中阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白。結(jié)果，該突變病毒具有降低的阻斷核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，并且該病毒在體內(nèi)是減毒的。對mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的阻斷削弱了受感染細(xì)胞中的抗病毒系統(tǒng)以及消弱了受感染細(xì)胞能夠保護(hù)鄰近細(xì)胞不受到感染(即早期預(yù)警系統(tǒng))的機(jī)制，并最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解。因此在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述的突變病毒與它們的野生型對應(yīng)病毒相比具有降低的溶細(xì)胞性質(zhì)。
由于突變病毒不能夠阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)，該突變病毒對正常宿主細(xì)胞的感染能夠?qū)е略摷?xì)胞的抗病毒系統(tǒng)的引發(fā)，而野生型病毒通常阻斷或者避開該抗病毒系統(tǒng)。因此根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，突變病毒能夠引發(fā)正常宿主細(xì)胞的抗病毒系統(tǒng)，并且對該抗病毒系統(tǒng)敏感。
由于許多能夠阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)(作為其復(fù)制周期的一部分)的病毒是已知的，因此適合于進(jìn)行突變以產(chǎn)生如本發(fā)明所述的突變病毒。該病毒可以是DNA病毒，正鏈RNA病毒或負(fù)鏈RNA病毒。適宜的DNA病毒的例子包括皰疹病毒、腺病毒、微小病毒、乳多空病毒、虹色病毒、嗜肝DNA病毒(hepadenavirus)、痘病毒、腮腺炎病毒、人副流感病毒、麻疹病毒或風(fēng)疹病毒。適宜的正義RNA病毒的例子包括披膜病毒、黃病毒、小核糖核酸病毒或冠狀病毒。適宜的負(fù)義RNA病毒的例子包括來自正粘病毒科、彈狀病毒科和副粘病毒科的病毒。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述病毒為選自痘病毒科、小核糖核酸病毒、正粘病毒科或彈狀病毒科，例如，該病毒可以是牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、流感病毒、狂犬病病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒或水泡病毒。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述病毒是彈狀病毒科的成員。彈狀病毒尤其適合于治療用途，因?yàn)樗鼈儾皇桥c人共有的病原體。預(yù)先存在的對與用作治療劑的病毒株類似的病毒株的免疫應(yīng)答會減弱該突變病毒作為治療劑的效果，因而是不希望得到的。而且，彈狀病毒是RNA病毒，其在細(xì)胞質(zhì)中完成它們的全部生命周期，因而降低了不需要的整合到該患者的基因組中的危險(xiǎn)性。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，彈狀病毒是水泡病毒。適宜的水泡病毒的例子包括但不限于，Piry、金迪普拉病毒、水泡性口炎病毒(VSV)。
VSV是已證明具有治療潛能的水泡病毒科成員。VSV在人中的感染是沒有癥狀或出現(xiàn)輕微“流感”癥狀。至今還沒有在VSV感染的人中出現(xiàn)嚴(yán)重疾病或死亡的病例的報(bào)道。VSV的其它有用特性包括以下事實(shí)該病毒繁殖快的事實(shí)和可以容易地濃縮成高滴度，該病毒非常簡單，只有5個基因，因此很容易進(jìn)行遺傳操作，并且該病毒的宿主范圍廣并能夠感染大多數(shù)類型的人類細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述的突變病毒是突變的VSV。在本領(lǐng)域中已知有很多不同的VSV株系，并且該VSV株系適合于本發(fā)明的用途。例子包括但不限于，印第安納株和新澤西株。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解將來會出現(xiàn)和/或發(fā)現(xiàn)VSV新株系，該新株系也適合于本發(fā)明的用途。該株系也被認(rèn)為落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
1.突變病毒的制備根據(jù)本發(fā)明，所述突變病毒可以是天然存在的突變體或它們可以是遺傳工程突變體。因此，所述突變病毒可以使用限定的生長條件或選擇壓進(jìn)行選擇而獲得，或它們可以是使用本領(lǐng)域已知的遺傳工程技術(shù)進(jìn)行了特定改造的重組病毒。
例如，為了選擇那些在受感染細(xì)胞中引發(fā)抗病毒系統(tǒng)并且保持對抗病毒系統(tǒng)敏感的突變病毒，可以將大量的病毒置于細(xì)胞上培養(yǎng)，所述細(xì)胞通常對野生型病毒是易感的；并分離在這些細(xì)胞上生長欠佳(即形成較小的噬菌斑)病毒。這些分離的病毒就是候選的突變病毒。一種用于病毒(例如通常在受感染細(xì)胞中阻斷干擾素應(yīng)答的VSV)選擇的技術(shù)的例子就是在干擾素應(yīng)答細(xì)胞(例如上皮細(xì)胞系)上對與野生型病毒相比時生長欠佳的VSV進(jìn)行選擇。當(dāng)所述的候選突變體在干擾素非應(yīng)答細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)上生長時形成大噬菌斑，即可以確定原先生長欠佳是因?yàn)楦蓴_素應(yīng)答的緣故(參見，例如，國際專利申請WO 01/19380)。
一旦天然存在的突變病毒得到鑒定和分離，就可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如測序技術(shù)、限制性分析、雜交技術(shù)、微矩陣分析或者它們的組合)測定突變在病毒基因組中的位置。然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(見下文)對重組的突變病毒進(jìn)行遺傳改造，以在該基因組的相同區(qū)域中含有相同的一個或多個突變或含有類似的一個或多個突變。對于通過遺傳改造(即重組病毒)而含有缺失突變或插入突變的病毒，其回復(fù)率通常比天然存在的突變體低，因此尤其適合于治療目的。
可選擇地，如果病毒中的候選基因已經(jīng)確定，可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)對重組的突變病毒進(jìn)行遺傳改造(參見，例如，Sambrook等，1989，實(shí)驗(yàn)室手冊(A Laboratory Manual)，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。猜想在這一點(diǎn)上的候選基因?qū)沁@樣的基因，其編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述的突變病毒是重組的突變病毒。
例如，可以使用例如那些在專利號為4,769,330和4,215,051的美國專利中和由Racaniello等(1981，科學(xué)(Science)214916～919)記載的重組DNA技術(shù)，對DNA病毒(例如牛痘病毒、腺病毒、桿狀病毒)和正鏈RNA病毒(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒)進(jìn)行改造?？梢允褂靡呀⑼晟频摹胺聪蜻z傳學(xué)”技術(shù)(例如針對VSV而建立的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)(RobertsA和J.K.Rose，Virology，1998，2471～6))對負(fù)鏈RNA病毒(例如流感病毒和VSV)進(jìn)行遺傳改造。
可以使用例如以上所述的遺傳學(xué)技術(shù)對候選基因中的一個或一個以上的突變進(jìn)行遺傳工程化。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該理解，該基因可以是編碼結(jié)構(gòu)蛋白或者非結(jié)構(gòu)蛋白的基因，這取決于所使用的特定病毒。所述的突變可以是一個或一個以上核苷酸的核苷酸缺失、插入、倒位或置換，或是外源核酸的插入，或者是它們的組合。正如本領(lǐng)域已知的那樣，通過對引入的突變進(jìn)行修正，有時突變病毒能夠回復(fù)為野生型。因此可以使用諸如缺失和/或多個核苷酸突變等難以修正的突變，來產(chǎn)生突變病毒，以使回復(fù)可能性最小。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，引入的突變是缺失突變。在另一個實(shí)施方案中，引入的突變是涉及兩個、三個或者更多核苷酸的突變。本領(lǐng)域中已熟知，可以通過在基因的編碼區(qū)或與其相關(guān)的調(diào)控區(qū)中引入突變，從而影響蛋白的表達(dá)。在本發(fā)明中包括了在候選基因的非編碼區(qū)或編碼區(qū)或者其組合中的突變。在一個實(shí)施方案中，通過遺傳改造將一個或一個以上的突變引入基因的編碼區(qū)。在另一個實(shí)施方案中，通過遺傳改造將一個或一個以上的突變引入編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因的編碼區(qū)。
一個適宜的編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因的例子是編碼彈狀病毒的基質(zhì)蛋白(或M蛋白)的基因。已廣泛研究了來自VSV的M蛋白，并且顯示出其是數(shù)種關(guān)鍵的病毒功能所需的多功能蛋白，所述功能包括出芽(Jayakar等，2000，J Virol，74(21)9818～9827)、病毒體裝配(Newcomb等，1982，J Virol，41(3)1055～1062)、細(xì)胞病理效應(yīng)(Blondel等，1990，J Virol，64(4)1716～1725)以及抑制宿主基因表達(dá)(Lyles等，1996，Virology 225(1)172～180)。在本文中也顯示了后一種性質(zhì)是由于抑制了蛋白和mRNA進(jìn)出宿主細(xì)胞核的核轉(zhuǎn)運(yùn)。可在編碼VSV的M蛋白的基因中進(jìn)行的適宜突變的例子包括但不限于，在編碼區(qū)中插入異源核酸、在編碼區(qū)中缺失一個或一個以上的核苷酸、或在M蛋白的33、51、52、53、54、221、226位點(diǎn)產(chǎn)生導(dǎo)致一個或一個以上的氨基酸殘基發(fā)生置換或缺失的突變，或者它們的組合。
已顯示VSV的M蛋白的氨基末端使該蛋白靶向線粒體，這可能有助于該蛋白的細(xì)胞毒性。因此，在該蛋白的該區(qū)域引入突變可以導(dǎo)致病毒毒性的加強(qiáng)或減弱。在編碼該蛋白N-端的M蛋白基因區(qū)域中產(chǎn)生適宜突變的例子包括但不限于，導(dǎo)致在該蛋白的前(N-末端)72個氨基酸中產(chǎn)生一個或一個以上缺失、插入或置換的那些突變。
以上提到的氨基酸數(shù)字描述了在VSV的印第安納株的M蛋白中的位置。來自其它VSV株系和彈狀病毒科的M蛋白的氨基酸序列與印第安納VSV的M蛋白的氨基酸序列可能會由于導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸編號產(chǎn)生微小差別的數(shù)個氨基酸的存在或缺失而稍有不同，這一點(diǎn)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和軟件(例如在國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information)的網(wǎng)站上可獲得的BLASTX程序)，將相關(guān)蛋白的序列與印第安納VSV的M蛋白的序列進(jìn)行比對，以確定與本文描述的那些突變相對應(yīng)的適當(dāng)突變氨基酸，這些工作對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很容易進(jìn)行的。由此確定的氨基酸是根據(jù)本發(fā)明的突變的候選氨基酸。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述的突變病毒是在編碼M蛋白的基因中引入了以下一個或一個以上突變的VSV(標(biāo)記方法是野生型氨基酸/氨基酸位置/突變的氨基酸，符號Δ表示缺失，而X表示任何氨基酸)M51R、M51A、M51-54A、ΔM51、ΔM51-54、ΔM51-57、V221F、S226R、ΔV221-S226、M51X、V221X、S226X，或者它們的組合。在另一個實(shí)施方案中，所述的突變病毒是在編碼M蛋白的基因中引入了以下突變組合之一的VSV雙突變M51R和V221F、M51A和V221F、M51-54A和V221F、ΔM51和V221F、ΔM51-54和V221F、ΔM51-57和V221F、M51R和S226R、M51A和S226R、M51-54A和S226R、ΔM51和S226R、ΔM51-54和S226R、ΔM51-57和S226R；三重突變M51R、V221F和S226R，M51A、V221F和S226R，M51-54A、V221F和S226R，ΔM51、V221F和S226R，ΔM51-54、V221F和S226R，ΔM51-57、V221F和S226R。突變的M蛋白的例子在圖6中描述。
本發(fā)明還涉及分離的核酸分子(DNA或RNA)，該核酸分子具有所述突變病毒的序列或其片段以及與其互補(bǔ)的序列。這些序列在產(chǎn)生重組的突變病毒中是有用的，或作為引物或探針。在一個實(shí)施方案中，提供分離的核酸分子，該核酸分子具有突變VSV的序列或其片段以及與其互補(bǔ)的序列。在另一個實(shí)施方案中，提供分離的核酸分子，該核酸分子具有在M蛋白中具有一個或一個以上突變的VSV序列或其片段以及與其互補(bǔ)的序列。
2.測試突變病毒根據(jù)本發(fā)明，所述的突變病毒的特征為當(dāng)與野生型病毒相比時，其阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力下降。該能力的缺失可以導(dǎo)致該突變病毒表現(xiàn)出降低的溶細(xì)胞活性和/或?qū)е略撏蛔儾《疽l(fā)細(xì)胞的抗病毒系統(tǒng)，而所述的溶細(xì)胞活性和/或引發(fā)抗病毒系統(tǒng)通常是被野生型病毒阻斷的。
2.1體外測試可以體外篩選降低的或喪失的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力的候選突變病毒。例如，可用候選突變病毒感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞系，可收集該細(xì)胞，并分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組分。從這些各組分中分離mRNA，并通過諸如RT-PCR、Northern印跡或微矩陣分析等本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行測定。然后可以將所述的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組分的mRNA含量與適宜的對照進(jìn)行比較，所述對照例如用野生型病毒感染的細(xì)胞和/或模擬感染的細(xì)胞的類似細(xì)胞組分的mRNA含量。
選擇性地，可用用原位雜交分析方法來測試候選突變病毒。可以使用本身具有或通過遺傳改造而具有短半壽期的一種或一種以上的靶mRNA來建立該分析方法。然后采用原位雜交在此前用候選突變病毒感染的細(xì)胞中檢測所述的靶mRNA。在感染后的細(xì)胞質(zhì)中檢測到所述靶mRNA表明，當(dāng)與未感染對照和/或用野生型病毒感染的對照相比時，候選病毒阻斷mRNA由細(xì)胞核運(yùn)出的能力下降了。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易對這種類型的分析方法進(jìn)行修改以適應(yīng)高通量篩選。
類似地，使用通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行遺傳改造以表達(dá)由具有短半壽期的mRNA編碼的熒光蛋白的細(xì)胞系，可以建立測試突變病毒的分析方法。然后用野生型病毒和候選突變病毒單獨(dú)感染來自所述經(jīng)遺傳改造的細(xì)胞系的細(xì)胞，并用公認(rèn)的技術(shù)監(jiān)測熒光。在被野生型病毒感染的細(xì)胞中，由于新產(chǎn)生的編碼熒光蛋白的mRNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)被該病毒阻斷，其熒光將喪失。另一方面，具有降低的阻斷mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)能力的突變病毒將在較長的時間內(nèi)發(fā)出熒光。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易對這種類型的分析方法進(jìn)行修改以適應(yīng)高通量篩選。
在用突變病毒感染的細(xì)胞中，在其細(xì)胞質(zhì)中將檢測到比用野生型病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)更多的特定的參考mRNA。根據(jù)本發(fā)明，用突變病毒感染細(xì)胞將導(dǎo)致在該細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的參考mRNA的量比用野生型病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的量至少增加20倍。在一個實(shí)施方案中，用突變病毒感染細(xì)胞將導(dǎo)致在該細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的參考mRNA的量至少增加50倍。在其它實(shí)施方案中，所述的增加是100倍、250倍、500倍或至少1000倍。
如上所述，所述的突變病毒可以在受感染細(xì)胞中引發(fā)通常被野生型病毒阻斷或避開的抗病毒系統(tǒng)。因此，可以基于與野生型病毒相比，候選突變病毒在具有完整的抗病毒系統(tǒng)的細(xì)胞上生長欠佳而對它們進(jìn)行篩選。突變病毒應(yīng)該能夠在抗病毒系統(tǒng)的一個或多個成分中存在缺陷的細(xì)胞上生長得與野生型病毒一樣好。例如，引發(fā)干擾素系統(tǒng)的突變病毒在干擾素應(yīng)答細(xì)胞上生長不良，但在諸如腫瘤細(xì)胞等干擾素應(yīng)答喪失的細(xì)胞上，該突變病毒應(yīng)該與野生型病毒生長得一樣好。還可以通過用例如Western印跡分析、Northern分析或微矩陣分析等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，分析受感染細(xì)胞中編碼抗病毒應(yīng)答的成分的那些基因的表達(dá)，并將表達(dá)水平與適當(dāng)?shù)膶φ者M(jìn)行比較，測定突變病毒在細(xì)胞中引發(fā)抗病毒系統(tǒng)的能力。
引發(fā)抗病毒系統(tǒng)應(yīng)答的突變病毒還能夠防止野生型病毒對鄰近細(xì)胞的感染。這種能力可以通過使用該突變體和野生型病毒以及通常容易受到所述野生型病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行共感染實(shí)驗(yàn)并測定野生型病毒在所述共感染細(xì)胞中的生長來測試。本領(lǐng)域已知實(shí)施共感染實(shí)驗(yàn)的方法。
2.2體內(nèi)測試一旦確定適當(dāng)?shù)耐蛔儾《?，可以使用適宜的動物模型通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來評價該突變病毒的效力和毒性。
例如，可以通過進(jìn)行LD50測試來測定毒性。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述突變病毒具有比野生型病毒高約10倍～10,000倍的LD50?？蛇x擇地，可以用不同濃度的突變病毒處理適宜的動物模型，然后在適當(dāng)?shù)臅r期內(nèi)，可以通過監(jiān)測該動物的總體健康狀況和體重來對該病毒的毒效進(jìn)行評價。評價期過后，可以將動物殺死，并測定相關(guān)器官的外觀和重量。適宜的動物模型的例子包括但不限于，Balb/C小鼠和CD-1小鼠。其它適宜的動物模型的例子包括那些尤其是容易受到野生型病毒感染的動物模型，例如那些在抗病毒應(yīng)答的成分中存在缺陷的動物模型。PKR-/-小鼠是一個例子，該小鼠已被證明對VSV感染極度敏感。
突變病毒引發(fā)抗病毒應(yīng)答的能力可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行體內(nèi)測試。例如，可以使用該突變病毒處理動物，然后用野生型病毒或第二病毒進(jìn)行攻擊?？梢詫⑦@些動物中的存活情況與以前沒有接受突變病毒處理的對照組進(jìn)行比較。
如上所述，引發(fā)免疫應(yīng)答的突變病毒還能夠保護(hù)受試對象不受到野生型病毒的同時共感染。為了評價突變病毒的這種保護(hù)效果，可以針對被野生型病毒和突變病毒共感染的動物進(jìn)行抗病毒應(yīng)答和毒性概況測試，并可以將其與被野生型病毒單獨(dú)感染的動物進(jìn)行比較。
用途本發(fā)明的突變病毒對大范圍的應(yīng)用是有用的，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。以下提供的是非限制性實(shí)施例。
1.病毒載體本發(fā)明提供本發(fā)明的突變病毒作為病毒載體的用途。當(dāng)用作病毒載體時，對突變病毒進(jìn)行改造，以加入至少一個編碼治療活性分子的異源核酸序列?？梢詫⒃摬《据d體用于受感染細(xì)胞，然后使該細(xì)胞表達(dá)由所述異源核酸序列編碼的治療活性分子。因此病毒載體可以用于將異源核酸遞送到受試對象的細(xì)胞中，以在體內(nèi)表達(dá)該治療活性分子。
加入到病毒載體中的異源核酸序列可以通過例如使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)取自基因組DNA、cDNA或RNA，或者其可以通過本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行化學(xué)合成?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的和在本文或其它地方描述的方法，將所述核酸序列插入到病毒基因組中的非必需區(qū)域或基因，或插入到編碼涉及阻斷細(xì)胞核mRNA或蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白的基因中。
為了本發(fā)明目的，由異源核酸序列編碼的治療活性分子可以是諸如當(dāng)在細(xì)胞中得以表達(dá)時對該細(xì)胞補(bǔ)充或提供其缺乏的活性的蛋白，從而使細(xì)胞能夠?qū)共±韺W(xué)病癥。這樣的蛋白包括但不限于，酶、血液衍生物、激素、淋巴因子、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)、營養(yǎng)因子、載脂蛋白和腫瘤抑制基因、病毒或腫瘤特異性抗原或抗原表位、免疫調(diào)節(jié)劑、干擾素調(diào)控因子、細(xì)胞因子和自殺基因。那些本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，插入的異源DNA/RNA可以進(jìn)一步包括啟動子、增強(qiáng)子、終止子、多聚腺苷酸信號、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)和其它由該DNA或RNA編碼的基因的有效表達(dá)所需的調(diào)控元件?？蛇x擇地，異源核酸的表達(dá)可以完全或部分地依賴于該病毒載體的內(nèi)源調(diào)控序列。
本發(fā)明還考慮編碼反義寡核苷酸、核糖酶或siRNAs(小分子干擾RNA)的異源核酸。這些序列在靶細(xì)胞的表達(dá)使得細(xì)胞基因的表達(dá)和/或細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)錄受到控制。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，用作病毒載體的突變病毒是突變的彈狀病毒。在另一個實(shí)施方案中，該突變病毒是在其M蛋白中含有一個或一個以上突變的彈狀病毒。在另一個實(shí)施方案中，該突變病毒是在其M蛋白中包含一個或一個以上突變的VSV。
當(dāng)被用作病毒載體時，本發(fā)明的突變病毒可以用以對離體(ex vivo)的供體細(xì)胞進(jìn)行改造，然后再將經(jīng)改造的細(xì)胞返回到該供體或另一個患者中，或者本發(fā)明的突變病毒可以用以對患者細(xì)胞進(jìn)行體外改造。這種方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，將病毒載體作為“基因治療性載體”，用以將編碼蛋白的異源核酸遞送到受試對象中，當(dāng)所述蛋白在該受試對象的細(xì)胞中得以表達(dá)時，補(bǔ)充或提供否則在該細(xì)胞會缺乏的活性。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，將所述病毒載體用作疫苗載體，該疫苗載體攜帶有編碼一個或一個以上抗原的異源核酸序列，并被用于對個體進(jìn)行免疫以抗疾病和/或感染。所述抗原可以是例如腫瘤、病毒或細(xì)菌抗原。也可以考慮將該病毒載體作為“多價”疫苗載體的用途，其中，該載體包含抗不同生物體的抗原，因而提供抗一種以上疾病或抗一種以上生物體的感染的免疫。
將引發(fā)宿主細(xì)胞諸如產(chǎn)生各種細(xì)胞因子等抗病毒系統(tǒng)的突變病毒作為疫苗病毒尤其有用。細(xì)胞因子的誘導(dǎo)可以導(dǎo)致刺激體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而提高病毒載體的效力。
當(dāng)將本發(fā)明的突變病毒用作疫苗載體時，施用給受試對象的有效量將因編碼的抗原，受試對象的年齡、體重和性別，以及施用方式而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定用于免疫特定受試對象所需的劑量。
為了評價本發(fā)明的突變病毒作為疫苗載體的效力，可以進(jìn)行攻擊研究。該攻擊研究通常使用實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行，并包括通過諸如鼻內(nèi)方式和肌肉內(nèi)方式等各種技術(shù)用突變病毒對各組動物進(jìn)行接種。應(yīng)該平行建立用于對突變病毒效力進(jìn)行比較的對照組。對照組可以包括沒有接種的動物和接種有例如商購的可供選擇的疫苗的動物。接種后經(jīng)過適當(dāng)?shù)臅r期，用病原物(即微生物、病毒或腫瘤細(xì)胞)攻擊該動物。然后從接種前的動物和接種后的動物以及攻擊后的動物收集血樣，并分析對病原物的抗體應(yīng)答。用于抗體應(yīng)答的適宜的測試包括但不限于，Western印跡分析和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)?？蛇x擇地，當(dāng)用腫瘤細(xì)胞對動物進(jìn)行攻擊時，例如通過監(jiān)測腫瘤尺寸或重量的增加來監(jiān)測腫瘤細(xì)胞的生長。
也可以通過諸如淋巴細(xì)胞母細(xì)胞形成技術(shù)監(jiān)測細(xì)胞免疫(T淋巴細(xì)胞)的誘導(dǎo)和通過干擾素釋放技術(shù)監(jiān)測細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，來對細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行評價。
2.溶瘤劑如本領(lǐng)域所已知的那樣，一些病毒能夠充當(dāng)選擇性溶瘤劑。例子包括VSV、新城疫病毒、微小病毒H-1和一些改造的病毒如ONYX-015人腺病毒(參見，例如國際PCT申請WO 01/19380和WO 00/62735和Bell，JC，Lichty BD和Stojdl D.，2003 Cancer Cell 47～11)。溶瘤病毒抑制腫瘤細(xì)胞生長的效果部分在于腫瘤細(xì)胞對病毒感染具有與正常細(xì)胞不同的易感性。癌細(xì)胞在生長抑制或凋亡途徑中獲得突變，從而與它們的正常對應(yīng)細(xì)胞相比具有存活優(yōu)勢。在腫瘤進(jìn)化過程中，經(jīng)常選擇的一個缺陷是干擾素(IFN)應(yīng)答的缺失。干擾素也是個體細(xì)胞的抗病毒應(yīng)答的一個重要介質(zhì)，因而獲得突變而使得它們逃避干擾素介導(dǎo)的生長控制程序的腫瘤細(xì)胞將同時損害它們的先天性抗病毒應(yīng)答。
在先天性抗病毒應(yīng)答受到損害的這種細(xì)胞中，阻斷mRNA或蛋白核輸出的能力的缺失將不影響突變病毒在該細(xì)胞中的復(fù)制能力。本發(fā)明的突變病毒能夠在受感染細(xì)胞中引發(fā)抗病毒系統(tǒng)，同時保持對這些抗病毒系統(tǒng)的敏感，因而將能夠在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行選擇性復(fù)制，并且抑制腫瘤細(xì)胞的生長或殺死腫瘤細(xì)胞，但是不能在正常細(xì)胞中復(fù)制。因此，本發(fā)明提供突變病毒作為改善的溶瘤劑的用途。
應(yīng)該理解，涉及阻斷核mRNA或蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)的病毒蛋白還可以對受感染細(xì)胞具有其它作用。例如，已經(jīng)證明VSV的M蛋白對于將蛋白靶向受感染細(xì)胞的線粒體而引起細(xì)胞毒性作用是重要的。還有，已證明M蛋白與宿主的蛋白TSG101相互作用，以提高后代病毒體從受感染細(xì)胞中出芽。
因此，本發(fā)明提供在其M蛋白中具有一個或一個以上突變的重組的突變的彈狀病毒，所述的突變不但降低突變病毒阻斷核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，還改變M蛋白與宿主細(xì)胞的線粒體的相互作用。已經(jīng)證明，VSV的M蛋白的N末端對該蛋白靶向受感染細(xì)胞的線粒體是重要的。在該蛋白的這個區(qū)域的突變增強(qiáng)或廢除這種定位，因此將調(diào)節(jié)病毒載體的細(xì)胞毒性特性。突變病毒的細(xì)胞毒性可以被增強(qiáng)或降低，這取決于所引入的突變。通過改造而在M蛋白中具有一個或一個以上的突變從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性得以增強(qiáng)的那些突變病毒將是特別有效的溶瘤劑。
本發(fā)明進(jìn)一步考慮在M蛋白中具有一個或一個以上突變的重組的彈狀病毒的用途，所述突變改變了病毒與宿主蛋白TSG101的相互作用。TSG101是腫瘤抑制蛋白，該蛋白的表達(dá)和功能在惡性細(xì)胞中經(jīng)常被改變。將干擾這種相互作用的突變引入M蛋白中，可以產(chǎn)生在腫瘤細(xì)胞中更有效地進(jìn)行復(fù)制的重組病毒，導(dǎo)致更有效的溶瘤劑的產(chǎn)生。
使用標(biāo)準(zhǔn)的異種移植腫瘤模型，可以測定本發(fā)明的突變病毒的溶瘤活性，在該模型中，人類腫瘤已經(jīng)被植入免疫受損的動物中。人類癌癥的異種移植模型的例子包括但不限于，通過皮下注射到小鼠中的人實(shí)體瘤異種移植體，其被用于腫瘤生長測定；通過脂墊注射到小鼠中的人實(shí)體瘤同基因移植體，其被用于腫瘤生長測定；小鼠中的淋巴瘤和白血病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，其被用于存活測定中；以及小鼠中的肺轉(zhuǎn)移癌的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 可以通過比較用突變病毒處理和未處理對照的異種移植動物中的腫瘤生長情況，測試突變病毒的溶瘤活性。也可以使用用野生型溶瘤病毒感染的對照動物?？梢詫⑼蛔儾《局苯邮┯糜谀[瘤或進(jìn)行全身施用，或?qū)⑵溆靡愿腥倦x體細(xì)胞，然后將該細(xì)胞施用到動物中。還可以將通過皮下注射或靜脈內(nèi)注射(以形成肺腫瘤)形成腫瘤的同基因小鼠模型系統(tǒng)用于測試突變病毒的溶瘤活性。
3.疫苗佐劑能夠在宿主細(xì)胞中引發(fā)抗病毒系統(tǒng)的本發(fā)明突變病毒是疫苗佐劑的理想候選者。如本領(lǐng)域已知的那樣，許多抗原的免疫原性不強(qiáng)，并且，當(dāng)其被用作疫苗時，為了刺激受試對象產(chǎn)生強(qiáng)的免疫應(yīng)答，需要加入佐劑。本發(fā)明考慮突變病毒作為疫苗佐劑的用途，以通過引發(fā)宿主的抗病毒應(yīng)答從而增強(qiáng)該疫苗的免疫原性。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，突變病毒通過刺激產(chǎn)生干擾素和其它細(xì)胞因子而充當(dāng)疫苗佐劑。
4.藥學(xué)制劑中的保護(hù)劑如上所述，引發(fā)其感染的細(xì)胞的抗病毒系統(tǒng)的本發(fā)明突變病毒，可以限制野生型病毒和企圖感染鄰近細(xì)胞的其它病毒的復(fù)制。因此，用這些突變病毒對細(xì)胞進(jìn)行的感染不僅可以自我限制，而且還防止回復(fù)體的出現(xiàn)。因此，該突變病毒可以用作藥物病毒制劑的添加劑，其可以防止烈性回復(fù)體在該制劑的生產(chǎn)過程中或?qū)⒃撝苿┦┯糜谑茉噷ο蠛笤谠撝苿┲谐霈F(xiàn)。
5.其它治療性應(yīng)用如上所述，本發(fā)明的突變病毒引發(fā)宿主細(xì)胞的抗病毒系統(tǒng)，從而導(dǎo)致各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，這些病毒可以用于諸如癌癥、自體免疫疾病以及細(xì)菌、病毒和真菌感染等疾病或異常的治療中，所述的疾病或異?？梢杂杉?xì)胞因子的釋放而得到緩解。
6.其它溶細(xì)胞應(yīng)用如本領(lǐng)域已知的那樣，諸如HIV和HCV的許多病毒，將受感染細(xì)胞的抗病毒系統(tǒng)下調(diào)。諸如痘病毒、BVDV(牛病毒性腹瀉病毒)、布尼亞病毒科、輪狀病毒、流感病毒和HPV(單純皰疹病毒)等其它病毒，作為它們的復(fù)制周期的一部分而阻斷宿主細(xì)胞的抗病毒應(yīng)答。結(jié)果，被這些病毒中的一種感染的細(xì)胞對本發(fā)明突變病毒的感染可以具有增強(qiáng)的易感性。如上所述，在抗病毒應(yīng)答受到損害的細(xì)胞中，突變病毒仍可以復(fù)制。因此，本發(fā)明的突變病毒可以被用作，該溶細(xì)胞劑可以在受感染細(xì)胞中進(jìn)行選擇性復(fù)制，并殺死該受感染細(xì)胞。
藥物組合物本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明病毒和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
所述藥物組合物可以以水性懸浮液的形式存在，該水性懸浮液含有與適當(dāng)?shù)馁x形劑混合的突變病毒，所述賦形劑包括但不限于，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯膠等懸浮劑，諸如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)等的分散劑或潤濕劑，所述水性懸浮液還可以含有一種和一種以上的防腐劑，例如乙基(ethyl)、正丙基對羥基苯甲酸酯。所述的藥物組合物可以以無菌的可注射懸浮液形式存在。該懸浮液可以用適宜的分散劑或潤濕劑和諸如上述的那些懸浮劑，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行配制。所述無菌的可注射制劑還可以是無毒的相互(parentally)可接受的稀釋劑或溶劑的無菌的可注射的溶液或懸浮液?？梢允褂玫目山邮艿妮d體和溶劑包括但不限于，水、林格氏溶液、乳酸化的林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。
其它的藥物組合物和制備藥物組合物的方法是本領(lǐng)域已知的和記載于，例如，“RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy”(更正式的名稱為“Remingtons Pharmaceutical Sciences”)；Gennaro，A.，Lippincott，Williams & Wilkins，Philidephia，PA(2000)。
試劑盒本發(fā)明提供含有本發(fā)明突變病毒的試劑盒以用于免疫接種；和含有本發(fā)明的突變病毒的試劑盒，所述的病毒攜帶有一個或一個以上的異源基因，以用作載體而將一個或一個以上的異源基因遞送到受到對象中。所述的突變病毒可以以藥物組合物的形式提供在試劑盒中。試劑盒中的各個組分可以包裝在不同或相同的容器中，并且與該容器放在一起的可以是政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式的通知，所述政府機(jī)構(gòu)管理藥物或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售，所述通知可以反映該機(jī)構(gòu)對用于動物或人施用的生產(chǎn)、使用或銷售的許可。
所述的試劑盒的組分還可以以干燥的或凍干的形式來提供，而且該試劑盒可以另外含有用于凍干組分的恢復(fù)的適宜溶劑。不管容器的數(shù)量或類型怎樣，本發(fā)明的試劑盒還可以包括幫助將該組合物施用于受試對象的器械。該器械可以是吸入器、注射器、移液管、滴眼器或類似的藥學(xué)上允許的遞送工具。
實(shí)施例實(shí)施例1在INF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)閉中具有缺陷的溶瘤VSV株材料和方法病毒在本研究的整個過程中使用印第安納血清型的VSV，并將該病毒培養(yǎng)在L929細(xì)胞中。在本研究中顯示的T1026R(Desforges等，2001，VirusResearch 76(1)87～102)和TP3(Desforges等，2001，同上)分別指AV1(或Mut2)和AV2(或Mut3)。其它地方是野生型的印第安納VSV的HR株的IFN誘導(dǎo)型突變體(Francoeur等，1987，Virology 160(1)236～245)。
IFN產(chǎn)生的ELISA使用人α干擾素ELISA試劑盒(PBL Biomedical)，按照生產(chǎn)商的說明，測定細(xì)胞培養(yǎng)基中α干擾素的水平。簡言之，在感染后48小時收集100μl的培養(yǎng)基，將其與生產(chǎn)商提供的空白和標(biāo)準(zhǔn)一起培養(yǎng)在96孔的微滴定板中。按照生產(chǎn)商的說明書對樣品進(jìn)行處理，然后在450nm于DYNEXTM讀板器上讀數(shù)。
VSV突變病毒的體內(nèi)毒性的測定將8～10周齡的雌性小鼠(如上所述的品系)分成每組5個，并按照所示方法用1對數(shù)和1/2對數(shù)稀釋的1×1010Pfu～1×102Pfu病毒(取決于病毒的株系和小鼠的品系)進(jìn)行感染。對動物的體重下降、脫水、毛發(fā)的豎起、蜷縮行為、呼吸窘迫和后肢癱瘓進(jìn)行監(jiān)測。按照CCAS規(guī)定的優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)操作，對出現(xiàn)中度到重度發(fā)病的小時實(shí)施安樂死。用Karber-Spearman方法計(jì)算致死劑量50的值。
用104Pfu的WT VSV、AV1或AV2對4周齡的Balb/C小鼠或α干擾素受體敲除的Balb/C小鼠(IFNAR-/-)(Steinhoff等，1995，J.Virol.，692153～2158)進(jìn)行鼻內(nèi)感染。對小鼠的發(fā)病癥狀進(jìn)行監(jiān)測，并對出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸窘迫癥狀的小鼠實(shí)施安樂死。
測定野生型和突變VSV株的混合樣品的體內(nèi)毒性事先已確定Balb/C PKR-/-小鼠對LD100為約10pfu的WT VSV的鼻內(nèi)感染高度敏感(Stojdl等，2000，J.Virol.，799580～9585)。用WT、AV2、或這些株系的混合物通過鼻內(nèi)滴注來感染各組小鼠，每組3只。監(jiān)測小鼠的發(fā)病癥狀，并且當(dāng)出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸窘迫或后肢癱瘓癥狀時，對小鼠實(shí)施安樂死。
無胸腺小鼠中的卵巢異種移植癌模型將約1×106的ES-2人卵巢癌細(xì)胞注入CD-1無胸腺小鼠的腹膜腔內(nèi)。在細(xì)胞注射后15天逐漸看到腹水的形成。在第12天、14天和16天，用1×109的AV2病毒或1×109pfu的UV滅活的AV2VSV病毒通過腹膜內(nèi)注射對小鼠進(jìn)行處理。監(jiān)測小鼠的發(fā)病率，并對形成腹水的小鼠實(shí)施安樂死。
皮下腫瘤模型為了形成皮下腫瘤，將8～10周齡的Balb/C的雌性小鼠的右脅腹的毛剃掉，并注射1×106的與Balb/C小鼠同基因的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞(Kashtan等，1992，Surg Oncol 1(3)251～256)。使這些腫瘤發(fā)展到約10mm3，此時開始用病毒進(jìn)行處理。隔天讓各組動物接受1、6或12劑量的所示病毒。通過尾靜脈注射施用5×108pfu的各劑量。每天對腫瘤進(jìn)行測量，用公式1/2(L×W×H)計(jì)算其體積。每天對小鼠進(jìn)行稱重，并對體重下降、脫水、毛發(fā)的豎起、蜷縮行為、呼吸窘迫和后肢癱瘓進(jìn)行監(jiān)測。當(dāng)動物的腫瘤負(fù)荷達(dá)到終點(diǎn)(750mm3)時，對動物實(shí)施安樂死。
肺模型在8～10周齡的雌性Balb/C小鼠中，通過尾靜脈注射3×105的CT26細(xì)胞(Specht等，1997，J Exp Med 186(8)1213～1221)來形成肺腫瘤。在第10天、12天、14天、17天、19天和21天，按其他地方所記載的方法(Stojdl等，2000，Journal of Virology 74(20)9580～9585)通過鼻內(nèi)滴注使各組小鼠接受5×107pfu的所示病毒。每天對小鼠進(jìn)行稱重，并對體重下降、脫水、毛發(fā)的豎起、蜷縮行為、呼吸窘迫和后肢癱瘓進(jìn)行監(jiān)測。當(dāng)動物出現(xiàn)呼吸窘迫并確認(rèn)它們的肺有腫瘤形成時，對它們實(shí)施安樂死。
MTS測試在各實(shí)驗(yàn)中，將各待測細(xì)胞系接種入96孔板的生長培養(yǎng)基(DMEM-F12-HAM+10％FBS)中，每孔3×104個細(xì)胞。過夜培養(yǎng)(37℃，5％CO2)后，通過抽吸將培養(yǎng)基移出，將20μl的含有從3×106pfu/孔到3pfu/孔以10倍遞增的病毒的培養(yǎng)基(α-MEM，不含血清)或不含病毒的陰性對照培養(yǎng)基加到各板孔中。測試的各病毒劑量進(jìn)行6個重復(fù)。培養(yǎng)60分鐘以使病毒附著后，在各板孔中加入80μl的生長培養(yǎng)基，并將孔板再培養(yǎng)48小時。用CellTitre 96TMAQueous試劑(Promega公司)測試細(xì)胞的生存力，所述試劑使用四唑化合物(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑，內(nèi)鹽；MTS)和電子偶聯(lián)試劑(吩嗪硫酸甲酯，PMS)。MTS被細(xì)胞生物還原為溶于組織培養(yǎng)基的甲臢產(chǎn)物。甲臢產(chǎn)物在490nm的吸光值可以直接從96孔測試板進(jìn)行測定。在490nm的吸光值測定的甲臢產(chǎn)物的量直接與培養(yǎng)物中活細(xì)胞的數(shù)量成比例。
微矩陣分析在PBS中收獲模擬處理的或用野生型(WT)和突變VSV株感染的OVCAR4細(xì)胞，將其沉淀并懸浮在250μl的重懸浮緩沖液(10mM的TrispH7.4，15mM的NaCl，12.5mM的MgCl2)中。加入600μl的裂解緩沖液(25mM的Tris pH7.4，15mM的NaCl，12.5mM的MgCl2，5％的蔗糖和1％的NP-40)，在4℃培養(yǎng)裂解物10分鐘，并不時地進(jìn)行渦旋振蕩。在1000×g離心3分鐘，收集細(xì)胞核。收集上清液(細(xì)胞質(zhì)組分)，并在-80℃冷凍，而用250μl的裂解緩沖液洗滌沉淀(細(xì)胞核組分)一次，并將其進(jìn)行冷凍。用Qiagen RNeasyTM試劑盒(按照生產(chǎn)商的說明書，Qiagen，Mississauga，加拿大)從細(xì)胞核組分和細(xì)胞質(zhì)組分中提取總RNA，然后通過LiCl沉淀來濃縮各樣品。按照生產(chǎn)商的標(biāo)準(zhǔn)程序(Affymetrix，Santa Clara CA，美國)對20μg的各RNA樣品進(jìn)行處理，并與AffymetrixGeneChipTM人類基因組U133A矩陣(HG U133A芯片)雜交。將各芯片標(biāo)到1500，以存在于各HG U133A芯片中的100個標(biāo)準(zhǔn)化對照基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后再在各基因的基礎(chǔ)上按照模擬的細(xì)胞核樣品對所有的細(xì)胞核樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并且將細(xì)胞質(zhì)組分按照相應(yīng)的模擬的細(xì)胞質(zhì)樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。用GenespringTM軟件(Silicon Genetics，Redwood City CA，美國)分析數(shù)據(jù)。
Western印跡使OVCAR4細(xì)胞生長在添加有10％胎牛血清(Wisent)的RPMI(Wisent)中。在感染的前一天，將1.0×107的細(xì)胞鋪到10cm的培養(yǎng)皿中。感染結(jié)束時，移出培養(yǎng)基，僅用RPMI替換，然后加入5×107pfu的VSV病毒株。加入病毒后1小時，移出培養(yǎng)基，并在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)持續(xù)時間中用添加有10％的FBS的RPMI替換。在標(biāo)準(zhǔn)的NP-40裂解緩沖液中裂解細(xì)胞，將75μl的全細(xì)胞提取物在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上跑電泳。并用以下所示抗體進(jìn)行印跡分析IRF-7(sc-9083)、IRF-3(sc-9082)、ISG56(Gene Sen的贈品)、VSV-N(定向抗印第安納N蛋白全長的多克隆抗體)和肌動蛋白(sc-8432)。
構(gòu)建體和病毒拯救以前已在其它地方(Lin等，2000，J.Biol.Chem.，27534320～34327)記載了具有組成型活性的IRF-7Δ(IRF-7Δ247-467)的產(chǎn)生。用針對標(biāo)記(Flag)表位的具有額外的5’VSV帽信號和Xho1連接序列的正向引物5’-ATCGCTCGAGAACAGATGACTACAAAGACGATGACGACAAG-3(SEQ ID NO7)和含有VSV多聚A信號和Nhe1連接序列的特異的IRF-7反向引物
5’-ATCGGCTAGCAGTTTTTTTCAGGGATCCAGCTCTAGGTGGGCTGC-3’(SEQ ID NO8)通過PCR擴(kuò)增RF-7Δ247-467。
然后將PCR片段克隆到rVSV復(fù)制子載體pVSV-XN2(由John Rose提供)的Xho1和Nhe1位點(diǎn)中。以前已有rVSV回收的記載(Lawson等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，924477～4481)。
β干擾素的mRNA的定量PCR按照生產(chǎn)商的說明(RNeasy，Qiagen，Mississauga，加拿大)，從感染的或模擬感染的OVCAR4細(xì)胞中分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的總RNA。對4μg的總RNA進(jìn)行DNase處理，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用Roche LightcyclerTM技術(shù)(Roche Diagnostics，Laval，加拿大)進(jìn)行三次定量PCR以從各樣品中擴(kuò)增出IFN-β和次黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HPRT)目標(biāo)?；卺槍Ω髂繕?biāo)復(fù)制子所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將交叉點(diǎn)轉(zhuǎn)換為絕對數(shù)值。然后根據(jù)HPRT對IFN-β信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，因?yàn)樵谶@些感染的過程中，HPRT水平?jīng)]有發(fā)生變化，數(shù)據(jù)未示出。用于擴(kuò)增IFN-β的引物如下正義5’-TTGTGCTTCTCCACTACAGC-3’(SEQ ID NO9)；反義5’-CTGTAAGTCTGTTAATGAAG-3’(SEQ ID NO10)和HPRT引物正義5’-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3’(SEQ ID NO11)；反義5’-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3’(SEQ ID NO12)α干擾素和干擾素刺激的基因的RT-PCR用WT或突變的VSV株(MOI 10，其中，MOI是指感染復(fù)數(shù)，其為感染性病毒顆粒與細(xì)胞的比率)感染培養(yǎng)在添加有10％FBS的F12K培養(yǎng)基中的A549細(xì)胞。在感染后4小時，按照生產(chǎn)商的說明書，使用Trizol(Invitrogen)提取RNA。用寡聚的dT引物對1μg的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在Taq PCR中使用5％的RT作為模板。所使用的引物如下Mx正向引物5’-ATG GTT GTT TCC GAA GTG GAC-3’(SEQ IDNO13)；Mx反向引物5’-TTT CTT CAG TTT CAG CAC CAG-3’(SEQ IDNO14)；VSV N正向引物5’-ATG TCT GTT ACA GTC AAG AGA ATC-3’(SEQ ID NO15)；VSV N反向引物5’-TCA TTT GTC AAA TTC TGA CTT AGCATA-3’(SEQ ID NO16)；RANTES正向引物5’-TAC ACC AGT GGC AAG TGC TCC AACCCA G-3’(SEQ ID NO17)；RANTES反向引物5’-GTC TCG AAC TCC TGA CCT CAA GTGATC C-3’(SEQ ID NO18)；β肌動蛋白正向引物5’-ACA ATG AGC TGC TGG TGG CT-3’(SEQ ID NO19)；和β肌動蛋白反向引物5’-GAT GGG CAC AGT GTG GGT GA-3’(SEQ ID NO20)。
結(jié)果體內(nèi)VSV的減毒取決于完整的干擾素途徑發(fā)現(xiàn)在干擾素應(yīng)答細(xì)胞(在此指AV1和AV2)上產(chǎn)生小噬菌斑的兩個VSV變體，在感染上皮細(xì)胞系后，誘導(dǎo)的α干擾素(INF-α)比野生型(WT)VSV多20倍～50倍(圖1A)。通過對這些變體的全部基因組進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，它們與野生型株系的區(qū)別在于M蛋白AV1的M蛋白中只有一個氨基酸置換(M51R)，而在AV2的M蛋白中有兩個氨基酸置換(V221F和S226R)。當(dāng)將AV1和AV2通過鼻內(nèi)遞送到Balb/C小鼠中時，所測得的LD50比用同樣方法進(jìn)行遞送的WT VSV的LD50高10000倍(圖1B)。在CD-1小鼠中看到類似的結(jié)果(WT＝1×106，AV1＝2×108pfu)。重要的是，當(dāng)被用于感染干擾素受體敲除動物時，AV1和AV2的毒性與野生型病毒的毒性一樣，表明AV1和AV2體內(nèi)生長的減毒依賴于完整的干擾素系統(tǒng)(圖1C)。而且，當(dāng)與WT VSV組合使用時，發(fā)現(xiàn)突變株AV2防止高度易感小鼠(PKR-/-)免受WT VSV的感染(圖1D)。實(shí)際上，即使用比WT VSV的LD100高100倍的劑量，當(dāng)小鼠受到AV2和WT VSV的同時攻擊時，也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀(脫水、毛發(fā)的豎起、萎靡不振、行動減少、呼吸窘迫和后肢癱瘓)。結(jié)合這些突變體允許干擾素在感染后產(chǎn)生的觀察數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)與以下模型是一致的用VSV的AV1或AV2突變株進(jìn)行的感染在宿主中誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，據(jù)此建立保護(hù)宿主免受病理感染的抗病毒狀態(tài)。
野生型和減毒的VSV突變體均引發(fā)先天性抗病毒應(yīng)答為了測定野生型和減毒病毒誘導(dǎo)或宿主細(xì)胞抗病毒應(yīng)答或使宿主細(xì)胞抗病毒應(yīng)答失活的能力在感染過程中的哪一點(diǎn)發(fā)生差異，首先需要建立宿主細(xì)胞的VSV感染過程中發(fā)生的早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。在病毒感染過程中使用微矩陣分析，應(yīng)該可以檢測到由VSV感染引發(fā)的直接或間接導(dǎo)致抗病毒基因轉(zhuǎn)錄激活的早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。從微矩陣數(shù)據(jù)顯然可以發(fā)現(xiàn)，VSV感染導(dǎo)致大量基因按特定的次序發(fā)生上調(diào)。因此，可以按以下方面對基因進(jìn)行分組即(1)它們隨著時間而上調(diào)的動力學(xué)和(2)它們應(yīng)答WT和突變VSV感染的誘導(dǎo)模式。這些基因群似乎對應(yīng)于3次分開的轉(zhuǎn)錄波(表1和圖2A、B和C)。與此相一致的是，IFN-β、IFN-7和IFN-α亞型彼此分開，屬于不同的基因群。其他組已經(jīng)確定，在針對許多刺激的應(yīng)答中，潛在的轉(zhuǎn)錄因子IRF-3、NFκB和c-JUN/ATF-2被激活，并在IFN-β的啟動子上與CBP/p300組裝在一起，以誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)(Wathelet等，1998，Mol.Cell 1507～518)。還有，已發(fā)現(xiàn)IFN-β以自分泌的方式發(fā)揮作用，以誘導(dǎo)ISGF3轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的激活，而導(dǎo)致IRF-7和其他在其啟動子中含有ISRE元件的基因的誘導(dǎo)(Lu等，2000，J.Biol.Chem.27531805～31812；Zhang和Pagano，1997，Mol.Cell Biol.，175748～5757；Zhang和Pagano，2001，J.Virol.，75341～350)。而且，已證明IFR-7的異位表達(dá)對IFN-α在不能形成ISGF3復(fù)合物的細(xì)胞中的表達(dá)是關(guān)鍵的(Sato等，1998，F(xiàn)EBS Lett.，441106～110)。這種IFN-α誘導(dǎo)對IRF-7的依賴和IRF-7對IFN-β的依賴讓人想起所述矩陣中的基因的動力學(xué)概況。根據(jù)這些觀察資料，推測IFN-β、IRF-7和IFN-α為整體模型中的原型基因，這些基因群似乎與3個分開的轉(zhuǎn)錄波對應(yīng)，各自依賴于前面的轉(zhuǎn)錄波并由前面的轉(zhuǎn)錄波所引發(fā)(表1和圖2A、B和C)。
表1.隨著時間推移對針對VSV感染的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答進(jìn)行的微矩陣分析

數(shù)據(jù)表示相對于模擬感染樣品的倍數(shù)變化，所有樣品都來自受感染細(xì)胞的細(xì)胞核組分。
A＝缺乏(沒有可檢測到的mRNA)；nd＝?jīng)]有數(shù)據(jù)；用線框起來的基因代表“原型基因”，見文中解釋。
WT VSV的M蛋白阻斷β干擾素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而來自AV1和AV2的M蛋白則不能。
為了更好地理解VSV感染的早期轉(zhuǎn)錄應(yīng)答，所以尋求對這些WT和“INF誘導(dǎo)株”應(yīng)答的區(qū)別的理解。通過Western印跡，WT、AV1和AV2病毒引發(fā)IRF-3磷酸化的動力學(xué)似乎相似(圖2E)。而且，在WT、AV1和AV2感染的細(xì)胞中，已發(fā)現(xiàn)直接受轉(zhuǎn)錄因子IRF-3、NFκB和c-JUN/ATF-2調(diào)節(jié)的一些基因被上調(diào)到同一水平(圖2A)。例如，在所有三種病毒感染后3～6小時，初級應(yīng)答基因明顯受到誘導(dǎo)(圖2A、D和E)。另一方面，需要IFN-β產(chǎn)生和JAK/STAT途徑的自分泌激活的次級應(yīng)答基因受到野生型和減毒病毒的誘導(dǎo)是不同的(見圖2B & 2E中的IRF-7)。由于WT VSV感染細(xì)胞中IRF-7的產(chǎn)生受到損害，如IFN-α轉(zhuǎn)錄體等三級應(yīng)答基因產(chǎn)物在野生型VSV感染的細(xì)胞中沒有受到誘導(dǎo)(圖2C)，而在AV1和AV2感染的細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。總而言之，這些結(jié)果提示，野生型VSV通過其M蛋白，影響圖2中所示的對初級和次級抗病毒轉(zhuǎn)錄應(yīng)答之間的阻斷。在先前的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，已提示VSV的M蛋白阻斷IFN-β的轉(zhuǎn)錄(Ferran和Lucas-Lenard，1997，J.Virol.，71371～377)，抑制mRNA的核輸出(Her等，1997，Science，2761845～1848；von Kobbe等，2000，Mol.Cell，61243～1252)，或干擾Jak/Stat信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Terstegen等，2001，J.Immunol.，1675209～5216)。本文記載的轉(zhuǎn)錄模型研究與后兩者機(jī)制之一一致，但是，在受感染細(xì)胞中，沒有觀察到外源干擾素對Jak/Stat途徑的誘導(dǎo)受到損害(數(shù)據(jù)未示出)。另一方面，當(dāng)用微矩陣或RT-PCR分析來比較和對比細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組分中的轉(zhuǎn)錄體時，發(fā)現(xiàn)野生型病毒和減毒病毒感染的細(xì)胞有明顯區(qū)別(圖3)。重要的是，雖然在所有三種病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞核組分中IFN-βmRNA都受到誘導(dǎo)，但是在野生型病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)mRNA庫中沒有發(fā)現(xiàn)IFN-βmRNA的顯著水平。
總之，這些結(jié)果與以下觀點(diǎn)是一致的，即感染后，野生型病毒引發(fā)初級抗病毒應(yīng)答，但是通過阻斷關(guān)鍵的抗病毒mRNA的核輸出，其與病毒基因產(chǎn)物的協(xié)同表達(dá)鈍化了次級和三級應(yīng)答。為支持該模型，構(gòu)建了表達(dá)組成型活性形式的IRF-7的野生型VSV。如所預(yù)期的那樣，該病毒具有減毒的表型，甚至在野生型VSV的M蛋白存在的條件下，于感染后4小時之內(nèi)能夠誘導(dǎo)IFN-α基因的表達(dá)(圖2D；在AV1和AV2感染的情況中，IFN-α在感染后12小時才表達(dá)表1)。
減毒病毒AV1和AV2保持它們殺死腫瘤細(xì)胞的能力為了評價減毒的VSV株系的溶瘤特性，用WT、AV1或AV2病毒攻擊NCI人腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)組(panel)(來自惡性譜的60個細(xì)胞系)，并按照材料與方法中的描述，測試48小時后代謝細(xì)胞的死亡。從表2A中明顯可以看出，WT VSV能夠生產(chǎn)性感染并殺死大范圍的不同的癌細(xì)胞類型。而且，如發(fā)明人早期所證明的(Stojdl DF，Lichty B，Knowles S，Marius R，Atkins H，Sonenberg N，Bell JC，2000，Nature Medicine 6821～825)，所測試的大部分癌細(xì)胞系(約80％)顯示對INF-α或IFN-β的應(yīng)答受損。因此，并不奇怪AV1和AV2和WT VSV一樣，能夠有效地殺死這些腫瘤細(xì)胞系，推測可能是因?yàn)樵谶@些細(xì)胞中的IFN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)存在缺陷(表2A & B)。
表2A突變的VSV株對癌細(xì)胞系的NCI 60實(shí)驗(yàn)組的各成員是高度裂解的。

*被認(rèn)為對病毒感染高度敏感的NCI 60實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞系(根據(jù)腫瘤類型)的百分比。()表示所測試的細(xì)胞系數(shù)目中高度易感細(xì)胞系數(shù)目。如果感染48小時后EC50≤1MOI，該細(xì)胞系被認(rèn)為是高度易感的。MOI代表易感細(xì)胞系的平均EC50(MOI)。nd＝未確定。
表2BNCI 60細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中的大多數(shù)細(xì)胞系顯示IFN缺陷

*表示各組中對IFN-α或IFN-β的預(yù)處理為非應(yīng)答的細(xì)胞系的數(shù)量。如果IFN預(yù)處理不能顯著影響(＜10倍)WT VSV感染48小時的細(xì)胞的EC50，則認(rèn)為該細(xì)胞系為非應(yīng)答。
AV1和AV2的體內(nèi)溶細(xì)胞特性以前報(bào)道了用WT VSV對裸鼠中的皮下異種移植腫瘤進(jìn)行的成功治療(Stojdl等，2000，Nature Medicine 6(7)821～825)，但是，在這些實(shí)驗(yàn)中，需要用外源干擾素來保護(hù)免疫缺陷的動物免于受到病毒處理。上述描述的結(jié)果提示，即便是在沒有外源施用的干擾素存在下，AV1和AV2在裸鼠模型中應(yīng)該能夠有效地殺死腫瘤細(xì)胞并且毒性低。將人卵巢癌細(xì)胞注射到CD-1裸鼠的腹膜腔內(nèi)，并使其生長12天，接受UV滅活的病毒的大部分小鼠(14/15)在處理后15天形成腹水(在該群體中剩下的小鼠在第39天達(dá)到終點(diǎn))。相反地，將3劑AV2遞送到腹膜腔內(nèi)，為70％的小鼠提供了持久的治愈(圖4A)。顯著地，盡管腹膜內(nèi)單劑WT VSV無一例外地導(dǎo)致裸鼠的死亡，但是接受3劑AV2治療的動物均沒有表現(xiàn)出甚至病毒感染的癥狀(例如，萎靡不振、體重下降、脫水)。
用AV1和AV2對皮下腫瘤進(jìn)行全身治療雖然當(dāng)被注射到原來接種腫瘤的位置時，AV1和AV2株系是有效的，但是還需要測定全身遞送的減毒株的治療效力。為了這個目的，通過將CT26結(jié)腸癌細(xì)胞注射到同基因的Balb/C小鼠的后脅腹中而形成皮下腫瘤。當(dāng)腫瘤變得可觸知(約10mm3)時，通過尾靜脈注射施用病毒。處理后12天，接受UV滅活VSV的小鼠達(dá)到終點(diǎn)，其腫瘤平均尺寸為750mm3。相反地，單一AV2治療顯示出顯著效力，到終點(diǎn)的時間幾乎推遲了3倍(34天)。在該治療組的8只動物中，7只被認(rèn)為產(chǎn)生了部分應(yīng)答，而只有一只沒有對治療產(chǎn)生應(yīng)答(表3)。當(dāng)用多劑量的AV1或AV2進(jìn)行靜脈內(nèi)施用時，治療效果顯著提高(圖4B&表3)。除了一只動物外，腫瘤對AV1治療均產(chǎn)生了應(yīng)答，6只小鼠有3只其腫瘤顯示出完全消退。這些小鼠中有2只分別早在感染后8天和9天腫瘤即完全消退。剩下的兩只動物顯示部分消退，與對照相比，腫瘤的進(jìn)程推遲了幾乎2倍。所有8只AV2感染的小鼠都對治療反應(yīng)良好，8只中的5只產(chǎn)生持久的腫瘤消退。實(shí)際上，甚至在治療后7個月都沒有明顯的腫瘤再生長的跡象。而且，治療后7個月用CT26細(xì)胞進(jìn)行再攻擊時，這些小鼠也不再產(chǎn)生腫瘤，沒有可檢測到的病毒痕跡(數(shù)據(jù)未示出)，可能表明宿主介導(dǎo)的對腫瘤的免疫已經(jīng)形成。
對攜帶有腫瘤的動物施用雙倍數(shù)量的病毒劑量，沒有提高腫瘤持久消退的數(shù)量(表3)，表明在治療過程中形成的抗病毒免疫可以影響結(jié)果。還有，在以前描述的采用溶瘤HSV的方法中(Lambright等，1999，Ann.Thorac.Surg.，681756～1760和1761～1772)，采用注射病毒感染的細(xì)胞來代替只注射病毒的方式作為治療方式進(jìn)行測試。推測受感染細(xì)胞可能在血管系統(tǒng)中時發(fā)揮“特洛伊馬”的作用而掩飾病毒，并且當(dāng)它們停留在腫瘤的新形成血管系統(tǒng)中時方便進(jìn)行病毒遞送。為了這個目的，將用AV2體外感染2小時的CT-26細(xì)胞注射到攜帶有腫瘤的小鼠的尾靜脈中。在這些實(shí)驗(yàn)中，感染的CT-26細(xì)胞似乎與使用純化的病毒一樣，均是將病毒遞送到腫瘤位點(diǎn)的有效方式(三只出現(xiàn)完全消退并且一只出現(xiàn)部分應(yīng)答，圖4B)。
小鼠很好地耐受各種形式的靜脈內(nèi)治療，沒有死亡發(fā)生，并且病癥很小。在最初的治療后，感染的小鼠出現(xiàn)輕度到中度的毛發(fā)豎起、輕度脫水和一些暫時的體重下降(圖4C)。這些癥狀都是在最初的感染后觀察到，所有的隨后的劑量都沒有引發(fā)任何感染癥狀。
表3在皮下腫瘤模型中增加劑量數(shù)提高了應(yīng)答率

*代表每個治療組中顯示完全應(yīng)答(CR)、部分應(yīng)答(PR)和沒有應(yīng)答(NR)的小鼠的百分比。完全應(yīng)答是指小鼠的腫瘤完全消退且直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(80天)沒有任何腫瘤癥狀。部分應(yīng)答是指與對照小鼠(UV AV2)相比，腫瘤達(dá)到終點(diǎn)尺寸的時間推遲了。()表示組內(nèi)小鼠總數(shù)中陽性小鼠的數(shù)目。
AV1和AV2的全身施用對抗擴(kuò)散疾病是有效的當(dāng)將CT-26細(xì)胞注射到尾靜脈中時，雖然肺內(nèi)的腫瘤最為顯著，但小鼠全身都接種了腫瘤，導(dǎo)致在3周～4周內(nèi)死亡。腫瘤細(xì)胞注射后16天和用UV滅活病毒治療后4天，對4只小鼠的肺進(jìn)行檢查(圖4D)。這些肺比它們正常時的重量要重3倍，這是由于腫瘤負(fù)荷，明顯的表現(xiàn)是肺表面有節(jié)結(jié)。相反地，接受靜脈內(nèi)單劑量的AV2的攜帶有腫瘤的同窩出生的小鼠，在殺死前4天時，其具有正常的肺重量，并且?guī)缀鯖]有具有明顯的節(jié)結(jié)。通過裝置進(jìn)行鼻內(nèi)施用的AV2也具有顯著效果，而將靜脈內(nèi)和鼻內(nèi)兩種施用方式結(jié)合則效果看上去最好(圖4D)。
圖4E顯示，用肺腫瘤接種然后用UV滅活病毒、AV1或AV2進(jìn)行治療的小鼠的存活圖。用UV滅活病毒治療的動物到死亡時的平均時間(MTD)約為20天。但是，用AV1或AV2治療的小鼠得到完全的保護(hù)。該實(shí)驗(yàn)表明，AV1和AV2在侵襲性、擴(kuò)散的、免疫活性腫瘤模型中產(chǎn)生持久治愈的顯著能力。
討論這些減毒病毒和以前報(bào)道的VSV溶瘤形式的關(guān)鍵區(qū)別在于，突變的M蛋白在受感染細(xì)胞中阻斷干擾素產(chǎn)生的能力喪失。VSV M是幾種關(guān)鍵的病毒功能所需的多功能蛋白，這些功能包括出芽(Jayakar等，2000，J.Viro1.，749818～9827)、病毒體組裝(Newcomb等，1982，J.Virol.，411055～1062)、細(xì)胞病理效應(yīng)(Blondel等，1990，J.Virol.，641716～1725)以及抑制宿主基因表達(dá)(Lyles等，1996，Virology，225172～180)。后一種性質(zhì)已被歸因于M阻斷宿主RNA聚合酶活性(Yuan等，2001，J.Virol，754453～4458)或抑制蛋白和mRNAs出入宿主細(xì)胞核的核轉(zhuǎn)運(yùn)(Her等，1997，同上；von Kobbe等，2000，同上)的能力。本文中用病毒感染給出的結(jié)果與阻斷核轉(zhuǎn)運(yùn)是野生型VSV株降低宿主抗病毒應(yīng)答的主要機(jī)制的觀點(diǎn)一致。目前對受感染細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體的分析幾乎沒有提供證據(jù)來支持M蛋白在抑制宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中的作用，而是表明VSV感染引發(fā)抗病毒基因的IRF-3介導(dǎo)的刺激，然后M蛋白介導(dǎo)了阻斷初級應(yīng)答轉(zhuǎn)錄體由受感染細(xì)胞的細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。與本研究關(guān)系特別密切的是Dahlberg組的工作(Petersen等，2000，Mol.Cell.Biol.，208590～8601)和其他人的工作(von Kobbe等，2000，同上)，這些工作通過轉(zhuǎn)染研究表明，M蛋白能夠與核孔蛋白結(jié)合并影響對mRNA輸出的阻斷。
雖然不想受到理論的束縛，但是似乎是這樣的，即宿主細(xì)胞抗病毒程序是由潛在的轉(zhuǎn)錄因子NFκB、c-JUN/ATF2和IRF-3的激活而啟動的。一旦病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄因子c-JUN和IRF-3分別被JNK和一個最近鑒定的病毒激活激酶(John Hiscott，個人交流)磷酸化，而NFκB通過上游的IKK(s)的作用從其抑制物IKB中釋放出來(DiDonato等，1997，Nature，388548～554)。激活的轉(zhuǎn)錄因子移位到核內(nèi)，在IFN-β的啟動子上協(xié)同形成增強(qiáng)體復(fù)合物，導(dǎo)致IFN-β的誘導(dǎo)(Wathelet等，1998，同上)。這里涉及作為對病毒感染的初級轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。已有推測，次級轉(zhuǎn)錄波被各種干擾素刺激基因的IFN-β依賴性誘導(dǎo)所引發(fā)。本文提供的野生型M蛋白的數(shù)據(jù)有助于描述這些初級和次級轉(zhuǎn)錄事件之間的區(qū)別，同時有助于鑒定幾個新的病毒應(yīng)答基因(GADD34，PUMA)。用具有突變的M蛋白的病毒感染后，顯然，IFN-β對JAK/STAT信號途徑的自分泌刺激導(dǎo)致如IRF-7等次級應(yīng)答基因的產(chǎn)生，而該IRF-7反過來對IFN-α基因的三級誘導(dǎo)非常關(guān)鍵(Morin等，2002，J.Mol.Biol.，3161009～1022)。實(shí)際上，即使是在野生型M蛋白存在下，M蛋白對次級和三級轉(zhuǎn)錄體的阻斷可以通過表達(dá)組成型活性形式的IRF-7(由病毒啟動子)來克服。
溶瘤治療的一個限制因素是人類群體中存在預(yù)先存在的抗體的病毒中和作用(Ikeda等，1999，Nature Medicine，5881～887)。使用溶瘤病毒，例如不是人類群體中特有的VSV，將提供顯著的治療優(yōu)勢。雖然在本研究中，有時發(fā)現(xiàn)對溶瘤活性具有劑量依賴性(6次治療優(yōu)于1次治療)，但是，可能是由于形成了中和抗體，另外的劑量沒有獲得更好的治療效果。這些結(jié)果提示，成功進(jìn)行病毒治療的一個關(guān)鍵決定因素將是在抗病毒免疫應(yīng)答形成之前，進(jìn)行到達(dá)腫瘤位點(diǎn)的有效遞送。臨床上，在宿主介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答形成之前，盡可能頻繁地遞送最大容許病毒劑量似乎是非常重要的。對個體患者所需的確切劑量的確定完全在本領(lǐng)域工作的臨床醫(yī)生的能力之內(nèi)，因此，沒有在此必要討論具體劑量。
包括在病毒治療之前，對患者進(jìn)行免疫抑制在內(nèi)的策略在理論上是有用的，但是，已發(fā)現(xiàn)病毒溶瘤治療的一個重要部分是抗腫瘤應(yīng)答，而該抗腫瘤應(yīng)答由病毒蛋白在腫瘤細(xì)胞表面上的表達(dá)來啟動的(數(shù)據(jù)未示出；和Todo等，1999，Human Gene Therapy，102741～2755)。可能其他的策略，如本文所示的對病毒感染細(xì)胞進(jìn)行灌注，或用聚合物對病毒制劑進(jìn)行包被(Fisher等，2001，Gene Ther.，8341～348)，將在沒有損害有用的宿主免疫應(yīng)答的條件下為將治療劑遞送到腫瘤位點(diǎn)提供機(jī)會。
本文提供的數(shù)據(jù)表明，在腫瘤的發(fā)展過程中經(jīng)常發(fā)生干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷，在NCI試驗(yàn)組中的大部分細(xì)胞系的應(yīng)答受到損害。日益增加的數(shù)據(jù)已顯示，干擾素是多功能的細(xì)胞因子，可以協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、凋亡和抗病毒途徑。可能在腫瘤的發(fā)展過程中，對持續(xù)不斷生長和凋亡喪失的選擇勝過對抗病毒活性的不時之需。
理想地，溶瘤病毒將優(yōu)先在惡性細(xì)胞中復(fù)制，具有從原發(fā)性腫瘤到轉(zhuǎn)移腫瘤位點(diǎn)的傳播能力，并最終被宿主清除。本文提供的證據(jù)證明，減毒病毒AV1和AV2具有所有的這些特點(diǎn)，并且，由于它們能夠引發(fā)正常細(xì)胞的抗病毒應(yīng)答，所以在體內(nèi)尤其安全。實(shí)際上，目前已證明，選擇對干擾素的抗病毒作用具有抗性的VSV變體是不可能的(Novella等，1996，J.Virol.，706414～6417)，并且這些IFN誘導(dǎo)突變體以反式作用防止宿主受到WT VSV感染的能力已經(jīng)得以證明(圖1D)。因此，可能在大部分病毒顆粒是干擾素的有效誘導(dǎo)物的病毒群體中，野生型變體增長到占絕大多數(shù)的可能性是很小的。由IFN誘導(dǎo)病毒的感染所產(chǎn)生“細(xì)胞因子云”將防止宿主細(xì)胞受到更烈性的WT株的作用(見圖5)。但是腫瘤殺死作用將不受到影響，因?yàn)橐炎C明這些細(xì)胞缺乏對這種“細(xì)胞因子云”的應(yīng)答。因而，增加了治療指數(shù)，進(jìn)一步加大溶瘤病毒作為癌癥治療劑的潛力。
實(shí)施例2拯救的突變VSVs構(gòu)建了一系列的重組病毒，以測試對產(chǎn)生干擾素誘導(dǎo)突變體有用的突變范圍。為了這個目的，建立了嵌合病毒骨架，該骨架含有來自質(zhì)粒pXN-1的N、G和L基因(Schnell MJ，Buonocore L，Whitt MA和RoseJK(1996)，J.Virology 4，2318～2323)和來自AV1的P和M基因。曾經(jīng)建立的只在M基因存在差異的一系列病毒由通過在如附圖(圖6和圖7)所示的M基因變體中進(jìn)行依次置換而產(chǎn)生。例如，XNDG M4含有來自pXN-1的N、G和L基因，來自AV1的P基因和甲硫氨酸51缺失的M基因。XNDG M5含有甲硫氨酸51、天冬氨酸52、蘇氨酸53和組氨酸54這四個氨基酸缺失的M基因(圖7)。如發(fā)明人在表4(下文)中所示，這兩個突變體與天然存在的甲硫氨酸51轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?即M51R)的突變體(Mut2或AV1)在殺死3種致瘤細(xì)胞的人細(xì)胞系方面是等效的。由于XNDG M4和M5是缺失突變體，所以這些重組病毒非常難以回復(fù)為原來的甲硫氨酸51的基因型。而且，雖然該改造的病毒還能夠有效地殺死腫瘤細(xì)胞，但是它們在干擾素應(yīng)答細(xì)胞上形成小的噬菌斑，這表明這些病毒在能夠?qū)Ω蓴_素產(chǎn)生應(yīng)答的細(xì)胞中的生長是減弱的(圖8)。
為了進(jìn)行噬菌斑測試，將Vero細(xì)胞接種到60mm直徑的組織培養(yǎng)皿上并在含有10％牛血清的aMEM中鋪滿，并且在正常組織培養(yǎng)條件讓其附著至少3小時。在不含血清的aMEM中以半對數(shù)遞增方式(例如，10-4、10-4 1/2、10-5、10-5 1/2……等)制備系列稀釋的樣品病毒懸浮液。將培養(yǎng)基從60mm皿中吸出，在各皿中加入100μl的病毒懸浮液，并將該皿在正常的組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)45分鐘。培養(yǎng)45分鐘后，在42℃用3ml的比例為1∶1的1％瓊脂糖+(2×aMEM+20％胎牛血清)的混合物將該皿覆蓋。然后將該皿過夜培養(yǎng)，在第二天早晨對噬菌斑進(jìn)行計(jì)數(shù)。
用AV1(Mut2)、XNDG M4和XNDG M5病毒感染OVCAR(人卵巢癌細(xì)胞系)、293T(用來自SV40的大T抗原轉(zhuǎn)化的人腎細(xì)胞系)和U2OS(人骨肉瘤細(xì)胞系)細(xì)胞系，經(jīng)過一段時間后，用如上所述的MTS測試對細(xì)胞存活力進(jìn)行測定。在表4中提供的數(shù)據(jù)顯示，與AV1相比，拯救的突變VSVs具有類似的殺死特性。
表4通過MTS測試測定在48小時內(nèi)殺死50％細(xì)胞所需的MOI

實(shí)施例3GFP-M蛋白融合蛋白當(dāng)與綠色熒光蛋白(GFP)的氨基末端融合后，VSV基質(zhì)(M)蛋白的氨基末端(氨基M+72-GFP-N1)使該融合蛋白靶向線粒體(圖9和圖10)。VSV印第安納M的前72個氨基酸能夠使GFP靶向。起始于甲硫氨酸33(M33)的融合蛋白也能夠使GFP靶向線粒體，但只有前50個氨基酸則不能。甲硫氨酸51(M51)不是所需的。當(dāng)與GFP的C末端融合時，這些序列不能使該融合蛋白靶向線粒體，因此，這些序列必須在重組蛋白的氨基末端，以進(jìn)行所述靶向。
如圖9和圖10所示，將當(dāng)氨基末端72個氨基酸和GFP(氨基M+72-GFP-N1)之間的融合在培養(yǎng)細(xì)胞中瞬時表達(dá)時1)融合蛋白被靶向線粒體，2)該線粒體失去通常的網(wǎng)管狀組織，并瓦解為點(diǎn)狀的核周結(jié)構(gòu)，所述核周結(jié)構(gòu)3)失去膜電位。這些是正在死亡的細(xì)胞的特征。
已認(rèn)識到VSV基質(zhì)蛋白是一個毒性蛋白，在病毒的細(xì)胞毒性中起作用。M蛋白的轉(zhuǎn)錄在3個可選擇的ATG密碼子(M1、M33和M51)處啟動，在M33和M51處突變的病毒不能產(chǎn)生較短的同源異型產(chǎn)物，導(dǎo)致其細(xì)胞毒性顯著下降。對于具有不再靶向線粒體的突變VSV M蛋白的病毒，其細(xì)胞毒性將下降。
實(shí)施例4防止VSV誘導(dǎo)的發(fā)病本研究證明，全身施用突變VSV(ΔM51)可以防止致命的顱內(nèi)劑量的VSV。
用PBS、WT GFP VSV(1×108pfu)或ΔM51 GFP(1×108pfu)8周齡的雌性Balb/C小鼠組進(jìn)行靜脈內(nèi)注射(致敏的)。24小時后，對所有小鼠進(jìn)行2×107pfu的ΔM51 VSV(在5μl的PBS中)的顱內(nèi)接種，并監(jiān)測發(fā)病癥狀和癱瘓情況。
結(jié)果被提供在圖17A和圖17B中。圖17A提供Kaplan Meyer存活圖，該圖顯示100％的經(jīng)ΔM51致敏的小鼠全部存活，而所有的經(jīng)WT和PBS對照致敏的小鼠都出現(xiàn)后肢癱瘓，并被實(shí)施安樂死。圖17B是靜脈內(nèi)處理后，小鼠體重對時間所作的圖，經(jīng)ΔM51致敏的小鼠沒有出現(xiàn)體重下降，而WT和PBS對照小鼠在被實(shí)施安樂死之前體重嚴(yán)重下降。
實(shí)施例5VSV感染后干擾素的產(chǎn)生本研究提供的數(shù)據(jù)顯示，用突變VSV感染的細(xì)胞分泌IFN-α和IFN-β，而用WT VSV感染的細(xì)胞不產(chǎn)生IFN-α和IFN-β，或產(chǎn)生的量極低。
β干擾素用WT或突變VSV株感染(MOI為10pfu)OVCAR4、CAKI-1和HOP62細(xì)胞。通過ELISA測定感染后10小時受感染細(xì)胞的IFN-β產(chǎn)量。AV1和AV2感染的細(xì)胞產(chǎn)生分泌的IFN-β，而WT VSV感染的細(xì)胞則不產(chǎn)生分泌的IFN-β。ELISA是使用商購的人IFN-β檢測試劑盒(TFB INC，Tokyo，日本)來進(jìn)行的。本研究的結(jié)果圖示在圖18中。
本研究所用的細(xì)胞系可商購獲得，例如從NCI的新藥開發(fā)計(jì)劃(NewDrug Development Program)獲得。三種細(xì)胞系都是人類癌癥，之所以被選擇用于本研究是因?yàn)樗鼈儗儆?0％的對干擾素產(chǎn)生一定應(yīng)答的癌癥。OVCAR是卵巢癌細(xì)胞，HOP62是肺癌細(xì)胞，而CAKI-1是腎癌細(xì)胞。在各情況中，所述細(xì)胞都按照MTS測試所述進(jìn)行感染(見實(shí)施例1)。
α干擾素用小鼠α干擾素ELISA試劑盒(Interferon-Alpha ELISA kit)(PBLBiomedical)測定小鼠的血清IFN-α水平。用PBS或稀釋在PBS中的1×108pfu的WT GFP或AV3GFP(其中，AV3是VSV的改造形式，其甲硫氨酸51完全缺失)對Balb/C雌性小鼠(10周齡，Charles River)進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。在感染后指定時間，從各小鼠的隱靜脈采集血液到肝素化的試管中，并通過離心獲得血清。將每個樣本的5μl的血清稀釋在95μl的PBS中，并按照生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行測定。在下表5中提供的結(jié)果證明，用ΔM51突變體感染的小鼠與WT VSV感染的小鼠相比，其IFN-α產(chǎn)生較早，量較大。未實(shí)施感染的小鼠沒有產(chǎn)生可檢測量的IFN-α。
表5血清的IFN-α(pg/ml)

neg.＝低于測定的檢測水平(＜200pg/ml)；時間是指感染后小時數(shù)。
實(shí)施例6發(fā)現(xiàn)對于用ΔM51-VSV體內(nèi)處理小鼠，與來自攜帶有腫瘤的未用VSV處理的小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行的裂解相比，其細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)介導(dǎo)的對CT26腫瘤細(xì)胞靶的裂解得到顯著加強(qiáng)。
用或不用5×108pfu的ΔM51 VSV靜脈內(nèi)處理確定具有CT26皮下腫瘤的Balb/c小鼠。7天后，獲取脾細(xì)胞，并與經(jīng)輻射的(irradiated)CT26腫瘤細(xì)胞按5∶1的比率進(jìn)行培養(yǎng)。體外刺激7天后，測試脾細(xì)胞對CT26的CTL活性。本研究的結(jié)果圖示性地描述在圖19A中，將腫瘤特異性裂解％(相對于沒有效應(yīng)物脾細(xì)胞時CT26靶腫瘤細(xì)胞的背景自發(fā)裂解)對效靶比(靶細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，脾細(xì)胞是效應(yīng)物或殺傷細(xì)胞)進(jìn)行作圖。
在由WT或ΔM51病毒引發(fā)的免疫應(yīng)答中可以觀察到性質(zhì)上的差別。用5×108pfu的野生型或ΔM51-VSV靜脈內(nèi)處理Balb/c小鼠，7天后，獲取脾細(xì)胞，并與經(jīng)輻射的CT26腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，在有或沒有事先用抗體結(jié)合磁珠消除NK細(xì)胞(殺傷細(xì)胞)的條件下，測試脾細(xì)胞對CT26細(xì)胞的裂解情況。用野生型和ΔM51-VSV致敏的脾細(xì)胞處理小鼠以體外產(chǎn)生對CT26腫瘤抗原的有效的初級免疫應(yīng)答，在病毒的感染過程中以前沒有體內(nèi)接觸那些腫瘤抗原。這表明VSV治療使脾細(xì)胞體內(nèi)致敏以隨后在體外產(chǎn)生抗新抗原的初級應(yīng)答。野生型VSV治療后的對CT26細(xì)胞的裂解活性是NK依賴性的。ΔM51-VSV治療后的對CT26細(xì)胞的裂解活性是CTL介導(dǎo)的，這表明用ΔM51-VSV治療后和WT VSV治療后產(chǎn)生性質(zhì)截然不同的免疫學(xué)致敏事件。這些結(jié)果描述在圖19B中。該數(shù)據(jù)還提示，ΔM51-VSV具有誘導(dǎo)有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答(CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的裂解)的優(yōu)異能力，并具有發(fā)展保護(hù)性免疫記憶的潛力，相反地，野生型感染產(chǎn)生的主要是對CT26細(xì)胞的先天性NK細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)物機(jī)制。
本研究表明，突變病毒與野生型病毒相比，誘導(dǎo)性質(zhì)不同的應(yīng)答。在本測試中的CTL細(xì)胞的誘導(dǎo)只有使用突變病毒時才發(fā)現(xiàn)。CTL應(yīng)答是長期的保護(hù)性應(yīng)答，而NK應(yīng)答不具有記憶性。對這種截然不同的應(yīng)答的誘導(dǎo)似乎歸功于突變病毒對細(xì)胞因子的誘導(dǎo)。
實(shí)施例7突變VSV處理的腫瘤的免疫組織化學(xué)染色為了研究突變VSV對腫瘤的作用，用ΔM51 VSV GFP靜脈內(nèi)處理攜帶有皮下CT26腫瘤的Balb/c小鼠。2、5、8天后，對小鼠實(shí)施安樂死，并快速冷凍腫瘤，然后切片(5μm)，并對VSV、活性胱冬酶3和CD45(泛白細(xì)胞(pan-leukocyte)標(biāo)記)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。在本研究中使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。染色切片的照片顯示在圖20中。陽性染色是棕色，而所有的細(xì)胞核則用蘇木精復(fù)染成藍(lán)色。H&E染色顯示腫瘤的形態(tài)(H&E染色是顯示腫瘤整體結(jié)構(gòu)的非特異性染色)。
用突變VSV處理的腫瘤的免疫組織化學(xué)染色顯示大量的細(xì)胞凋亡和白細(xì)胞積累。本研究說明，突變VSV是優(yōu)良的溶瘤劑，因?yàn)樗踔猎谀[瘤細(xì)胞還未被感染時就能夠誘導(dǎo)該腫瘤細(xì)胞的死亡(即，胱冬酶3+已經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞)。雖然不想特意受到理論的束縛，這似乎又是因?yàn)橥蛔儾《菊T導(dǎo)了細(xì)胞毒性細(xì)胞因子，該細(xì)胞毒性細(xì)胞因子在感染病毒之前殺死腫瘤細(xì)胞。而且，突變病毒召集能夠滲入腫瘤并攻擊腫瘤的白細(xì)胞(CD45+細(xì)胞)。該CD45+細(xì)胞緊跟在突變病毒感染的細(xì)胞之后，又對該病毒感染的腫瘤細(xì)胞所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生應(yīng)答。
在本說明書中提到的所有的出版物、專利和專利申請表明與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員的技能水平，并且在本文中通過參考的方式引入到本文中，這與如同以參考的方式具體地和單獨(dú)地將各單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾堃氲奖局羞_(dá)到同樣的程度。
因此，顯然可以以許多方式改變本發(fā)明描述的實(shí)施方案。該改變不認(rèn)為與本發(fā)明范圍和精神有差異，并且意欲將本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所述修改包括在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表<110>渥太華健康研究學(xué)會威爾斯達(dá)特生物制劑公司<120>突變的水泡性口炎病毒及其用途<130>FCI05US2331<150>60/457,591<151>2003-03-27<160>20<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>11161<212>DNA<213>水泡性口炎病毒<400>1acgaagacaa acaaaccatt attatcatta aaaggctcag gagaaacttt aacagtaatc60aaaatgtctg ttacagtcaa gagaatcatt gacaacacag tcatagttcc aaaacttcct120gcaaatgagg atccagtgga atacccggca gattacttca gaaaatcaaa ggagattcct180ctttacatca atactacaaa aagtttgtca gatctaagag gatatgtcta ccaaggcctc240aaatccggaa atgtatcaat catacatgtc aacagctact tgtatggagc attgaaggac300atccggggta agttggataa agattggtca agtttcggaa taaacatcgg gaaggcaggg360gatacaatcg gaatatttga ccttgtatcc ttgaaagccc tggacggtgt acttccagat420ggagtatcgg atgcttccag aaccagcgca gatgacaaat ggttgccttt gtatctactt480ggcttataca gagtgggcag aacacaaatg cctgaataca gaaaaaggct catggatggg540ctgacaaatc aatgcaaaat gatcaatgaa cagtttgaac ctcttgtgcc agaaggtcgt600gacatttttg atgtgtgggg aaatgacagt aattacacaa aaattgtcgc tgcagtggac660atgttcttcc acatgttcaa aaaacatgaa tgtgcctcgt tcagatacgg aactattgtt720tccagattca aagattgtgc tgcattggca acatttggac acctctgcaa aataaccgga780atgtctacag aagatgtaac gacctggatc ttgaaccgag aagttgcaga tgagatggtc840caaatgatgc ttccaggcca agaaattgac aaggccgatt catacatgcc ttatttgatc900gactttggat tgtcttctaa gtctccatat tcttccgtca aaaaccctgc cttccacttc960tgggggcaat tgacagctct tctgctcaga tctaccagag caaggaatgc ccgacagcct1020gatgacattg agtatacatc tcttactaca gcaggtttgt tgtacgctta tgcagtagga1080tcctctgctg acttggcaca acagttttgt gttggagata gcaaatacac tccagatgat1140agtaccggag gattgactac taatgcaccg ccacaaggca gagatgtggt cgaatggctc1200ggatggtttg aagatcaaaa cagaaaaccg actcctgata tgatgcagta tgcgaaacga1260
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權(quán)利要求
1.一種突變的彈狀病毒，該突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的一個或一個以上突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
2.如權(quán)利要求1所述的突變的彈狀病毒，其中，所述的一個或一個以上突變是在編碼基質(zhì)(M)蛋白的基因中。
3.如權(quán)利要求2所述的突變的彈狀病毒，該突變的彈狀病毒是突變的水泡性口炎病毒。
4.如權(quán)利要求3所述的突變的水泡性口炎病毒，其中，所述的一個或一個以上突變是M51R、M51A、M51-54A、ΔM51、ΔM51-54、ΔM51-57、V221F、S226R、ΔV221-S226、M51X、V221X、S226X或者它們的組合。
5.如權(quán)利要求3所述的突變的水泡性口炎病毒，其中，所述的一個或一個以上突變是選自以下組的雙突變M51R/V221F、M51A/V221F、M51-54A/V221F、ΔM51/V221F、ΔM51-54/V221F、ΔM51-57/V221F、M51R/S226R、M51A/S226R、M51-54A/S226R、ΔM51/S226R、ΔM51-54/S226R和ΔM51-57/S226R。
6.如權(quán)利要求3所述的突變的水泡性口炎病毒，其中，所述的一個或一個以上突變是選自以下組的的三重突變M51R/V221F/S226R、M51A/V221F/S226R、M51-54A/V221F/S226R、ΔM51/V221F/S226R、ΔM51-54/V221F/S226R和ΔM51-57/V221F/S226R。
7.如權(quán)利要求1、2或3所述的突變的彈狀病毒，其中，所述的一個或一個以上突變還導(dǎo)致M蛋白與宿主細(xì)胞中的線粒體之間的相互作用發(fā)生改變。
8.如權(quán)利要求1、2或3所述的突變的彈狀病毒，其中，所述的突變的彈狀病毒能夠在受感染細(xì)胞中引發(fā)一種或一種以上的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
9.一種病毒載體，該病毒載體包含突變的彈狀病毒，該突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的一個或一個以上突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
10.如權(quán)利要求9所述的病毒載體，該病毒載體還包含異源核酸。
11.一種疫苗載體，該疫苗載體包含突變的彈狀病毒和編碼一個或一個以上抗原的異源核酸，所述突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的一個或一個以上突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
12.一種疫苗佐劑，該疫苗佐劑包含突變的彈狀病毒和選擇性地包含藥學(xué)上可接受的載體，所述突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，所述的突變的彈狀病毒能夠在受感染細(xì)胞中引發(fā)一種或一種以上的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的一個或一個以上突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
13.一種選擇性溶瘤劑，該選擇性溶瘤劑包含突變的彈狀病毒和選擇性地包含藥學(xué)上可接受的載體，所述突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的一個或一個以上突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
14.一種藥物組合物，該藥物組合物包含突變的彈狀病毒和藥學(xué)上可接受的載體，所述突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的一個或一個以上突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
15.一種免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含突變的彈狀病毒和藥學(xué)上可接受的載體，所述突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，所述的突變的彈狀病毒能夠在受感染細(xì)胞中引發(fā)一種或一種以上的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的一個或一個以上突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
16.如權(quán)利要求8所述的突變的彈狀病毒作為病毒藥物制劑的添加劑的用途，以防止所述制劑中產(chǎn)生烈性回復(fù)體。
17.如權(quán)利要求8所述的突變的彈狀病毒在治療疾病或異常中的用途，所述的疾病或異?？捎捎诩?xì)胞因子的釋放而得以減輕。
18.如權(quán)利要求17所述的用途，其中，所述的疾病或異常是癌癥、細(xì)菌感染、病毒感染或真菌感染。
19.如權(quán)利要求10所述的病毒載體在將所述的異源核酸遞送到需要其的受試對象中的用途。
20.一種試劑盒，該試劑盒包含一個或一個以上容器和突變的彈狀病毒，該突變的彈狀病毒的基因中具有一個或一個以上突變，所述基因編碼涉及阻斷受感染細(xì)胞中mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，其中，當(dāng)與野生型病毒進(jìn)行比較時，所述的一個或一個以上突變導(dǎo)致突變的彈狀病毒具有降低的阻斷mRNA或蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
全文摘要
本發(fā)明提供突變病毒，該病毒阻斷受感染細(xì)胞中mRNA和蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)的能力下降并且在體內(nèi)是減毒的。本發(fā)明的突變病毒還能夠引發(fā)正常宿主細(xì)胞的抗病毒系統(tǒng)，同時還保留對這種系統(tǒng)作用的敏感性。本發(fā)明進(jìn)一步提供所述突變病毒在一系列應(yīng)用中的用途，所述的應(yīng)用包括但不限于作為治療癌癥和感染的治療劑、作為疫苗和佐劑、作為病毒載體，以及作為用于對惡性細(xì)胞或被感染細(xì)胞進(jìn)行選擇性裂解的溶瘤劑和溶細(xì)胞劑。
文檔編號C12N7/04GK1788088SQ200480008416
公開日2006年6月14日 申請日期2004年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月27日
發(fā)明者約翰·C·貝爾, 布賴恩·D·利克蒂, 大衛(wèi)·F·什托伊德爾 申請人:渥太華健康研究學(xué)會, 威爾斯達(dá)特生物制劑公司