專利名稱：細(xì)菌中生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的表面表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
與革蘭氏陽性細(xì)菌的肽葡聚糖共價(jià)連接的蛋白質(zhì)的表面表達(dá)涉及獨(dú)特的分類信號和分選酶依賴機(jī)理(Mazmanian等著，Science 285760-763(1999))。研究最充分的系統(tǒng)之一是化膿性鏈球菌的編碼M6結(jié)構(gòu)蛋白的emm6基因(Fischetti等著，1990，Mol.Microbiol.41603-1605(1990))。M6蛋白有一特征性細(xì)胞壁分類信號(Leu-Pro-X-Thr-Gly(LPXTG)基序)，其后是一段疏水性氨基酸的延伸段，最后是一段作為細(xì)胞表面保留信號的含有帶電荷的殘基序列(KRKEEN)。這些細(xì)胞壁分類基序也在其它革蘭氏陽性菌包括葡萄球菌、腸球菌、李斯特菌和乳桿菌(Navarre和Schneewind，Microbiol.Biol.Rev.63174-229(1999))中鑒定到，但在寄居于人類陰道中的乳桿菌中未鑒定出。
所有人類的粘膜天然都由細(xì)菌寄居(Tannock.Clin.Rev.AllergyImmunol.22231-53(2002))。近來的科學(xué)證據(jù)已證實(shí)這些細(xì)菌與附近的細(xì)胞和組織相互作用可調(diào)節(jié)天然的生物學(xué)過程。逐漸明確的是這種粘膜微生物群基本上與多種影響人類細(xì)胞和組織的疾病有關(guān)。
一般來說，陰道和胃腸道中的乳桿菌和相關(guān)細(xì)菌的微生物群對健康是有益的(Redondo-Lopez等著，Eev.Infect.Dis.12856-72(1990)；Tannock.Clin.Rev.Allergy Immunol.22231-53(2002))。將乳桿菌的天然菌株當(dāng)作“前生命”來維持在這些部位中的健康的微生物群和預(yù)防感染已有多年。這些“健康細(xì)菌”能與病原生物(例如細(xì)菌、病毒和真菌)競爭，從而抑制病原體相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。然而，由于健康微生物群可受到機(jī)會性感染相關(guān)的天然顛覆(turnover)和破壞(disruption)，這種微生物群是一種脆弱和動態(tài)的內(nèi)環(huán)境。因此，維持甚至改善該微生物群的完整性和天然性質(zhì)的方法，并將其作為預(yù)防或治療疾病的工具是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域夢寐以求的。
粘膜微生物群阻擋了很多影響粘膜表面的局部疾病。例如，HIV和其它性傳播病原體必須繞過陰道粘膜。此外，包括潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn病等的炎癥性大腸疾病從病因?qū)W上講可能是受到破壞的菌群與宿主細(xì)胞和組織之間發(fā)生不適當(dāng)相互作用所致。調(diào)整粘膜菌群中細(xì)菌性質(zhì)的方法可能有助于預(yù)防或治療這些疾病和影響粘膜表面的相關(guān)病癥。將生物學(xué)活性蛋白質(zhì)靶向定位到這些細(xì)菌和其它生物的細(xì)胞壁上可以幫助治療這些疾病。
本發(fā)明闡述了這些和其它的問題。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了含有一表達(dá)盒的乳桿菌屬細(xì)菌，該表達(dá)盒含有一通過操作性連接于一段多聚核苷酸上的啟動子。該段多聚核苷酸編碼一信號序列和生物學(xué)活性多肽，其中所述的生物活性多肽與異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域相連，而異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有按以下順序排列的序列細(xì)胞壁相關(guān)序列、LPQ(S/A/T)(G/A)和疏水序列。
在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞壁相關(guān)序列含有至少50個氨基酸。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞壁相關(guān)序列含有至少200個氨基酸。在一些具體實(shí)施例中，異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域在該區(qū)域的羧基末端還含有帶電荷的序列。
在一些具體實(shí)施例中，乳桿菌屬細(xì)菌是寄居在陰道的菌株。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)菌選自下組簡氏乳桿菌(L.jiensenii)、加氏乳桿菌(L.gassei)、干酪乳桿菌(L.casei)和卷曲乳桿菌(L.crispatus)。
在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQSG。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQAG。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQTG。在一些具體實(shí)施例中，細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQTA。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有SEQ NO7。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有SEQ NO8。
在一些具體實(shí)施例中，該生物活性多肽表達(dá)在細(xì)菌的細(xì)胞壁上。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性多肽在10到600個氨基酸殘基之間。在一些具體實(shí)施例中，當(dāng)該生物活性蛋白質(zhì)與病原體接觸時可與病原體結(jié)合。
在一些具體實(shí)施例中，病原體是細(xì)菌病原體。在一些具體實(shí)施例中，病原體是真菌病原體。在一些具體實(shí)施例中，病原體是病毒病原體。
在一些具體實(shí)施例中，病毒病原體是人免疫缺陷病毒(HIV)。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)是CD4或CD4的HIV結(jié)合片段。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)是2D-CD4。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)是藍(lán)病毒素-N(cyanovirin-N)(CV-N)或CV-N的病毒結(jié)合片段。在一些具體實(shí)施例中，病毒病原體是單純皰疹病毒。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)是單純皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)C(HveC)或HveC的病毒結(jié)合片段。
在一些具體實(shí)施例中，該生物活性多肽可從乳桿菌屬細(xì)菌中釋放出來。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性多肽錨定在乳桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞壁上。
本發(fā)明也提供在乳桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞壁上表達(dá)生物學(xué)活性多肽的方法。在一些具體實(shí)施例中，該方法包括提供含有一表達(dá)盒的乳桿菌屬細(xì)菌，該表達(dá)盒含有一通過操作性連接于多聚核苷酸的啟動子。該多聚核苷酸編碼一信號序列和生物活性多肽，其中生物活性多肽與一異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域相連，而此異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有按以下順序排列的序列細(xì)胞壁相關(guān)序列、LPQ(S/A/T)(G/A)和疏水序列；并且在誘導(dǎo)該多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)菌，從而在乳桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞壁上表達(dá)該生物活性多肽。
在一些具體實(shí)施例中，所述細(xì)胞壁相關(guān)序列含有至少50個氨基酸。在一些具體實(shí)施例中，所述細(xì)胞壁相關(guān)序列含有至少200個氨基酸。
在一些具體實(shí)施例中，所述異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域可在該區(qū)域的羧基末端還含有帶電荷的序列。在一些具體實(shí)施例中，所提供的步驟包括將表達(dá)盒轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)所述細(xì)菌。
在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQSG。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQAG。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQTG。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQTA。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有SEQ NO7。在一些具體實(shí)施例中，細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有SEQ NO8。
在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有至少200個氨基酸。
在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)菌是寄居在陰道的菌株。在一些具體實(shí)施例中，所述細(xì)菌選自簡氏乳桿菌、加氏乳桿菌、干酪乳桿菌和卷曲乳桿菌。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)在10到600個氨基酸之間。在一些具體實(shí)施例中，當(dāng)該生物學(xué)活性蛋白質(zhì)與病原體接觸時可與病原體結(jié)合。
在一些具體實(shí)施例中，病原體是細(xì)菌病原體。在一些具體實(shí)施例中，病原體是真菌病原體。在一些具體實(shí)施例中，病原體是病毒病原體。
在一些具體實(shí)施例中，病毒病原體是人免疫缺陷病毒(HIV)。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)是CD4或CD4的HIV結(jié)合片段。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)是2D-CD4。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)是藍(lán)病毒素-N(CV-N)或CV-N的病毒結(jié)合片段。在一些具體實(shí)施例中，病毒病原體是單純皰疹病毒。在一些具體實(shí)施例中，生物學(xué)活性蛋白質(zhì)是單純皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)C(HveC)或HveC的病毒結(jié)合片段。
在一些具體實(shí)施例中，該生物活性多肽可從乳桿菌屬細(xì)菌中釋放出來。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性多肽錨定在乳桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞壁上。
本發(fā)明也給出了在哺乳動物粘膜表面提供生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的方法。在一些具體實(shí)施例中，該方法包括使粘膜表面與重組改變的乳桿菌屬細(xì)菌相接觸，該細(xì)菌經(jīng)重組轉(zhuǎn)變可表達(dá)連接于生物活性多肽的信號序列；而該生物活性多肽連接于異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域，而該異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有按以下順序排列的序列細(xì)胞壁相關(guān)序列、LPQ(S/A/T)(G/A)和疏水序列，其中生物活性多肽的表達(dá)量要能在收集自粘膜表面的樣品中檢測到。
在一些具體實(shí)施例中，所述細(xì)胞壁相關(guān)序列含有至少50個氨基酸。在一些具體實(shí)施例中，所述細(xì)胞壁相關(guān)序列含有至少200個氨基酸。在一些具體實(shí)施例中，異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域可在該區(qū)域的羧基末端還含有帶電荷的序列。在一些具體實(shí)施例中，所述乳桿菌屬細(xì)菌選自簡氏乳桿菌、加氏乳桿菌、干酪乳桿菌和卷曲乳桿菌。
在一些具體實(shí)施例中，粘膜表面是陰道內(nèi)粘膜表面。在一些具體實(shí)施例中，粘膜表面是胃腸道內(nèi)粘膜表面。
在一些具體實(shí)施例中，所述接觸步驟包括經(jīng)口給予乳桿菌屬細(xì)菌。在一些具體實(shí)施例中，接觸步驟包括經(jīng)陰道給予乳桿菌屬細(xì)菌。在一些具體實(shí)施例中，接觸步驟包括經(jīng)直腸給予乳桿菌屬細(xì)菌。
本發(fā)明提供含有啟動子的表達(dá)盒。其中所述啟動子通過操作性連接于一段多聚核苷酸上。該段多聚核苷酸編碼一信號序列和生物活性多肽，其中生物活性多肽與異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域相連，而異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有按下列順序排列的序列細(xì)胞壁相關(guān)序列、LPQ(S/A/T)(G/A)和疏水序列。在一些具體實(shí)施例中，細(xì)胞壁相關(guān)序列含有至少50個氨基酸。在一些具體實(shí)施例中，細(xì)胞壁相關(guān)序列含有至少200個氨基酸。
在一些具體實(shí)施例中，異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域可在該區(qū)域的羧基末端還含有帶電荷的序列。
在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQSG。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQAG。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQTG。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQTA。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有SEQ ID NO7。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有SEQ ID NO8。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性多肽表達(dá)在細(xì)菌的細(xì)胞壁中。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性多肽在10到600個氨基酸殘基之間。
在一些具體實(shí)施例中，當(dāng)該生物活性蛋白質(zhì)與病原體接觸時可與病原體結(jié)合。在一些具體實(shí)施例中，病原體是細(xì)菌病原體。在一些具體實(shí)施例中，病原體是真菌病原體。在一些具體實(shí)施例中，病原體是病毒病原體。在一些具體實(shí)施例中，病毒病原體是HIV。
在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)是CD4或CD4的HIV結(jié)合片段。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)是2D-CD4。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)是藍(lán)病毒素-N(CV-N)或CV-N的病毒結(jié)合片段。在一些具體實(shí)施例中，該生物活性蛋白質(zhì)是單純皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)C(HveC)或HveC的病毒結(jié)合片段。在一些具體實(shí)施例中，細(xì)胞壁靶向區(qū)域能在乳桿菌屬中起作用。
本發(fā)明也提供含有一表達(dá)盒的載體，該表達(dá)盒含有一通過操作性連接于多聚核苷酸的啟動子。該多聚核苷酸編碼一生物活性多肽，其中生物活性多肽與異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域相連，而異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有按以下順序排列的序列細(xì)胞壁相關(guān)序列、LPQ(S/A/T)(G/A)和疏水序列。
定義“生物活性蛋白質(zhì)”指在天然細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外具有生物學(xué)活性(即，能夠參與分子機(jī)理)的氨基酸序列。蛋白質(zhì)的活性包括其免疫原性、催化活性和結(jié)合親和力等。多肽疫苗包括在術(shù)語“生物活性蛋白質(zhì)”里。通常該氨基酸序列形成三維結(jié)構(gòu)，是該氨基酸序列在天然細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的形成的。
“2D CD4”指人CD4的大約前183個氨基酸(Arthos等著，Cell.1989.57469-81(1989))。CD4是一種細(xì)胞表面糖蛋白，見于成熟的輔助性T細(xì)胞、未成熟的胸腺細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上。2D-CD4結(jié)合HIV-1 gp120的親和力與完整的蛋白質(zhì)相同，并且含有g(shù)p120的結(jié)合位點(diǎn)。CD4含有氨基末端胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基1到137)，跨膜區(qū)域(372到395)和細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)(396到433)。
“抗體”指基本上由一個或多個免疫球蛋白基因或其片段編碼的，可特異性結(jié)合并識別分析物(抗原)的多肽。識別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因和無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈的分類包括κ和λ。重鏈的分類包括γ、μ、α、δ和ε，進(jìn)而決定了免疫球蛋白的分類，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示范性的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包括四聚體。每個四聚體由兩對同樣的多肽鏈組成，每對有一條“輕鏈”(約25kDa)和一條“重鏈”(約50-70kDa)。每條鏈的N-末端有一可變區(qū)域，該區(qū)約有100到110或更多的氨基酸，主要負(fù)責(zé)識別抗原。術(shù)語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指輕鏈和重鏈。
抗體可以是，例如完整的免疫球蛋白或經(jīng)過各種肽酶消化產(chǎn)生的很多特征已清楚的片段。例如，胃蛋白酶在抗體鉸鏈區(qū)二硫鍵下面消化可產(chǎn)生F(ab’)2，它是輕鏈經(jīng)二硫鍵與VH-CH1相連接的二聚體。F(ab’)2可以在溫和條件下被還原，打開鉸鏈區(qū)的二硫鍵使F(ab’)2二聚體轉(zhuǎn)變成Fab’單體。Fab’單體基本上是帶有部分鉸鏈區(qū)的Fab(見，Paul編.Fundamental Immunology，第三版，Raven出版社，NY(1993))。當(dāng)將各種抗體片段定義為完整抗體經(jīng)消化得到的片段時，技術(shù)人員知道可利用化學(xué)或重組DNA的方法來從頭合成這些片段。因此，文中所用的術(shù)語抗體包括修飾完整抗體產(chǎn)生的，或利用重組DNA方法從頭合成的抗體片段(例如，單鏈Fv)。
當(dāng)將術(shù)語“分離的”應(yīng)用于核酸或蛋白質(zhì)時，表示該核酸或蛋白質(zhì)基本上沒有自然狀態(tài)下與其相關(guān)的其它細(xì)胞成份。雖然它們是干燥狀態(tài)或水溶液，但優(yōu)選為勻質(zhì)狀態(tài)。純度和均一性一般可用分析化學(xué)技術(shù)(例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法)測定。在一制品中某種蛋白質(zhì)占優(yōu)勢就是基本純的。具體說，某分離的基因是與開放性讀碼框中該基因兩側(cè)的編碼其它蛋白質(zhì)的基因相分離。術(shù)語“純化的”指在凝膠電泳中基本上只產(chǎn)生一條區(qū)帶的核酸或蛋白質(zhì)。具體說，意味著該核酸或蛋白質(zhì)是至少85％純，優(yōu)選至少95％純，最優(yōu)選至少99％純的。
術(shù)語“核酸”或“多聚核苷酸”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。除非特別限制，該術(shù)語包括含有已知的天然核苷酸類似物的核酸，它們與參考的核酸有相似的結(jié)合性質(zhì)并以天然存在的核苷酸類似的方式代謝。除非另有指出，特定的核酸序列還包括其保守性修飾的變體(例如，簡并性密碼子替代)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。具體地說，簡并性密碼子替代可用混基(mixed base)和/或脫氧肌苷殘基取代產(chǎn)生序列(generating sequence)中一個或多個選擇(或全部)的密碼子的第三位置而獲得(Batzer等著，Nucleic AcidRes.195081(1991)；Ohtsuka等著，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；和Rossolini等著，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。術(shù)語“核酸”與“多聚核苷酸”可互換使用。
術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”指氨基酸殘基的聚合物，在本文可互換使用。這些術(shù)語也適用于有一個或多個氨基酸殘基是對應(yīng)于天然存在氨基酸的人造化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，也適用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文使用的這些術(shù)語包括完整長度的蛋白質(zhì)(即，抗原)在內(nèi)的任何長度的氨基酸鏈，其中氨基酸殘基由肽鍵共價(jià)連接。
術(shù)語“氨基酸”指天然的或合成的氨基酸，以及氨基酸類似物或與天然氨基酸功能類似的氨基酸模擬物。天然氨基酸和那些后修飾的氨基酸(例如，羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸鹽和磷酸絲氨酸)是由遺傳密碼子編碼的。氨基酸類似物指具有與天然氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(即，連有氫原子的α碳、羰基、氨基和R基團(tuán))的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸甲基锍。這些類似物含有修飾的R基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留了與天然氨基酸一樣的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)?！鞍被崮M物”指那些化學(xué)結(jié)構(gòu)與氨基酸的通?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)不同的化合物，但是它們基因與天然氨基酸類似的功能。
本文中，氨基酸可以采用公知的三字母碼也可用IUPAC-IUB生化命名委員會(Biochemical Nomenclature Commission)所推薦的單字母碼。核苷酸也可同樣地采用它們通常接受的單字母碼。
將兩條核酸或多肽序列進(jìn)行如下所述的排序?qū)Ρ葋頊y試最大一致性，如果核苷酸或氨基酸殘基的序列分別相同，就說這兩條核酸或多肽序列“相同”的。當(dāng)將兩條或多條核酸或多肽序列在比較窗口進(jìn)行排列對比測定最大一致性時，可用以下的序列比較算法之一或通過手工排列對比和目測來檢測。在文中，當(dāng)稱兩條或多條核酸或多肽序列“相同”或百分比“相同”是指兩條或多條序列或亞序列是相同的或有一定百分比的氨基酸殘基或核苷酸是相同的。當(dāng)序列相同百分比用于指蛋白質(zhì)或肽時，會注意到不相同的殘基位置經(jīng)常是因保守性氨基酸取代而不同，這些位置的氨基酸殘基被具有類似化學(xué)性質(zhì)(例如，帶電荷荷或疏水性)的其它氨基酸殘基取代，因此不改變該分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列的區(qū)別在于保守性取代時，由于取代的保守性質(zhì)應(yīng)上調(diào)序列的相同性百分比。進(jìn)行這種調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。一般這包括給保守性替代評一部分分?jǐn)?shù)而非完全錯配，從而提高序列相同百分比。因此，例如相同的氨基酸評分為1，非保守取代評分為0的話，保守取代評分0到1之間。保守取代的評分值可按軟件程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)中的Meyer&Miller算法(ComputerApplic.Biol.Sci.411-17(1988))來計(jì)算。
本文中短語兩條核酸或多肽“基本相同”指一序列或亞序列與參考序列至少有70％序列相同。此外，相同性百分比可以是從40％到100％之間的任何整數(shù)。較為優(yōu)選的具體實(shí)施例包括本文所述的程序(例如，如下所述采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST程序)與參考序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7或SEQ ID NO8或其片段)相比至少有40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
在序列比較中，一般把一條序列作為參考序列，將測試序列與之相比較。當(dāng)使用一種序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要可設(shè)定序列坐標(biāo)和序列算法程序的參數(shù)。可采用程序參數(shù)空缺或設(shè)定其它的參數(shù)。然后用序列比較算法根據(jù)程序參數(shù)計(jì)算測試序列相對于參考序列的序列相同性百分比。
本文使用的“比較窗口”包括指選自長度從20到600，一般約50到200，更常約100到150的任何毗連位置數(shù)目的區(qū)段，與毗連位置數(shù)目相同的參考序列最佳排列對比之后，在該區(qū)段中對二序列進(jìn)行比較。為比較而對序列進(jìn)行排列的方法是本領(lǐng)域公知的。為比較而對序列進(jìn)行的最佳排列可用下列方法進(jìn)行Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2482(1981))的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443(1970))的同源性排列對比算法；Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444(1989))的檢索相似性方法；可用計(jì)算機(jī)執(zhí)行這些算法(在Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，也可以用手工排列對比或目測。
一個適用于測定序列相同性和相似性百分比的算法的實(shí)例是BLAST算法，見Altschul等人(J.Mol.Biol.215403-410(1990))所述。執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心(National center for Biotechnology Information)公開獲得。該算法包括首先通過鑒定在查詢序列中長度為W的短字(short words)來確定高評分序列對(HSPs)，當(dāng)這些短字與數(shù)據(jù)庫中同樣長度的字排列對比時，與某些正域值評分T或匹配或合適。T指相鄰字分評域值(Altschul等著，同上)。初始命中的這些相鄰字可作為開始搜索尋找更長的含有它們的HSPs的種子。使命中的字沿著每條序列的兩個方向延伸直到積累的排序評分增加。以下情況命中的字在各方向上的延伸會中止，即數(shù)量X使積累的排序評分從其最大值下降時；由于一個或多個負(fù)評分殘基排序的累積使積累的評分降到0或0以下時；或到達(dá)各條序列的末端時。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定了排序的靈敏度和速度。使用的BLAST程序缺省字長(W)11，BLOSUM62評分矩陣(見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))基準(zhǔn)(B)是50，期望值(E)是10，M＝5，N＝-4，并對兩條鏈都進(jìn)行比較。
BLAST算法也提供兩條序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(例如，見Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。BLAST算法提供的一種相似性的測定方法是最小總和概率(P(N))，它提供了兩條核苷酸或氨基酸序列之間隨機(jī)匹配可能性的指標(biāo)。例如，如果在比較測試核酸和參考核酸中最小總和概率小于約0.2、更優(yōu)選小于約0.1、最優(yōu)選小于約0.001時，可認(rèn)為該核酸與參考序列相似。
當(dāng)術(shù)語“重組”或“重組改變的”用于指例如細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時，意味著該細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體通過導(dǎo)入異源性核酸或蛋白質(zhì)而被修飾或改變的天然核苷酸或蛋白質(zhì)；或者該細(xì)胞衍生自如此修飾的細(xì)胞。因此，例如重組細(xì)胞可表達(dá)那些在該細(xì)胞的天然形式(非重組)中未發(fā)現(xiàn)的基因或表達(dá)其它異常表達(dá)的、表達(dá)不良的(under-pressed)或不表達(dá)的天然基因。
當(dāng)術(shù)語“異源性”用于指核酸或多肽的一部分時，意味著該核酸或多肽含有的兩條或多條亞序列在天然狀態(tài)時彼此沒有相同的關(guān)系。例如，一般重組得到的核酸有兩條或多條來自于不相關(guān)基因的序列，從而產(chǎn)生1一種具有新功能的核酸，例如，含有一種來源的啟動子和另一來源的編碼區(qū)域。類似地，異源性蛋白質(zhì)指該蛋白質(zhì)含有兩條或多條在天然狀態(tài)時彼此沒有相同關(guān)系的亞序列(例如，融合蛋白)。
“表達(dá)盒”是一種重組或合成產(chǎn)生的核酸，它具有一系列特定的核酸元件，這些元件使得該特定的核酸可以在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。表達(dá)盒可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表達(dá)載體包括操作性連接于啟動子上的待轉(zhuǎn)錄的核酸。
附圖簡述

圖1說明在簡氏乳桿菌1153基因組測序之后鑒定到的三個細(xì)胞壁錨定蛋白的結(jié)構(gòu)。所有的三個蛋白都有LPQTG分類信號，在其后是疏水區(qū)域和帶電荷的C-末端尾區(qū)，都擁有獨(dú)特的長重復(fù)序列。CWA代表LPQTG基序上游假定的細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域。
圖2A-C說明簡氏乳桿菌1153基因組測序得到的細(xì)胞壁錨定蛋白的序列(C14，C191和C370)。沿著錨定基序的CWA200區(qū)域用下劃線標(biāo)出。CWA200代表LPQTG基序上游大約200個氨基酸的假定的細(xì)胞壁相關(guān)或跨越區(qū)域。
圖3是用變?nèi)芫叵D(zhuǎn)化簡氏乳桿菌1153后，以SDS抽提的蛋白質(zhì)和富含細(xì)胞壁的部分經(jīng)western分析的結(jié)果，而簡氏乳桿菌1153是培養(yǎng)在37℃、5％CO2下，MRS肉湯(A)或Rogosa SL肉湯(B)中。將蛋白質(zhì)以還原性SDS-PAGE分離后，這些蛋白質(zhì)電印跡到PVDF膜上用來檢測抗c-Myc的單克隆抗體(mAb)。
圖4是用變?nèi)芫叵D(zhuǎn)化簡氏乳桿菌1153后，富含細(xì)胞壁組分的western分析結(jié)果，簡氏乳桿菌115337℃、5％CO2下，培養(yǎng)在Rogosa SL肉湯(B)中。將蛋白質(zhì)以還原性SDS-PAGE分離后，電印跡到PVDF膜上用抗CD4(T4-4)的多克隆抗體(pAb)檢測。表達(dá)構(gòu)建包含下列元件在pOSEL651中的P23啟動子-CbsA信號序列(CbsAss)-2D CD4；在p237中的C14序列的P23啟動子-CbsAss-2D CD4-CWA200-C14錨定序列；在pOSEL242中的C191序列的P23啟動子-CbsAss-2D CD4-CWA200-C191錨定序列；在pOSEL249中的C370序列的P23啟動子-CbsAss-2D CD4-CWA200-C370錨定序列。CWA200代表C-末端錨定結(jié)構(gòu)域上游的大約200個氨基酸。
圖5是對含有設(shè)計(jì)用于2D CD4分泌或表面表達(dá)的質(zhì)粒的簡氏乳桿菌1153流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的結(jié)果。細(xì)菌細(xì)胞用抗CD4(T4-4)的兔pAb，然后用FITC-偶聯(lián)的抗兔抗體檢測(A)。或者，細(xì)菌細(xì)胞也可用mAb Sim4，然后用PE-偶聯(lián)的抗鼠IgG檢測(B)。對照組包括未染色的細(xì)胞或用熒光染料偶聯(lián)的第二級抗體檢測的細(xì)胞。熒光密度作為檢測抗體與細(xì)菌表面結(jié)合的衡量，用FLOWOJO軟件計(jì)算。
圖6顯示36個氨基酸長的C-末端錨定基序不足以驅(qū)動2D CD4的表面表達(dá)。其中(A)是利用簡氏乳桿菌的天然錨定序列設(shè)計(jì)用于2D CD4的表面表達(dá)的構(gòu)建物。(B)是含有pOSEL238或pOSEL237的簡氏乳桿菌1153的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。細(xì)菌細(xì)胞用抗CD4的mAb Sim4，然后用藻紅蛋白(PE)-偶聯(lián)的抗鼠抗體檢測。對照組包括未染色的細(xì)胞或用熒光染料偶聯(lián)的第二級抗體檢測的細(xì)胞。
圖7顯示受到C370序列中的LPQTG分類信號上游不同數(shù)目的重復(fù)性細(xì)胞壁跨越序列影響的2D CD4在簡氏乳桿菌中的表面表達(dá)情況。暴露在表面并有正確折疊構(gòu)型的2D CD4分子以mAb Sim4檢測，對含有以下質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。這些質(zhì)粒是175，陰性控制；249，兩個半重復(fù)；262，沒有重復(fù)；268，一個重復(fù)；278，兩個重復(fù)；280，四個重復(fù)；281，7個重復(fù)；276，八個重復(fù)。
圖8是各種人來源的乳桿菌中c-Myc標(biāo)記蛋白質(zhì)的表面展示情況。其中(A)是設(shè)計(jì)用于表達(dá)在P23啟動子和CbsA信號序列(CbsAss)控制下的、C370序列的c-Myc標(biāo)記的CWA200的pOSEL241示意圖。(B)是用變?nèi)芫叵D(zhuǎn)化的簡氏乳桿菌、加氏乳桿菌和干酪乳桿菌后對富含細(xì)胞壁組分的Western分析結(jié)果。在用還原性SDS-PAGE分離后，將這些蛋白質(zhì)電印跡到PVDF膜上用抗c-Myc的mAb檢測。(C)是含有pOSEL241的人陰道乳桿菌分離物的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的結(jié)果。細(xì)胞壁用抗c-Myc的mAb，然后用藻紅蛋白(PE)-偶聯(lián)的抗鼠抗體檢測。對照組包括未染色的細(xì)胞或用熒光染料偶聯(lián)的第二級抗體檢測的細(xì)胞。
圖9顯示C14和C370序列LPQTG基序中的點(diǎn)突變對簡氏乳桿菌1153的2D-CD4-CWA200表面表達(dá)的作用。用預(yù)滴定的mAb Sim4(A)或pAb T4-4(B)對細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行表面染色，然后用PE-共軛的抗鼠或FITC共軛的抗兔抗體檢測。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析用FACScalibur系統(tǒng)進(jìn)行。展示在細(xì)胞表面的pOSEL237、pOSEL249蛋白質(zhì)與表達(dá)在含有突變構(gòu)建物的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的這三種蛋白質(zhì)的區(qū)別在于平均熒光強(qiáng)度不同。將在含有pOSEL237或pOSEL249的細(xì)菌細(xì)胞表面展示的2D CD4專斷地設(shè)置為100％。
圖10是在C14和C370序列的C-末端帶電荷尾區(qū)缺失構(gòu)建物的示意圖。
圖11顯示C14和C370的C-末端帶電荷尾區(qū)的序列缺失對2D CD4-CWA200表面展示的影響。用預(yù)滴定的pAb T4-4(A)或mAb Sim4(B)對細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行表面染色，然后用FITC共軛的抗兔或PE-共軛的抗鼠抗體檢測。用FACScalibur系統(tǒng)進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，分析抗體與細(xì)胞壁錨定蛋白的結(jié)合情況。展示在細(xì)胞表面的pOSEL237、pOSEL249蛋白與表達(dá)在含有突變構(gòu)建物的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的這三種蛋白的區(qū)別在于平均熒光強(qiáng)度不同。將在含有pOSEL237或pOSEL249的細(xì)菌細(xì)胞中的表面展示的2D CD4專斷地設(shè)置為100％。
圖12是含有pOSEL237-7和pOSEL249-10的和含有pOSEL651的簡氏乳桿菌1153分泌的2D CD4-CWA200與2D CD4的活性比較。設(shè)計(jì)CD4ELISA用來識別在無細(xì)胞條件培養(yǎng)基中有正確、合適折疊構(gòu)型的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的量根據(jù)它們對pAbT4-4的免疫反應(yīng)活性標(biāo)準(zhǔn)化。將從含有pOSEl651的細(xì)菌細(xì)胞中釋放出來的可溶性2D CD4蛋白質(zhì)專斷地設(shè)置為100％。
發(fā)明詳述I.導(dǎo)言本發(fā)明提供了在革蘭氏陽性細(xì)菌(例如乳桿菌)的細(xì)胞壁表達(dá)異源性多肽的新穎的基序和方法。本發(fā)明的基序可以融合于感興趣的蛋白質(zhì)，然后在細(xì)菌中以融合蛋白的形式表達(dá)。這導(dǎo)致該融合蛋白可以定位、嵌合和/或表面展示在細(xì)胞壁上，或是將該生物活性、穩(wěn)定的融合蛋白釋放到胞外基質(zhì)中。
所述的基序可用于例如在寄居于包括陰道在內(nèi)的人粘膜中的乳桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞壁表面表達(dá)蛋白質(zhì)。粘膜細(xì)菌的例子包括乳桿菌屬細(xì)菌，例如簡氏乳桿菌、加氏乳桿菌和干酪乳桿菌。
II.細(xì)胞壁靶向區(qū)域?yàn)榱吮磉_(dá)感興趣的多肽并使其靶向共價(jià)錨定到革蘭氏陽性細(xì)菌(例如乳桿菌)的細(xì)胞壁上，可將該細(xì)胞壁靶向區(qū)域的C-末端連接于感興趣的異源多肽。使得能在陰道相關(guān)乳桿菌或其它乳桿菌表面展示異源多肽的所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域由四部分組成一細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域、一LPQ(S/A/T)(G/A)序列和一疏水序列，一般是那樣的順序。細(xì)胞壁靶向區(qū)域的羧基末端或接近羧基端可任選含有一帶電荷的區(qū)域。該帶電荷的區(qū)域起著細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)終止序列的作用，從而可阻止蛋白質(zhì)釋放到培養(yǎng)基中。當(dāng)然，如果將該錨定序列從蛋白質(zhì)剩余部分切斷，蛋白質(zhì)還是會釋放進(jìn)培養(yǎng)基中。
A.細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域位于LPQ(S/A/T)(G/A)分類信號之前。其長度可以不同，一般是在40到1,000個氨基酸之間。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域至少大約30、50、80、100、150、200或更多個氨基酸。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域大約500、400、300、250、200、150、100或更少的氨基酸。在簡氏乳桿菌中，含有一個與pOSEL268(描述于實(shí)施例中)的C-末端細(xì)胞壁分類信號融合的串聯(lián)重復(fù)的、95個氨基酸的延伸段，使得CD4的表面表達(dá)成為可能。然而，在化膿性鏈球菌的M6蛋白中根據(jù)肽圖譜鑒定到長約50個氨基酸(Pancholi和Fischetti，J.Bacteriol.1702618-2624(1988))，而據(jù)推測肉質(zhì)鏈球菌中纖連蛋白結(jié)合蛋白大約為90個氨基酸(Strauss和Gotz，Mol.Microbiol.21491-500(1996)))。因此，50個或更短的氨基酸序列在乳桿菌中可以是有功能的。
在一些具體實(shí)施例中，所述細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域是疏水性的。在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域包含長度和序列可能不同的不完全串聯(lián)重復(fù)。例如，簡氏乳桿菌C370的細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域含有兩個半串聯(lián)重復(fù)。然而，盡管串聯(lián)重復(fù)可以出現(xiàn)在細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域，但這并非必需的。例如，C14的細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域就不含有重復(fù)。該細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域在功能性上能與肽葡聚糖層相互作用和跨越肽葡聚糖層。因此，該細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域也被稱為細(xì)胞壁跨越或附著結(jié)構(gòu)域，在膜相連分選酶錨定的蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁分類信號之間起著間隔物作用。
本發(fā)明提供的細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域基本上與C370序列KKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLDEAIKSADDTKSTDKYNNASDDTKSKFDEALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATKNLKQAQNDLDGQTTNKDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDDATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLIASKDNAKIHKQTL(SEQ ID NO4)相同。在一些情況下，該細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域含有至少約40、50、75、90、100、120、150、175、200個氨基酸的C370序列片段。例如，一種細(xì)胞壁相關(guān)片段可含有以下序列GQTTNKDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDDATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLLASKDNAKIHKQTL(SEQ ID NO4)。C370序列(SEQ ID NO4)含有75個帶電荷的氨基酸殘基(K、R、D、E)并缺乏富含脯氨酸-甘氨酸的序列。
在一些具體實(shí)施例中，該細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域基本上與C14序列VTRTINVVDPITGKISTSVQTAKFTREDKNSNAGYTDPVTGKTTMNPWTPAKQGLRAVNVEQIKGYVAKVDGNVDAVVVTPDSANMVVTITYQSNKPEGQNITVKKDTVPDPADGIKNKDDLPDGTKYTWKEVPDVNSVGEKTGIVTVTFPDGTSVDVKVTVYVDPVVESNRDTLSKEANTGNTNVAKAATVTSSKVESKKT(SEQ ID NO6)相同。在一些情況下，該細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域含有至少約40、50、75、90、100、120、150、175、200個氨基酸的C370序列片段。SEQ ID NO6含有51個帶電荷的氨基酸殘基(K、R、D、E)。
在一些情況下，該細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域衍生自非乳桿菌屬的細(xì)菌或與陰道無關(guān)的乳桿菌菌株。
B.LPQ(S/A/T)(G/A)LPQ(S/A/T)(G/A)序列在陰道相關(guān)的乳桿菌中作為細(xì)胞壁分類信號。在該細(xì)胞壁相關(guān)區(qū)域中至少有基序LPQ(S/A/T)(G/A)的一個拷貝。該基序中的括號表示此位置的氨基酸可替換(例如LPQSG、LPQAG、LPQTG、LPQSA、LPQAA、LPQTA)。
C.疏水序列待錨定在細(xì)胞壁中的多肽的羧基末端含有一功能為跨越細(xì)菌膜的疏水區(qū)域。該區(qū)域含有至少50％的疏水性氨基酸，在一些具體實(shí)施例中含有至少60％、70％、80％或90％的疏水性氨基酸。天然疏水性氨基酸包括丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和纈氨酸。一些疏水性較低的氨基酸(例如，甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸)也可作為這些序列的結(jié)構(gòu)成份(見例如Pallen等著，Trends Microbiol.997-101(2001))。在分選酶樣蛋白質(zhì)的可利用含LPXTG的基質(zhì)中，疏水序列的長度一般在約10到30個氨基酸，有時是13到24個氨基酸(Pallen等著，Trends Microbiol.997-101(2001))。疏水序列的例子包括C14中的V1740GILGLAIATVGSLLGLGV1758和C370中的p1877LTAIGIGLMALGAGIFA1894另一方面，任何革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁錨定蛋白的疏水區(qū)都可利用。其它疏水序列見美國專利No.5,821,088附圖1中所述或基本上相同的序列。在Pallen等著的Trends Microbiol.997-101(2001)中表2也描述了其它的序列。
D.帶電荷的序列帶電荷區(qū)可以任選地存在細(xì)胞壁靶向區(qū)域的羧基末端，一般是緊跟疏水性跨膜區(qū)域。羧基末端帶電荷區(qū)域可將多肽固定在膜上，從而極大程度減少蛋白質(zhì)從膜上解離進(jìn)入培養(yǎng)基。該帶電荷區(qū)域至少含有40％，在一些具體實(shí)施例中至少含有50％、60％、70％、80％或90％的帶電荷的氨基酸。天然的帶電荷氨基酸包括精氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。帶電荷序列長度可在2和20個氨基酸之間，在一些具體實(shí)施例中可在4-12或5-11個氨基酸之間。帶電荷的序列的例子包括C191中的K969KRKED974、C14中的R1760KKRQK1765和C370中的K1895KKRKDDEA1903。
此外，任何革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁錨定蛋白的帶電荷區(qū)都可利用。其它帶電荷序列見美國專利No.5,821,088附圖1中所述或基本上相同的序列。在Pallen等著的Trends Microbiol.997-101(2001)中表2也描述了其它的序列。
III.重組技術(shù)A.分子生物學(xué)方法本發(fā)明依賴重組遺傳學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法。下列基礎(chǔ)教材公開了本發(fā)明使用的一般方法Sambrook等著，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(第三版.2001)；Kriegler，基因轉(zhuǎn)化和表達(dá)實(shí)驗(yàn)室手冊(1990)和Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等著，1994)。
對核酸而言，其大小可以用千堿基(kb)或堿基對(bp)表示?？蓮沫傊腔虮０纺z電泳、核酸測序或公開的DNA序列估計(jì)。對蛋白質(zhì)而言，其大小可以用千道爾頓(kDa)或氨基酸殘基數(shù)目表示。蛋白質(zhì)的大小可從凝膠電泳、蛋白質(zhì)測序、衍生的氨基酸序列或公開的蛋白質(zhì)序列估計(jì)。
不能從商業(yè)獲得的寡多聚核苷酸可按照固相亞磷酰胺三酯方法用自動合成儀來化學(xué)合成。該方法首先由Beaucage和Caruthers(TetrahedronLetts.221859-1862(1981))描述，自動合成儀見在Van Devanter等Nucleic AcidsRes.126159-6168(1984)中所述。寡多聚核苷酸的純化如Pearson和Reanier在J.Chrom.255137-149(1983)所述，可用天然丙烯酰胺凝膠電泳或離子交換HPLC進(jìn)行。
克隆的基因序列和合成的寡多聚核苷酸在克隆后可用例如測序雙鏈模板(Wallace等著，GENE 1621-26(1981))的鏈終止方法進(jìn)行驗(yàn)證。
B.分離編碼所需蛋白質(zhì)核苷酸序列的克隆方法普遍而言，編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸克隆自從cDNA或基因組DNA制備的DNA文庫。可通過與寡多聚核苷酸探針雜交來定位特定的序列，探針的序列可得自本文公開的或是本領(lǐng)域公知的序列，從而為PCR引物制備提供參考并且為分離基因特異性的探針確定了合適的區(qū)域。或者，將該序列克隆到表達(dá)文庫中，所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可用抗感興趣多肽(包括本文所公開的)的抗血清或純化的抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測。
制造和篩選基因組和cDNA文庫的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(見例如Gubler和Hoffman，Gene 25263-269(1983)；Benton和Davis，Scienc，196180-182(1977)；和Sambrook，同上)。表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)的細(xì)胞是可用于產(chǎn)生cDNA文庫的RNA的來源。
簡言之，為了制作cDNA文庫，應(yīng)選擇富含mRNA的來源。然后，mRNA可制成cDNA，連接到重組載體中，再轉(zhuǎn)染到重組宿主中用于繁殖，篩選并克隆。對基因組文庫而言，從合適的組織或細(xì)胞中抽提DNA，用機(jī)械剪切或酶消化得到優(yōu)選約5-100kb的片段。梯度離心分離除去不需要大小的片段后構(gòu)建到細(xì)菌噬菌體λ載體中。這些載體和噬菌體在體外包裝，重組噬菌體用噬菌斑雜交分析。克隆雜交一般按照Grunstein等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.723961-3965(1975))所述進(jìn)行。
另外一個方法將合成的寡核苷酸引物和在mRNA或DNA模板上聚合酶延伸反應(yīng)相結(jié)合。這種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可直接從mRNA、cDNA、基因組文庫或cDNA文庫擴(kuò)增編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸?？蓪⑾拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)摻入引物中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或其它體外擴(kuò)增方法也可用，例如，克隆編碼特定蛋白質(zhì)的核酸并表達(dá)該蛋白質(zhì)，合成用作探針的核酸用于檢測生理樣品中編碼本發(fā)明多肽的mRNA、核酸測序或其它目的(見美國專利Nos.4,683,195和4,683,202)。PCR反應(yīng)擴(kuò)增的基因可用瓊脂糖凝膠純化并克隆到合適的載體中。
用來鑒定組織或細(xì)胞樣品中編碼本發(fā)明多肽的基因的合適引物和探針可以得自本領(lǐng)域所描述的序列。要全面了解PCR可見Innis等著PCR ProtocolsA Guideto Methods and Applications，Academic Press，San Diego(1990)。
可用中間載體克隆編碼本發(fā)明多肽的多聚核苷酸，然后轉(zhuǎn)化到乳桿菌中。這些中間載體一般是原核載體或穿梭載體。
C.轉(zhuǎn)化技術(shù)選擇合適的細(xì)菌宿主菌株的標(biāo)準(zhǔn)是它們的轉(zhuǎn)化能力、異源蛋白的表達(dá)能力和/或在粘膜表面的寄居能力。用氯化銣法或電穿孔法(見例如，Wei，等著，J.Microbiol.Meth.2197-109(1995))等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)賦予細(xì)菌宿主轉(zhuǎn)化感受態(tài)。
電穿孔法轉(zhuǎn)化簡氏乳桿菌可用修改的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如見Luchansky等著(J.Dairy Sci.743293-3302(1991)；Chang等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.10011672-11677(2003))。簡言之，將新鮮接種的簡氏乳桿菌培養(yǎng)在肉湯培養(yǎng)基中(例如，在37℃、5％CO2培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.7)。收集細(xì)菌細(xì)胞，洗滌并重懸在冷(例如，4℃)的蔗糖和MgCl2溶液中。將感受態(tài)細(xì)胞與DNA混合并放置于預(yù)冷凹槽比色杯中進(jìn)行電穿孔。讓細(xì)胞在預(yù)熱的肉湯培養(yǎng)基中恢復(fù)(例如，在37℃大約2小時)，然后將細(xì)胞涂布到含有抗生素的其它選擇性試劑的選擇性瓊脂板上，。
D.表達(dá)本發(fā)明的表達(dá)盒可以包括各種用于調(diào)節(jié)表達(dá)和定位本發(fā)明多肽的成份。例如，表達(dá)盒可以包括啟動子元件、編碼信號序列的序列、編碼感興趣多肽和錨定序列的序列。
異源性多聚核苷酸或多肽的表達(dá)可以是組成性的(例如使用P59(Van derVossen等著，Appl.Environ.Microbiol.583142-3149(1992))啟動子或P23(Elliot等著，Cell 36211-219(1984))啟動子，或乳桿菌更強(qiáng)的天然啟動子)?；蛘?，表達(dá)可在可誘導(dǎo)啟動子的控制下。例如，芽孢桿菌的淀粉酶(Weickert等著，J.Bacteriol.1713656-3666(1989)或木糖(Kim等著Gene 18171-76(1996))啟動子和乳球菌的乳鏈球菌肽啟動子(Eichenbaum等著，Appl.Environ.Microbiol.642763-2769(1998))可用來驅(qū)動可誘導(dǎo)表達(dá)。此外，也可以利用酸或堿誘導(dǎo)的啟動子。例如，可以使用在陰道內(nèi)較酸性條件下具有活性的啟動子。此外，受到陰道內(nèi)精液導(dǎo)致變化所誘導(dǎo)的啟動子也可用。例如，對精液進(jìn)入陰道而導(dǎo)致堿性增強(qiáng)時，可用堿誘導(dǎo)的啟動子誘導(dǎo)表達(dá)。
現(xiàn)已知道能引導(dǎo)多肽定在膜上、胞外空間或細(xì)胞壁表達(dá)的各種信號序列(例如，共價(jià)連接到肽葡聚糖上)。信號序列的例子包括來自食淀粉乳桿菌的α-淀粉酶(Giraud&Cuny，Gene.198149-157(1997))或卷曲乳桿菌的S-層基因(cbsA)的信號序列(例如，MKKNLRIVSAAAAALLAVAPVAA或MKKNLRIVSAAAAALLAVATVSA)。信號序列一般位于多肽的氨基末端。
多肽正確的定位和折疊可用標(biāo)準(zhǔn)方法測定。例如，富含乳桿菌細(xì)胞壁的部分可用如下方法獲得將細(xì)菌懸浮在緩沖液(例如25％蔗糖、1mM的EDTA、10mM的Tris-HCl，pH 8.0)中，接著用細(xì)胞壁降解酶處理(例如，溶菌酶和變?nèi)芫?，然后差速離心分離得到的原生質(zhì)體。所得到的組分用Western印跡法篩檢確認(rèn)細(xì)胞壁中的表達(dá)。
所表達(dá)的多肽的折疊和生物學(xué)活性也可用標(biāo)準(zhǔn)方法測定。例如，可采用該天然折疊多肽的特異性抗體的ELISA試驗(yàn)來驗(yàn)證該多肽的折疊和三維結(jié)構(gòu)。生物學(xué)活性的試驗(yàn)當(dāng)然因多肽的活性而不同。例如，對于能結(jié)合病毒的多肽，可用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合試驗(yàn)來測試表達(dá)的多肽與病毒蛋白質(zhì)結(jié)合的能力。對于抗炎分子，可測試表達(dá)的多肽拮抗引起炎癥的物質(zhì)的能力。
當(dāng)合成用于提高宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的基因時，該基因要設(shè)計(jì)成其密碼子的使用頻率接近宿主細(xì)胞優(yōu)選密碼子的使用頻率。計(jì)算宿主細(xì)胞所使用的合成基因優(yōu)選密碼子的使用頻率的偏差百分比可首先確定宿主細(xì)胞基因的單個密碼子的使用頻率的偏差百分比，然后得到所有密碼子的平均偏差。
可調(diào)整編碼特定多肽的多聚核苷酸序列使之與特定宿主使用的密碼子一致。例如，可利用乳桿菌使用的密碼子來產(chǎn)生編碼本發(fā)明多肽的含有優(yōu)選的乳桿菌密碼子的多聚核苷酸。宿主細(xì)胞顯示的優(yōu)選密碼子使用頻率，可通過在宿主細(xì)胞所表達(dá)的大量基因中優(yōu)選密碼子的平均使用頻率來計(jì)算。這種分析方法優(yōu)選限制用于宿主細(xì)胞高度表達(dá)的基因。例如，Pouwels等(Nucleic Acid Res.22929-936(1994))提供了各種乳桿菌所用的顯示高表達(dá)基因的密碼子使用頻率。密碼子的使用表也可以通過因特網(wǎng)獲得。
IV.本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明的多肽(例如融合于本發(fā)明細(xì)胞壁靶向區(qū)域的生物學(xué)活性多肽)可以是任何多肽。一般，本發(fā)明的多肽在可保留多肽生物學(xué)活性的條件下表達(dá)。在一些具體實(shí)施例中，表達(dá)的多肽中存在二硫鍵。在一些具體實(shí)施例中，二硫鍵是該多肽的生物活性所必需的。
本發(fā)明多肽的分子量可以是任意大小。例如，該多肽分子量可在約100-200,000道爾頓之間、約500-40,000之間、約500-10,000道爾頓之間、約10,000-50,000之間或約50,000-200,000之間。
按照本發(fā)明的方法可用于預(yù)防或治療病原體感染的各類多肽的例子包括例如抗病毒多肽、抗細(xì)菌多肽、抗真菌多肽和能與病毒、細(xì)菌或真菌結(jié)合的多肽，例如抗體、抗體片段或單鏈抗體。
在一些情況下，本發(fā)明的多肽是病毒或細(xì)菌病原體可結(jié)合從而感染宿主的受體?；蛘?，該多肽是抑制病原體復(fù)制、活力、進(jìn)入的制劑或是其它能與病原體結(jié)合的藥物。在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽能結(jié)合或抑制性傳播病原體，和其它經(jīng)陰道傳播或來自陰道的病原體。例如，病毒感染需要結(jié)合到靶細(xì)胞表面上的受體，那么抑制病毒與其宿主受體相互作用的策略就可以有效地預(yù)防感染。
抗病毒多肽的例子包括例如CD4或其病毒結(jié)合片段(例如，2D-CD4)(例如，Orloff等著，J.Virol.671461-1471(1993))、通過三聚體基序形成的穩(wěn)定的CD4三聚體(例如，Yang等著，J.Virol.764634-4642(2002))、十二聚體CD4-Ig融合蛋白(Arthos等著，J.Biol.Chem.27711456-11464(2002))、α-防衛(wèi)素(例如，Zhang等著，Science 298995-1000(2002))、與17b mAb的單鏈可變區(qū)域融合的CD4(Dey等著，J.Virol.772859-2865(2003))、藍(lán)病毒素-N或其變體(例如Bolmstedt等著，Mol Pharmacol.59949-954(2001)；Mori等著，ProteinExpr.Purif.2642-49.(2002))、單純皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)C(HveC)(例如，Cocchi等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9515700-15705(1998))和ICAM-1。其它的具體例子包括例如病毒受體或肝素或肝素樣分子，甘露糖結(jié)合性凝集素，包括樹突狀細(xì)胞特異性ICAM-3捕獲非整聯(lián)蛋白(grabbing nonintegrin)(例如，Geijtenbeek等著，Cell 100587-597(2000)；Feinberg等著，Science 2942163-2166(2001))、抗-HSV-1gp120單鏈抗體(例如，Marasco等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.907889-7893(1993)；McHugh等著，J.Biol.Chem.27734383-34390(2002))、人mAbb12，識別HIV-1gp120的CD4結(jié)合位點(diǎn)(例如，Saphire等著，Science 2931155-1159(2001))或其它具有類似特異性的分子，包括與HSV結(jié)合的中和抗體(例如，Burioni等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91355-359(1994))和HIV-1進(jìn)入抑制蛋白(例如，Root等著，Science 291884-888(2001)；Sia等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9914664-14669(2002))。
人乳頭瘤病毒(HPVs)感染是宮頸癌發(fā)生相關(guān)因子(例如，zur Hausen著，Virology 1849-13(1991)；Stanley著，BestPrat.Res.Clin.Obstet.Gynaecol.15663-676(2001))。因此，能抑制HPV或與之結(jié)合的分子可用于預(yù)防HPV感染和宮頸癌的發(fā)生?？笻PV多肽的例子包括，例如能與人乳頭瘤病毒16E6或E7類蛋白結(jié)合的中和抗體(例如，Mannhart等著，Mol.CellBiol.206483-6495(2000))、HPV結(jié)合蛋白或可用于引發(fā)針對該病毒的免疫反應(yīng)的HPV蛋白。
賦予本發(fā)明細(xì)菌與病毒或細(xì)菌這些病原體的結(jié)合能力至少有幾種方法。第一種是使細(xì)菌在其表面表達(dá)病毒的正常宿主受體，例如人鼻病毒HRV(主要組分)的受體ICAM-1和HIV的受體CD4。這些是正常的人蛋白質(zhì)，很多這些蛋白的基因完全序列已經(jīng)確定，儲存在GenBank的數(shù)據(jù)庫中。
第二種方法是在細(xì)菌表面表達(dá)可結(jié)合病毒表面保守性決定簇(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒上的VP4或HIV上的gp120)的抗體片段或其它多肽。對任何抗原基本上特異性的的抗體片段(和多肽)可選自噬菌體展示文庫(Marks等著，J.Biol.Chem.2616007-16010(1992))。這類抗體可針對病原體上任何表位或與病原體相關(guān)表位和下述其它表位。
第三種方法包括在細(xì)菌表面表達(dá)糖類結(jié)合多肽。這些分子的例子包括肝素結(jié)合多肽或甘露糖結(jié)合多肽。
抗細(xì)菌多肽包括那些能與尿路病原性大腸桿菌結(jié)合或抑制其生長或抑制其寄居的多肽?？辜?xì)菌多肽的例子包括例如抗革蘭氏陰性細(xì)菌(Levy著ExpertOpin.Investig.Drug 11159-167(2002))的滲透性增加的蛋白、哺乳動物抗微生物的多肽、β-防衛(wèi)素(Ganz和Lehrer著Pharmacol.Ther.66191-205(1995))、殺菌素(例如，Loeffler等著，Science 2942170-2172(2001))和能特異性地結(jié)合細(xì)菌的抗體。
抗真菌多肽包括那些能與真菌(例如，假絲酵母)結(jié)合或抑制其生長或抑制其寄居的多肽。
其它本發(fā)明可以使用的生物活性多肽的例子包括治療性多肽或藥物，例如抗炎癥分子、生長因子、能結(jié)合或拮抗生長因子的分子、治療性酶、抗體(包括，例如抗體片段或單鏈抗體)和能抑制或治療宮頸癌等的分子?？梢匀菀椎匾么罅科渌兄委熁钚缘亩嚯?，而不受限于這些例子。
抗炎癥分子包括例如抗體或其它能與TNF或IL-8特異結(jié)合的分子。其它抗炎癥分子的例子包括IL-10和IL-11。
本發(fā)明所用的生長因子包括例如那些參與局部組織修復(fù)的分子(例如KGF、HB-EGF、FGF和TGF-β)或這些分子的拮抗劑。
治療性酶包括，例如一氧氮化物(NO)合成酶。
抗腫瘤分子包括那些可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的(例如p53)或可靶向腫瘤特異表位的疫苗。
本發(fā)明所用的疫苗分子包括能引發(fā)針對病毒、細(xì)菌或真菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)的多肽。示范性的病毒疫苗可引發(fā)針對例如HIV、HPV、HSV-2或天花的應(yīng)答反應(yīng)?？乖睦影℉SV-2的糖蛋白D、人乳頭瘤病毒蛋白E6和E7、砂眼衣原體的主要外膜蛋白(Kim和DeMars著Curr.Opin.Immunol.13429-436(2001)和白色假絲酵母的天冬酰胺蛋白酶(De Bernardis等著，Infect.Immun.702725-2729(2002))；尿路病原性大腸桿菌的FimH(Langermann等著，Science.276607-611(1997))；腸外病原性大腸桿菌的IroN(Russo等著，Infect.Immun.717164-9(2003))。
V.傳送將工程菌傳送到期望的粘膜表面依賴于該區(qū)域的可接近性和局部條件。例如，可將工程菌置于鹽溶液中或在泡沫液中傳送到陰道粘膜。泡沫液可以包括例如一種或多種經(jīng)疏水性修飾的多糖(例如纖維素制品和殼多糖)。纖維素制品包括，例如羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羥乙基甲基纖維素等。甲殼質(zhì)包括，例如下列的甲殼質(zhì)鹽甲殼質(zhì)乳酸鹽、甲殼質(zhì)水楊酸鹽、甲殼質(zhì)吡咯烷酮羧酸鹽、甲殼質(zhì)衣康酸鹽、甲殼質(zhì)尼克酸鹽、甲殼質(zhì)甲酸鹽、甲殼質(zhì)乙酸鹽、甲殼質(zhì)沒食子酸鹽、甲殼質(zhì)谷氨酸鹽、甲殼質(zhì)馬來酸鹽、甲殼質(zhì)天冬氨酸鹽、甲殼質(zhì)羥乙酸鹽和四元胺取代的甲殼質(zhì)和其鹽類等。泡沫液也可包括其它的成份，例如水、乙醇、異丙醇，甘油(glycerin)、甘油(glycerol)、丙二醇和山梨醇。殺精劑可任選地包含在該細(xì)菌組合物中。泡沫液和泡沫液傳送載體的其它例子見，例如美國專利No.5,595,980和No.4,922,928中所述。
此外，細(xì)菌也可用栓劑或陰道環(huán)傳送。見美國專利No.4,322,399。在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明所述細(xì)菌裝在可溶性聚合物中和/或選擇具有溶解性能的復(fù)合碳水化合物制成的可溶解成份中傳送。這樣該成份在使用前基本上是固體形式，在使用時由于人的體溫和濕度而溶解，從而能在需要的時間和以需要的劑量釋放出藥物。例如，見美國專利No.5,529,782。所述細(xì)菌也可用美國專利No.4,693,705所述的在海綿狀輸送載體中傳送。
在一些具體實(shí)施例中，所述細(xì)菌可口服給予。例如，每日劑量大約為108的乳桿菌可用于使泌尿生殖(urogentital)道菌群恢復(fù)正常。例如見Reid等著，F(xiàn)EMSImmuno.Med.Microbiol.3237-41(2001)。
在一些具體實(shí)施例中，將工程菌應(yīng)用于粘膜表面需要定期重復(fù)；最佳給藥間隔可以常規(guī)方法確定，但視粘膜環(huán)境和細(xì)菌菌株的不同而不同。給藥間隔可一天一次至每2-4個星期一次之間變化。
在一些具體實(shí)施例中，導(dǎo)入噬菌體以轉(zhuǎn)化天然乳桿菌時，所選的噬菌體核酸可經(jīng)過操作用異源基因取代編碼噬菌體衣殼蛋白的基因，得到復(fù)制缺陷型噬菌體。將這些重組DNA分子加入含有功能性噬菌體蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物中將導(dǎo)致裝配成為攜帶有異源基因的功能性噬菌體顆粒。然后將這些復(fù)制缺陷型噬菌體顆粒引入期望的粘膜表面感染所選擇的菌群。應(yīng)用于粘膜表面的感染劑量一般為108-1012PFU/ml。加到治療表面的溶液比例是約0.1-1.0ml/每平方厘米粘膜表面積。所用的載體與上述的細(xì)菌載體類似。
實(shí)施例以下提供的實(shí)施例是為說明本發(fā)明的權(quán)利要求而非限制。
大多數(shù)病毒通過鼻、口腔、腸或生殖道的粘膜傳播。這些粘膜天然寄居有大量共棲細(xì)菌，包括健康婦女陰道腔內(nèi)的簡氏乳桿菌、加氏乳桿菌和卷曲乳桿菌。我們設(shè)想用遺傳修飾的簡氏乳桿菌表達(dá)可錨定到細(xì)菌表面的生物活性病毒結(jié)合蛋白將病毒俘獲在粘膜內(nèi)，可使病毒接觸下方的上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，抑制所俘獲的病毒的感染過程和/或受到抗病毒化合物(例如有乳桿菌分泌的乳酸和過氧化氫)的局部滅活，從而顯著減少感染性病毒顆粒的數(shù)量。因此，我們采用了一種能夠表面表達(dá)高密度HIV-結(jié)合配體、CD4的2-結(jié)構(gòu)域和藍(lán)病毒素-N的遺傳工程改造的乳桿菌的模塊化表達(dá)方法。我們發(fā)現(xiàn)通過與簡氏乳桿菌的天然蛋白質(zhì)的蛋白結(jié)構(gòu)域融合，可使10-600個氨基酸的多肽有效地固定展示在細(xì)胞壁上。
M6蛋白具有特征性細(xì)胞壁分類信號LPXTG基序，其后有一疏水性氨基酸延伸段，最后是一段含有帶電荷殘基的序列(KRKEEN)，這段序列是關(guān)鍵性的細(xì)胞表面保留信號。我們最初嘗試用質(zhì)粒為基礎(chǔ)的模塊化方法，利用兩個特征已清楚的細(xì)胞壁錨定基序在簡氏乳桿菌的表面表達(dá)CD4，這兩個錨定基序來自化膿性鏈球菌的M6蛋白(emm6)或來自類干酪乳桿菌的PrtP蛋白酶；或是化膿性鏈球菌的M6蛋白的錨定基序加上M6蛋白天然序列N-末端100個氨基酸延伸段(CWA100)。與M6蛋白不同，PrtP的分類信號是LPKTA。雖然有大量的2D CD4釋放到條件培養(yǎng)基中，但是對該條件培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)，和在含有M6或PrtP或CWA100作為細(xì)胞壁錨定蛋白的、經(jīng)修飾的簡氏乳桿菌的細(xì)胞壁或原生質(zhì)體相關(guān)蛋白庫的Western分析，未檢測到細(xì)胞壁相關(guān)的2D CD4。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析未能鑒定到暴露在表面的陽性2D CD4。
對假定的細(xì)胞壁錨定序列的鑒定對簡氏乳桿菌基因組序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定到假定的細(xì)胞壁錨定基序的約30個重疊群。根據(jù)對生物技術(shù)國家中心(National Center for Biotechnology)網(wǎng)站可得到的非冗余數(shù)據(jù)庫的更詳細(xì)序列同源性檢索，我們選擇了三條這樣的序列，命名為C14、C191和C370。它們分別與發(fā)酵乳桿菌的Rlp(Turner等著，Appl.Environ.Microbiol.695855-5863(2003))或路氏乳桿菌中的粘膜結(jié)合蛋白(Roos和Jonsson著，Microbiol.148433-442(2002))，鏈球菌表面蛋白家族(Wastfelt等著，J.Bio.Chem.27118892-18897(1996))和嗜熱鏈球菌的細(xì)胞壁錨定蛋白酶(Fernandez-Espla等著，Appl.Environ.Microbiol.664772-4778(2000))有較低的序列相似性(23％～27％的相似性)。所有這三條序列在疏水性區(qū)域和帶電荷的C-末端尾區(qū)之前都有LPQTG分類信號(見圖1)。這些特點(diǎn)在革蘭氏陽性細(xì)菌的分選酶識別的C-末端細(xì)胞壁錨定序列中是常見的(Navarre和Schneewind著，Microbiol.Mol.Bio.Rev.63，174-229(1999))。在革蘭氏陽性細(xì)菌所發(fā)現(xiàn)的LPXTG細(xì)胞錨定基序中，只有7％與在這些簡氏乳桿菌蛋白中發(fā)現(xiàn)的LPQTG序列匹配。C14、C191和C370蛋白均含有毗連該細(xì)胞壁錨定區(qū)域的串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)特征經(jīng)常存在于已知的細(xì)胞壁錨定蛋白中(Navarre和Schneewind著，Microbiol.Mol.Bio.Rev.63，174-229(1999))。C14、C191和C370的序列顯示在圖2A-C中。
假定的細(xì)胞壁錨定序列的表位標(biāo)記為測定C14、C191和C370將異源融合蛋白錨定到簡氏乳桿菌的細(xì)胞壁上的效率，我們直接在LPQTG分類信號的N-末端選擇了約200個氨基酸。該區(qū)域常定義為細(xì)胞壁錨定蛋白中的細(xì)胞壁相關(guān)(CWA)結(jié)構(gòu)域，它有助于基質(zhì)序列的保留或延長，從而有助于膜相關(guān)分選酶的適當(dāng)溶解蛋白切割。為了有利于免疫檢測，將c-Myc表位(EQKLISEEDL)分別與在pOSEL239、240和241中的C14、C191和C370的CWA200區(qū)域N-末端融合。用Western和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析來檢測c-Myc標(biāo)記蛋白是否產(chǎn)生并定位到細(xì)胞壁。為進(jìn)行Western分析，含有pOSEl175、239、240和241的修飾的簡氏乳桿菌培養(yǎng)在MRS和Rogosa SL肉湯中到對數(shù)生長期。然后，用變?nèi)芫叵?xì)胞壁，這是一種能切斷成熟肽聚糖聚糖鏈的MurNAc-GlcNAc之間切割β1-4糖苷鍵的N-乙酰溶菌酶。在SDS-PAGE電泳法(Perry等著，J.Biol.Chem.277，16241-16248(2002))之后，細(xì)胞壁錨定蛋白一般遷移成為一系列的片段。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)在MRS和Rogosa肉湯中時，對含有pOSEL239(C14錨定蛋白)和pOSEL(C370錨定蛋白)的細(xì)菌細(xì)胞富含細(xì)胞壁組分進(jìn)行蛋白Western分析，顯示在還原性SDS-PAGE上出現(xiàn)c-Myc標(biāo)記蛋白序列梯(圖3)。而含有pOSEL240(C191錨定蛋白)的細(xì)菌細(xì)胞富含細(xì)胞壁組分沒有這種模式，表明所測試的含有LPQTG的序列錨定效率不同。
為確定Western印跡陽性的c-Myc表位是否暴露在含有pOSEL239和241的簡氏乳桿菌細(xì)胞的表面，以含有對照質(zhì)粒pOSEL175的細(xì)菌細(xì)胞為參考，對抗-c-Myc的抗體的結(jié)合情況進(jìn)行了流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。盡管含有pOSEL239的細(xì)菌細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度與那些含有對照質(zhì)粒pOSEL175的細(xì)菌并無區(qū)別，但含有pOSEL241的細(xì)菌細(xì)胞增加了160倍。盡管還不清楚是否空間位阻效應(yīng)影響了與C14序列的c-Myc標(biāo)記的CWA200區(qū)域的表面接近，我們的分析清晰地表明C370序列CWA200區(qū)域的N-末端盡頭是暴露在表面的。這個結(jié)果說明該C370特定區(qū)域可用于將異源多肽與細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白共價(jià)固定。
2D CD4在簡氏乳桿菌細(xì)菌表面的表面表達(dá)我們進(jìn)行了Western印跡和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析來確定是否2D CD4可通過C14和C370序列的CWA200區(qū)域來表面表達(dá)。為進(jìn)行Western分析，在細(xì)胞壁消化后，將含有pOSEL175(對照質(zhì)粒)、651(無細(xì)胞錨定蛋白的2D CD4質(zhì)粒)(Chang等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.10011672-11677(2003))、237(與C14錨定蛋白融合的2D CD4)、242(與C191錨定蛋白融合的2D CD4)和249(與C370錨定蛋白融合的2DCD4)的簡氏乳桿菌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分成多個富含細(xì)胞壁的組分。在富含細(xì)胞壁的蛋白組分中，一系列高分子量的蛋白質(zhì)能與含有pOSEL237和249、而非pOSEL651的細(xì)菌細(xì)胞中的pAb T4-4發(fā)生免疫反應(yīng)(圖4)。在變?nèi)芫叵骃DS-PAGE中觀察到的梯序列模式裝配成已知的、來自其它革蘭氏陽性細(xì)菌表面細(xì)胞壁錨定蛋白質(zhì)(Perry等著，J.Biol.Chem.27716241-16248(2002))。
為確定2D CD4是否表達(dá)在細(xì)菌表面，含有pOSEL175、651、237和249的簡氏乳桿菌菌株用pAb T4-4檢測，然后用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析抗體的結(jié)合情況。如預(yù)料的那樣，該分析顯示含有pOSEL175和651的細(xì)菌細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度沒有區(qū)別。相反，含有pOSEL237和249的細(xì)菌細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度比含有pOSEL175和651的細(xì)菌有顯著的增加，好像是2D CD4共價(jià)連接和表面表達(dá)所致(圖5A)。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述方法，將含有乳桿菌優(yōu)選密碼子重編碼(recorded)藍(lán)病毒素-N(CV-N)基因融合到用于后續(xù)錨定2D-CD4的同一C-末端錨定結(jié)構(gòu)域。對含有CV-N表達(dá)質(zhì)粒的修飾的簡氏乳桿菌進(jìn)行的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，檢測到的平均熒光強(qiáng)度比含有pOSEL175的細(xì)菌(數(shù)據(jù)未顯示)增加了30-50倍。為測定與抗體反應(yīng)的CV-N分子是通過靜電相互作用而結(jié)合于表面的可能性，用5M的LiCl抽提修飾過的細(xì)胞。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析顯示鹽抽提的含有CV-N表達(dá)質(zhì)粒的簡氏乳桿菌和那些用PBS和2％FBS洗滌的細(xì)菌相比平均熒光強(qiáng)度無差別。表面展示的CV-N分子可抵抗5MLiCl的抽提，反映了共價(jià)固定在細(xì)菌表面的蛋白質(zhì)的一種行為。
為說明表面表達(dá)的2D CD4分子是否為具有結(jié)合gp120的正確折疊構(gòu)型，在用能識別結(jié)構(gòu)依賴表位的抗-CD4單克隆抗體Sim4檢測了含有pOSEL175、237和249的細(xì)菌細(xì)胞之后，進(jìn)行額外FACS分析。含有pOSEL237和249的細(xì)菌細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度比含有pOSEL175的細(xì)菌顯著增加，表明2D CD4以功能形式結(jié)構(gòu)表達(dá)在簡氏乳桿菌表面(圖5B)。
還不清楚2D CD4以模塊化表達(dá)方法表面表達(dá)是否會影響在修飾的簡氏乳桿菌中天然細(xì)胞表面相關(guān)蛋白的表達(dá)。為說明這個問題，用磺基-NHS-生物素檢測含有pOSEL175和237的細(xì)菌細(xì)胞，然后用含有0.4％SDS和10mMDTT的緩沖液抽提細(xì)胞表面相關(guān)蛋白。對SDS抽提蛋白用堿性磷酸酶偶聯(lián)的親和素檢測后進(jìn)行Western分析，檢測到表觀分子量從10到大于200kDa的一系列生物素化蛋白質(zhì)。含有pOSEL237的細(xì)菌細(xì)胞中的可溶性生物素化蛋白質(zhì)種類的模式與pOSEL175中的那些蛋白相似，表明天然細(xì)胞的表面表達(dá)未受影響。
簡氏乳桿菌的活性2D CD4在寬pH范圍下表面表達(dá)在大多數(shù)婦女中，天然寄居乳桿菌的人陰道腔pH在3.6-4.5范圍內(nèi)變化(Boskey等著，Infect.Immun.675170-5175(1999))，當(dāng)男性射精時暫時變成中性或弱堿性。進(jìn)行了試驗(yàn)來檢查pH值的變化如何影響修飾的簡氏乳桿菌中活性2DCD4分子的表面表達(dá)。將細(xì)菌細(xì)胞接種在Rogosa SL肉湯中，或用常用pH(5.4)或用100mM的HEPES，pH7.4的緩沖液。在活躍生長到OD600值約0.4的過程中，培養(yǎng)基的pH值基本上沒改變。對mAb Sim.4與含有pOESL237和249的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合情況進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析檢測到在pH5.4和7.4時平均熒光強(qiáng)度均顯著高于pOSEL175的對照背景。而且修飾的簡氏乳桿菌培養(yǎng)在與人陰道腔相似的酸性pH條件下時，表面表達(dá)的CV-N水平保持升高(數(shù)據(jù)未顯示)。
當(dāng)僅通過36個氨基酸長的C-末端錨定基序融合表達(dá)時2D CD4沒有表面表達(dá)36個氨基酸的C-末端錨定基序是否足夠支持2D CD4在簡氏乳桿菌中的表面有效表達(dá)還不清楚，該基序包括LPQTG信號、一疏水性區(qū)域和帶電荷的C14或C370序列尾區(qū)。為說明這個問題，制備了兩個命名為pOSEL238和pOSEL262的構(gòu)建物，其中pOSEL238含有C14的C-末端錨定基序，而pOSEL262含有C370的C-末端錨定基序，然后參考陰性對照pOSEL175和651與陽性對照pOSEL237分析這兩個構(gòu)建物。在用pAb T4-4檢測后，對含有pOSEl238的簡氏乳桿菌的富含細(xì)胞壁成份進(jìn)行Western分析，未檢測到類似于pOSEL237中那些蛋白的序列梯模式。此外，對mAb Sim.4與含有pOSEL238的細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)合情況進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，未檢測到平均熒光強(qiáng)度高于含pOSEL175的細(xì)胞的對照背景(圖6)。類似的是，參考那些含有pOSEL175和陽性對照pOSEL249的細(xì)菌，對含有pOSEL262的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行FACS分析得到了類似的陰性結(jié)果。與這些觀察相一致，當(dāng)使用類似長度的化膿性鏈球菌和類干酪乳桿菌的C-末端錨定基序時，也未能實(shí)現(xiàn)2D CD4的表面表達(dá)。這提示在特征性LPQTG基序上游的蛋白質(zhì)序列對細(xì)胞壁錨定過程有顯著貢獻(xiàn)并且是在簡氏乳桿菌細(xì)胞壁上展示生物活性蛋白所必需。
為最優(yōu)化表面展示生物蛋白所需的LPQTG基序上游重復(fù)性細(xì)胞壁跨越序列長度的確定天然C370序列在其LPQTG基序上游的C-末端區(qū)域中含有8個幾乎相同的串聯(lián)重復(fù)基序(圖1)，這是革蘭氏陽性細(xì)菌中很多細(xì)胞壁錨定蛋白的一個特征。盡管pOSEL249的錨定序列中包括兩個半重復(fù)序列，但仍待確定不同長度的上游序列是否能用于最大程度地展示表面蛋白。因此，制備了幾個含有0、1、2、4、7和8個C370序列的重復(fù)序列的構(gòu)建物。它們分別命名為pOSEL262、268、278、280、281和276。為確定采用正確折疊構(gòu)型的2D CD4分子的水平，用mAb Sim.4檢測轉(zhuǎn)化的細(xì)菌進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析(圖7)。含有pOSEL262(0重復(fù))的細(xì)菌與陰性對照pOSEL175相比平均熒光強(qiáng)度沒有區(qū)別，提示重復(fù)序列對于正確地表面表達(dá)異源蛋白質(zhì)是需要的。此外，當(dāng)重復(fù)序列數(shù)目從pOSEL262中的0個增加到pOSEL278中的3個時，熒光強(qiáng)度顯著增加。當(dāng)重復(fù)序列數(shù)目再增加時熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定。
簡氏乳桿菌的天然錨定序列在支持多種乳桿菌蛋白質(zhì)表面展示中的用途為確定簡氏乳桿菌1153的天然C370錨定序列是否能支持蛋白質(zhì)在其它簡氏乳桿菌菌株和人來源的乳桿菌種中表面展示，設(shè)計(jì)將c-Myc表位與C370序列CWA200融合的pOSEL175或pOSEL241通過電穿孔法引入簡氏乳桿菌Xna(L.jensenii Xna)、加氏乳桿菌1151和干酪乳桿菌Q(L.casei Q)中。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌以含有pOSEL241的陽性對照簡氏乳桿菌1153為參考進(jìn)行Western分析和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。用抗c-Myc的mAb檢測之后對細(xì)胞壁消化物進(jìn)行Western分析，在含有pOSEL241的簡氏乳桿菌Xna和加氏乳桿菌1151中檢測到的序列梯模式與簡氏乳桿菌1153中的類似，而在干酪乳桿菌Q中程度較低(圖8B)。用抗c-Myc的mAb進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞免疫染色之后作的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，檢測到在所有含pOSEL175的乳桿菌菌種中熒光水平較低(圖8)，但在含pOSEL241的簡氏乳桿菌Xna和加氏乳桿菌1151中的熒光強(qiáng)度增加，這是抗體與表面展示的c-Myc表位的結(jié)合所致結(jié)果。此外，與含有pOSEL175的干酪乳桿菌相比，含有241的干酪乳桿菌Q中熒光強(qiáng)度增加了大約19倍。綜合這些數(shù)據(jù)，簡氏乳桿菌1153的天然錨定序列清楚地顯示可廣泛地用于支持包括人來源的多種乳桿菌表面展示蛋白質(zhì)。
誘變的LPXTG基序?qū)喪先闂U菌表面表達(dá)2D CD4的作用金黃色葡萄球菌的蛋白A是一種研究透徹的細(xì)胞壁錨定蛋白，當(dāng)其LPETG細(xì)胞壁分類基序突變時，發(fā)現(xiàn)用天門冬酰胺(N)取代LPQTG中的脯氨酸(P)會降低蛋白表面展示的效率，而用絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T)對蛋白表面展示的效率幾乎沒有影響(Navarre和Schneewind著，Microbiol.Mol.Biol.Rev.63174-229(1999))。這項(xiàng)研究表明P殘基可能是LPXTG基序中最重要的殘基，而T殘基可被類似的氨基酸S取代。為確定在C14和C370中的LPQTG基序是否的確是關(guān)鍵的分類信號，研究了LPQTG序列中P和T的重要性。PCR在C14和C370序列的LPQTG基序中產(chǎn)生點(diǎn)突變。P殘基突變?yōu)楸彼?A)或天門冬酰胺(N)；氨基酸T突變?yōu)锳、S或甘氨酸(G)；LPXTG基序中的氨基酸G突變?yōu)锳。將含有改變的LPQTG基序的質(zhì)粒分別命名為pOSEL237P(A)、pOSEL237P(N)、pOSEL237T(A)、pOSEL237T(G)、pOSEL237T(S)、pOSEL237G(A)、pOSEL249P(A)、pOSEL249P(N)、pOSEL249T(A)、pOSEL249T(G)、pOSEL249T(S)和pOSEL249G(A)。對含有突變構(gòu)建物的簡氏乳桿菌1153進(jìn)行了Western和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。與含有親代pOSEL237和pOSEL249的簡氏乳桿菌相比，在用pAb T4-4對富含細(xì)胞壁蛋白組分進(jìn)行Western印跡時，那些含有pOSEL237P(A)、pOSEL237P(N)、pOSEL249P(A)和pOSEL249P(N)的未顯示出特征性的較高分子量的蛋白譜。而分泌到條件培養(yǎng)基中的2D CD4-CWA200融合蛋白顯著增加，表明2DCD4-CWA200融合蛋白未共價(jià)連接到細(xì)胞壁上。與野生型pOSEL237和pOSEL249中觀察到的那些蛋白相類似，對含有poSEL237T(S)和pOSEL249T(S)的簡氏乳桿菌的細(xì)胞壁消化顯示了較高分子量蛋白的特征圖譜，提示C14和C370的LPQTG中的氨基酸T可有效地用S取代(數(shù)據(jù)未顯示)。
為進(jìn)一步確定誘變LPXTG對簡氏乳桿菌表面蛋白展示的影響，用pAb T4-4或mAb Sim.4檢測了含有pOSEL175、651、237、249的簡氏乳桿菌菌株和各種突變構(gòu)建物，然后用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析抗體的結(jié)合情況。含有pOSEL237P(A)、pOSEL237P(N)的細(xì)菌細(xì)胞與含有pOSEL237的相比，含有pOSEL249P(A)、pOSEL249P(N)的細(xì)菌細(xì)胞與含有pOSEL249的相比，平均熒光強(qiáng)度大大降低，即使有一些2D CD4蛋白展示在細(xì)胞表面上也是極少的。但是，含有pOSEL237T(S)、pOSEL237T(A)、pOSEL249T(S)、pOSEL249T(A)的細(xì)菌細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度與含有pOSEL237和249的簡氏乳桿菌相當(dāng)，表明用S或A取代T對細(xì)胞壁錨定效率幾乎沒有影響(圖9)。
Western印跡和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的數(shù)據(jù)表明C14和C370的LPQTG基序中的氨基酸P是不能隨意取代的。相反，氨基酸T可用S或A取代依舊可以產(chǎn)生能有效地錨定到簡氏乳桿菌細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)。
C-末端帶正電尾區(qū)缺失對簡氏乳桿菌2D CD4表面表達(dá)的影響革蘭氏陽性細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域的一個特征是該蛋白C-末端盡頭有一段帶正電氨基酸延伸段。在M6蛋白中，這段序列(KRKEEN)作用是關(guān)鍵的細(xì)胞壁保留信號。在其它革蘭氏陽性細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了這些特征序列，包括葡萄球菌、腸球菌、李斯特菌和乳桿菌(Navarre和Schneewind著，Microbiol.Mol.Biol.Rev.63174-229(1999))。兩條序列RKKRQK1765和KKKRKDDEA1903分別鑒定為C14和C370假定錨定序列中的帶正電尾區(qū)(圖1)。為確定這兩條序列是否可作為細(xì)胞表面保留信號，建立了一系列的缺失構(gòu)建物(圖10)。將它們分別命名為pOSEL237-5、pOSEL237-6、pOSEL237-7、pOSEL249-8、pOSEL249-9和pOSEL249-10。
對含有這些構(gòu)建物的簡氏乳桿菌進(jìn)行了Western和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。遷移到48kDa處的蛋白質(zhì)代表與CWA200融合的2D CD4，在SDS-PAGE后，用pAb T4-4可在所有含帶電尾區(qū)被敲除構(gòu)建物的簡氏乳桿菌中檢測到它。與含有親代pOSEL237和249的細(xì)胞相比，含有pOSEL237-5、pOSEL237-6、pOSEL237-7、pOSEL249-8、pOSEL249-9和pOSEL249-10的簡氏乳桿菌細(xì)胞分泌蛋白更豐富。對所有缺失突變株富含細(xì)胞壁組分的蛋白進(jìn)行Western分析，未能檢測到在含有pOSEL237或249的簡氏乳桿菌中觀察到的特征的序列梯模式(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)提示2D CD4-CWA200融合蛋白未共價(jià)連接到細(xì)胞壁上。
用抗-CD4的pAb T4-4或mAb Sim.4檢測后，對修飾的簡氏乳桿菌進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，與含有親代pOSEL237或249的細(xì)菌細(xì)胞相比，檢測到含有這些突變質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度明顯下降(圖11)。這些數(shù)據(jù)結(jié)論性地表明C14和C370的帶正電的C-末端缺失抑制了它們錨定到細(xì)胞壁和展示異源蛋白質(zhì)的能力。
LPQTG基序作為細(xì)胞壁錨定信號的可行性盡管革蘭式陽性細(xì)菌的大多數(shù)細(xì)胞壁錨定蛋白有相同的分類信號LPXTG，但一些蛋白含有不同的基序。例如，類干酪乳桿菌的PrtP的分類信號是LPKTA(Holck和Nase著J.Gen.Microbiol.1381353-1364(1992))。蛋白L和大消化鏈球菌的人血清白蛋白結(jié)合蛋白含有同樣的LPXAG(基序de Chteau 和Bjrck著J.Biol.Chem.26912147-12151(1994)；Keller等著，EMBO J.11863-874(1992)；Murphy等著DNA Seq.4259-265(1994))。當(dāng)C14或C370錨定蛋白中的LPQTG突變?yōu)長PQAG或LPQSG時，2D CD4的表面展示僅有微弱下降，如SDS-PAGE后用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)或Western印跡測定的那樣。然而，根據(jù)以下證據(jù)，這些序列單獨(dú)是不足以將蛋白質(zhì)錨定到陰道的乳桿菌細(xì)胞壁上。這些證據(jù)是1)36個氨基酸的C-末端錨定結(jié)構(gòu)域單獨(dú)不能將c-Myc表位或2D CD4固定到細(xì)胞表面，2)即使把高達(dá)200個氨基酸的上游序列包括進(jìn)去，原型M6細(xì)胞壁錨定序列也(由化膿鏈球菌emm6基因編碼)不能將異源蛋白質(zhì)錨定到陰道乳桿菌細(xì)胞壁上(我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用類干酪乳桿菌的LPXTA基序時有類似的結(jié)果，和3)C191蛋白不是一種有效的錨定蛋白。這些發(fā)現(xiàn)證明C14和C370的CWA200區(qū)域中所含的上游序列也對細(xì)胞壁錨定過程有顯著貢獻(xiàn)。
2D CD4與C14和C370的CWA200融合對其生物學(xué)活性的提高為了評價(jià)其生物學(xué)活性，用CD4ELISA分析了含有pOSEL237-7和pOSEL249-10的簡氏乳桿菌1153釋放的C14和C370蛋白的2D CD4-CWA200。將含有pOSEL651、pOSEL237-7和pOSEL249-10的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)在Rogosa SL肉湯中至不同的細(xì)胞密度。然后，收集無細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。在OD600＝0.8時，Western印跡檢測到從pOSEL651釋放到培養(yǎng)基中的2D CD4量和從pOSEL237-7或249-10釋放入培養(yǎng)基的2D CD4-CWA200量相類似。然而，含有pOSEL237-7和pOSEL249-10的細(xì)菌細(xì)胞釋放的2D CD4-CWA200量與含有pOSEL651釋放的2D CD4蛋白相比活性高2-3倍?？赡苁禽o助了蛋白的折疊過程，C14或C370的CWA200區(qū)域與2D CD4融合看來提高了蛋白質(zhì)的活性。此相同的發(fā)現(xiàn)也用gp120結(jié)合試驗(yàn)得以證實(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)。對這些蛋白的Western印跡分析提示2D CD4-CWA200遠(yuǎn)比2D CD4穩(wěn)定，可能這就是其生物活性得到提高的原因。
材料和方法細(xì)菌菌株和培養(yǎng)簡氏乳桿菌、卷曲乳桿菌和干酪乳桿菌的人陰道菌株通過對健康婦女陰道樣品進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)分離得到。用乳桿菌rRNA的兩個特異性引物擴(kuò)增16S-23S基因間隔區(qū)后，對照GenBank中的參考菌株DNA序列進(jìn)行基因型分類(Tannock等著Appl.Environ.Microbiol.654264-4267(1999))。將菌株慣常地在37℃、5％的CO2下，常規(guī)培養(yǎng)在MRS或Rogosa SL肉湯(Difico，Detroit，MI)中或MRS瓊脂平皿上。
簡氏乳桿菌1153基因組DNA的分離簡氏乳桿菌1153染色體DNA的分離依據(jù)以前用于分離卷曲乳桿菌JCM 5801染色體DNA的改進(jìn)方法(Sillanpaa等著，J.Bacteriol.1826440-6450(2000))。將簡氏乳桿菌細(xì)菌在37℃、5％CO2下培養(yǎng)在200mlMRS培養(yǎng)基中直至600nm光密度達(dá)到1.0(0D600＝1.0)。6，600xg離心10min收集細(xì)胞，在25mMTris-HCl、pH8.0，10mM的EDTA，50mM葡萄糖液中洗滌一次，每100ml細(xì)菌培養(yǎng)物中加入2.5ml的20mM、pH8.0Tris-HCl，5ml24％的聚乙二醇8000和2.5ml的溶菌酶(4mg/ml，SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo)重懸。所得細(xì)菌懸浮液37℃孵育1小時。加入5ml的0.2MEDTA后，4℃1,000xg離心細(xì)胞10min，然后重懸在10ml含有50μl變?nèi)芫?15,000U/ml；Sigma Chemical Co.)的20mM、pH8.0Tris中。37℃孵育1小時后，加入1.5ml9％Sarkosyl(Sigma Chemical Co.)和3ml5MNaCl使細(xì)胞裂解。然后將細(xì)胞裂解物與2.9ml5M高氯酸鈉混合。以17.5ml氯仿-異丙醇(24∶1v/v)抽提染色體DNA，乙醇沉淀，空氣干燥，重懸在100mM、pH8.0的Tris-HCl，1mMEDTA中，濃度為1.5mg/ml。最后，所制備的基因組DNA用無DNA酶的RNA酶處理。
簡氏乳桿菌基因組文庫的構(gòu)建將簡氏乳桿菌1153的基因組DNA用HydroShear(GeneMachine，San Carlos，CA)機(jī)械剪切成期望的大小。剪切的DNA片段用T4DNA聚合酶和Klenow酶處理成平端，在瓊脂糖凝膠電泳后用QIAquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)純化得到3-8Kb的DNA片段。將所得DNA片段連接到pUC18載體中，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 10B細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中得到3-8-Kb的基因組文庫。細(xì)菌轉(zhuǎn)化物在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的LB平皿上選出，所得到的菌落用Q-pix機(jī)器人(Genetix Ltd.，UK)排列到96-孔板中。測試由96個克隆組成的平板的插入片段大小的一致性和非重組物的百分比來確定文庫的質(zhì)量。兩個文庫含有少于5％的非重組物，超過90％的插入片段在預(yù)期大小的20％之內(nèi)。
簡氏乳桿菌基因組測序和裝配用全基因組鳥槍法確定簡氏乳桿菌的基因組序列。從基因組文庫選出克隆的質(zhì)粒DNA用磁珠或用滾環(huán)法純化，然后用ABI BigDye終止子試劑盒(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)測定兩端序列。所有的測序反應(yīng)均在ABI PRISM3700自動DNA測序儀(Applied Biosystems)上進(jìn)行。總共讀取了15,360個序列或作了160個序列板覆蓋了3倍的簡氏乳桿菌1153基因組。只有當(dāng)一個序列閱讀產(chǎn)生超過Q20的50個堿基(在100個堿基中有1個可能的錯誤)或符合更高的精確性時，才認(rèn)為是成功的。將序列譜自動轉(zhuǎn)移到UNLX系統(tǒng)用Phred(Ewing等著，GenomeResearch 8175-185(1998))進(jìn)行堿基調(diào)用和質(zhì)量評價(jià)。通過率超過80％，平均閱讀長度范圍為400-500堿基。用Paracel GenomeAssembler或CAP4(Paracel，Inc.，Pasadena，CA)進(jìn)行序列裝配。共裝配了484個毗連群。簡氏乳桿菌1153基因組中含細(xì)胞壁錨定基序的蛋白序列的鑒定革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁錨定蛋白含有保守的C-末端LPXTGX基序(Fischetti等著，Mol.Microbiol.41603-1605(1990))。這個六肽之后是疏水性氨基酸延伸段和短的帶電荷尾區(qū)，也稱為終止轉(zhuǎn)移序列(Schneewind等著，Cell70267-281(1992))。此外，在類干酪乳桿菌中也鑒定到另一個獨(dú)特的LPXTA分類基序(Holck和Naes著，J.Gen.Microbiol.1381353-1364(1992))。為鑒定天然的細(xì)胞壁錨定序列，編寫了計(jì)算機(jī)文本以鑒定裝配的毗連群所有讀碼框中與LPXTG和LPXTA相似的基序(估計(jì)得自簡氏乳桿菌1153完全基因組序列的75％)。用BLAST檢索與革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁錨定蛋白序列同源性進(jìn)一步驗(yàn)證所得到的含有假定細(xì)胞壁錨定基序的毗連群。
穿梭載體的構(gòu)建用于這些研究的原代穿梭載體pOSEL175是pLEM7的修飾版本(Fons等著，Plasmid 37199-203(1997))。首先用Sma I切割，Nde I部分消化，Klenow片段使之成為平端然后再連接使其部分IS元件缺失。最后，該質(zhì)粒經(jīng)定點(diǎn)誘變?nèi)コ藀OSEL144的erm基因中兩個Mfe I位點(diǎn)(Chang等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.10011672-11677(2003))。所得到的pOSEL175質(zhì)粒含有大腸桿菌(ColE1)和乳桿菌(repA)二者的復(fù)制起始點(diǎn)，因而含有可用于在各種乳桿菌菌種中表達(dá)異源蛋白的穿梭質(zhì)粒的主鏈。
簡氏乳桿菌中表達(dá)盒的構(gòu)建為方便在簡氏乳桿菌中表達(dá)表面錨定蛋白，構(gòu)建了一表達(dá)盒并將其亞克隆到pOSEL175的SacI和XbaI位點(diǎn)中。該表達(dá)盒含有4種成份，包括乳桿菌相容的P23啟動子、卷曲乳桿菌的CbsA信號序列、編碼異源蛋白的DNA和革蘭氏陽性細(xì)菌的已知或假定的細(xì)胞表面蛋白的共價(jià)細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域。我們對含有一系列啟動子和信號序列的構(gòu)件的詳細(xì)分析暗示了結(jié)合乳酸乳球菌的P23啟動子(van derVossenet等著，Appl.Environ.Microbiol.532452-2457(1987))和來自卷曲乳桿菌的CbsA(CbsAss)的信號序列組合可驅(qū)動命名為pOSEL651的構(gòu)建物中的2D CD4蛋白最高水平表達(dá)(Chang等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.10011672-11677(2003))。將獨(dú)特的限制性位點(diǎn)，包括SacI、EcoRI、NheI、MfeI和XbaI，分別置于5’到3’末端各成份之間。用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)對每個組分進(jìn)行擴(kuò)增。用于本研究中詳細(xì)說明的融合構(gòu)建物不同部分PCR擴(kuò)增的寡多聚核苷酸引物如下P23.f 5’-GTGGAGCTCCCCGAAAAGCCCTGACAACCC-3’P23.r 5’-GGAAACACGCTAGCACTAACTTCATT-3’2DCD4.f5’-GCGGCTAGCAAGAAAGTTGTTTTAGGTAAA-3’2DCD4.r5’-GCACAATTGTGATGCCTTTTGAAAAGCTAA-3’CbsAss.f 5’-GCGAATTCAAGGAGGAAAAGACCACAT-3’CbsAss.r 5’-1CCAGCTAGCTGAAACAGTAGAAACGGC-3’計(jì)劃基序表面表達(dá)的蛋白質(zhì)包括10個氨基酸的c-Myc多肽(EQKLISEEDL)和含人CD4(2D CD4)N-末端兩個細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的前183個氨基酸。按照優(yōu)選的乳桿菌密碼子利用率將2D CD4蛋白重新編碼。所有的表達(dá)構(gòu)建物用DNA序列分析驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化到簡氏乳桿菌中。
c-Myc與簡氏乳桿菌假定的細(xì)胞壁錨定序列融合物的構(gòu)建我們最初選擇表位標(biāo)記來測定蛋白質(zhì)表達(dá)的水平和采用確定長度的假定細(xì)胞壁錨定序列來表面展示生物活性蛋白是否可行。為不破壞C-末端分類基序的功能，設(shè)計(jì)了5’末端含有10個氨基酸c-Myc表位(EQKLISEEDL)的寡多聚核苷酸引物，它可將c-Myc表位融合到假定的細(xì)胞壁錨定序列(包括簡氏乳桿菌1153的C14、C191和C370)的N-末端。該c-Myc序列或以直接融合于這些蛋白(C14、C191和C370的C-末端的30個氨基酸)的細(xì)胞壁錨定基序，或融合于含有C-末端細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域和各種長度的上游毗連氨基酸的序列。最值得注意的是，c-Myc融合于含有細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域和上游氨基酸的200個氨基酸的序列(命名為CWA200)上。
Myc14nhe(5’引物)(GCGCTAGCGAACAGAAACTGATCTCCGAAGAGGACCTGGTAACTCGTACTATCAATGTA)Myc14mfe(3’引物)(CGCCAATTGCTACTTTTGACGTTTCTTTCT)Myc191nhe(5’引物)(GCGCTAGCGAACAGAAACTGATCTCCGAAGAGGACCTGGACGTAGTAATTCCAGGAA)Myc191mfe(3’引物)(GCGCAATTGTTAATCTTCTTTTCTCTTCTT)Myc370nhe(5’引物)(GCGCTAGCGAACAGAAACTGATCTCCGAAGAGGACCTGTTGAAGAAGGCAGAAGAAGT)Myc370mfe(3’引物)(CCGCAATTGTTATGCTTCATCATCTTTTCT)將所有期望大小的PCR產(chǎn)物用凝膠純化并用MfeI和NheI消化。所得片段與用MfeI/NheI雙重消化的pOSEL651連接使c-Myc分別與pOSEL239(經(jīng)由C14序列的CWA200)、pOSEL240(經(jīng)由C191序列的CWA200)和pOSEL241(經(jīng)由C370序列)融合。所得到的質(zhì)粒通過電穿孔進(jìn)入簡氏乳桿菌1153。
將細(xì)胞壁錨定序列亞克隆到穿梭載體中選擇了3個含有C-末端LPQTG錨定基序的假定表面蛋白，測定它們在簡氏乳桿菌1153的細(xì)胞壁上表達(dá)外源蛋白的能力。含有C-末端LPQTG結(jié)構(gòu)域和這些表面蛋白上游200個氨基酸(暫命名為CWA200區(qū)域)的DNA區(qū)域用如下3套引物擴(kuò)增，C14 5’引物(GCGCAATTGGTAACTCGTACTATCAATGTA)3’引物(CGCTCTAGATACACAAACTATTTTACGGTC)C1915’引物(GCGCAATTGGACGTAGTAATTCCAGGAACA)3’引物(CGGTCTAGACCAAGCAATTTATATATTGCT)C3705’引物(GCGCAATTGAAGAAGGCAGAAGAAGT)3’引物(CCGTCTAGATTATGCTTCATCATCTTTTCT)
對C14錨定結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部MfeI位點(diǎn)和C370錨定結(jié)構(gòu)域的XbaI位點(diǎn)在限制性酶切反應(yīng)之前進(jìn)行定點(diǎn)誘變。所有具有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物用凝膠純化并用MfeI和XbaI消化。將所得片段與用MfeI/NheI雙重消化的、含有P23-調(diào)控分泌的2D CD4的pOSEL651連接，分別制備質(zhì)粒pOSEL237(經(jīng)由C14序列的CWA200)、pOSEL242(經(jīng)由C191序列的CWA200)和pOSEL249(經(jīng)由C370序列的CWA300)?；蛘邔14序列的C-末端36個氨基酸的錨定基序用下述兩個引物類似地克隆到穿梭載體中。
Mfecl4up5’GCGCAATTGCCACAAACTGGTTCTAAGACTXnacl4lo3’引物(CGCTCTAGATACACAACTATTTTACGGTC)將所有得到的質(zhì)粒在驗(yàn)證了DNA序列后用電穿孔進(jìn)入簡氏乳桿菌、加氏乳桿菌和干酪乳桿菌中。
C370序列的重復(fù)細(xì)胞壁跨越區(qū)域的亞克隆從簡氏乳桿菌1153基因組DNA擴(kuò)增C370的LPQTG基序上游的不同重復(fù)性細(xì)胞壁跨越區(qū)域。每個PCR反應(yīng)使用以下的5’引物和與之配對的相同的3’引物(5’-CCGTCTAGATTATGCTTCATCATCTTTTCT-3’)。
0重復(fù)5’-CGGCAATTGCCTCAAACTGGTACTGA-3’1個重復(fù) 5’-CGGCAATTGGGTCAAACTACAAATAAAGAT-3’2個重復(fù) 5’-CGCCAATTGGGTCAAACTACTGATAAGAGT-3’3個重復(fù) 5’-GCGCAATTGGGTCAAACTACAAATAAAGAT-3’4-8個重復(fù)5’-CGGCAATTGGGTCAAACTACTGACAAGAGC-3’下劃線的是這些引物中的MfeI和XbaI位點(diǎn)。
將所有具有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物用凝膠純化并用MfeI和XbaI消化。將所得片段與用MfeI/XbaI雙重消化的、含有P23-調(diào)控分泌的2D CD4的pOSEL237連接分別制備質(zhì)粒pOSEL262(無重復(fù))、pOSEL268(一個重復(fù))、pOSEL278(兩個重復(fù))、pOSEL284(三個重復(fù))、pOSEL280(四個重復(fù))、pOSEL275(六個重復(fù))、pOSEL281(七個重復(fù))和pOSEL276(八個重復(fù))。
細(xì)菌轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒通過電穿孔引入大腸桿菌DHl2S(Invitrogen)中。為構(gòu)建和維持穿梭質(zhì)粒，將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DHL2S細(xì)胞37℃培養(yǎng)在添加有10μg/ml氨芐西林或300μg/ml紅霉素的LB肉湯(Difco)中。在驗(yàn)證DNA序列后，按照Luchansky等人所述(J.Dairy Sci.74，3293-3302(1991))的改進(jìn)方法將得自大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到進(jìn)簡氏乳桿菌、加氏乳桿菌和干酪乳桿菌中。簡言之，將新鮮接種的簡氏乳桿菌37℃、5％CO2培養(yǎng)在MRS肉湯中直至OD600值為0.6-0.7。收集細(xì)菌細(xì)胞，洗滌，4℃重懸在925mM蔗糖和3.5mMMgCl2中。使用預(yù)冷的0.2cm的凹口比色杯，在感受態(tài)細(xì)胞中加入1～2μg的DNA立即用Gene Pulser II(Bio-Rad，Hercules，CA)以2.5kV/cm和200ohms對細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。細(xì)胞在37℃、預(yù)熱的MRS肉湯中恢復(fù)2小時后，接種到含有20μg/ml紅霉素(通常用于在液體培養(yǎng)基中常規(guī)增殖轉(zhuǎn)化的簡氏乳桿菌的濃度)的選擇性MRS平板上。
假定的細(xì)胞壁錨定序列的LPXTG基序的定點(diǎn)誘變使用Stratagene(La Jolla，CA)的QuickChangeXL定點(diǎn)誘變試劑盒來產(chǎn)生點(diǎn)突變。采用質(zhì)粒pOSEL237(通過C14序列的CWA200表達(dá)錨定的2D CD4)和質(zhì)粒pOSEL249(通過C370序列的CWA200表達(dá)錨定的2D CD4)作為模板。根據(jù)對應(yīng)于LPQTG和它在C14和C370側(cè)翼序列的核苷酸序列設(shè)計(jì)誘變用引物C14-GAAAGTAAGAAGACTTTACCACAAACTGGTTCTAAGACTGAA用簡氏乳桿菌1153優(yōu)選的密碼子選出取代的核苷酸237P(A)用丙氨酸取代C14的LPQTG上的脯氨酸5’-GAAAGTAAGAAGACTTTAGCACAAACTGGTTCTAAGA-3’5’-GTCTTAGAaccAGTTTGTGCTAAAGTCTTCTTACTTTC-3’237P(N)用天門冬酰胺取代C14的LPQTG上的脯氨酸5’-GAAAGTAAGAAGACTTTAAATCAAACTGGTTCTAAGAC-3’5’-GTCTTAGAACCAGTTTGATTTAAAGTCTTCTTACTTTC-3’
237T(A)用丙氨酸取代C14的LPQTG上的蘇氨酸5’-AGAAGACTTTACCACAAGCTGGTTCTAAGACTGAAC-3’5’-GTTCAGTCTTAGAACCAGCTTGTGGTAAAGTCTTCT-3’237T(G)用甘氨酸取代C14的LPQTG上的蘇氨酸5’-AGAAGACTTTACCACAAGGTGGTTCTAAGACTGAAC-3’5’-GTTCAGTCTTAGAACCACCTTGTGGTAAAGTCTTCT-3’237T(S)用絲氨酸取代C14的LPQTG上的蘇氨酸5’-AGAAGACTTTACCACAAAGTGGTTCTAAGACTGAAC-3’5’-GTTAGTTTCAGTACCACTTTGAGGCAATAGAGTTTG-3’237G(A)用丙氨酸取代C14的LPQTG上的甘氨酸5’-GACTTTACCACAAACTGCTTCTAAGACTGAACAAG-3’5’-CTTGTTCAGTCTTAGAAGCAGTTTGTGGTAAAGTC-3’249P(A)用丙氨酸取代C370的LPQTG上的脯氨酸5’-CATAAGCAAACTCTATTGGCTCAAACTGGTACTGAAAC3’5’-GTTTCAGTACCAGTTTGAGCCAATAGAGTTTGCTTATG-3’249P(N)用天門冬酰胺取代C370的LPQTG上的脯氨酸5’-CATAAGCAAACTCTATTGAATCAAACTGGTACTGAAAC3’5’-GTTTCAGTACCAGTTTGATTCAATAGAGTTTGCTTATG-3’249T(A)用丙氨酸取代C370的LPQTG上的蘇氨酸
5’-CAAACTCTATTGCCTCAAAGTGGTACTGAAACTAA-3’5’-GTTAGTTTCAGTACCAGTTTGAGGCAATAGAGTTTG-3’249T(G)用甘氨酸取代C370的LPQTG上的蘇氨酸5’-CAAACTCTATTGCCTCAAGGTGGTACTGAAACTAAC-3’5’-GTTAGTTTCAGTACCACCTTGAGGCAATAGAGTTTG-3’249T(S)用絲氨酸取代C370的LPQTG上的蘇氨酸5’-CAAACTCTATTGCCTCAAAGTGGTACTGAAACT-3’5’-GTTAGTTTCAGTACCACTTTGAGGCAATAGAGTTTG-3’249G(A)用丙氨酸取代C370的LPQTG上的甘氨酸5’-CTCTATTGCCTCAAACTGCTACTGAAACTAACCCAC-3’5’-GTGGGTTAGTTTCAGTAGCAGTTTGAGGCAATAGAG-3’聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)的條件是95℃50秒、60℃50秒和68℃12分鐘，共進(jìn)行16輪循環(huán)。
將Dpn I酶加入PCR反應(yīng)后的擴(kuò)增混合物中降解親代質(zhì)粒。按照生產(chǎn)商推薦方法將新合成的質(zhì)粒導(dǎo)入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌TOP10細(xì)胞(Invitrogen)中。將質(zhì)粒在添加有200μg/ml紅霉素的LB肉湯(Difco)中維持并擴(kuò)增。驗(yàn)證DNA序列后，按照Luchansky等人所述(j.Dairy Sci.74，3293-3302(1991))的改進(jìn)方法將得自大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到簡氏乳桿菌中。使用含有20μg/ml紅霉素的MRS選擇含有誘變質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化簡氏乳桿菌并使之增殖。
假定的細(xì)胞壁錨定蛋白的帶正電C-末端序列的缺失分析用PCR擴(kuò)增產(chǎn)生了一系列正電荷氨基酸位于C14和C370的C-末端的缺失突變體。用質(zhì)粒pOSEL237和pOSEL249作為模板。與pOSEL237和pOSEL249上的2D CD4序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸(CD4F5’-GATCGTGCTGATTCACGTCGT-3’)用作正向引物。下列的寡聚核苷酸(下劃線處是限制酶切位點(diǎn))用作反向引物，擴(kuò)增2D CD4cDNA和完整的C14和C370CWA200序列的C-末端。
C14-75’-GCGCTCTAGACTAAACACCTAAGCCTAATAAGC-3’C14-65’-GCGCTCTAGACTAGTTAACACCTAAGCCTAATAAG-3’C14-55’-GCGCTCTAGACTATCTGTTAACACCTAAGCC-3’370-10 5’-GCGCTCTAGATTAAAAAATTCCTGCGCCTAATG-3’370-95’-GCGCTCTAGATTATGCAAAAATTCCTGCGCCTAATG-3’370-85’-GCGCTCTAGATTACTTTGCAAAAATTCCTGCGCC-3’所有的反向引物均含有一XbaI限制位點(diǎn)。循環(huán)條件是94℃45秒、60℃45秒和72℃90秒，共進(jìn)行18輪循環(huán)。PCR產(chǎn)物用凝膠純化并用MfeI和XbaI消化，然后分別亞克隆到MfeI/XbaI雙重消化的pOSEL237和pOSEL249中。序列用核苷酸測序進(jìn)行驗(yàn)證，并通過電穿孔將構(gòu)建物轉(zhuǎn)入簡氏乳桿菌作蛋白分析。
在簡氏乳桿菌中表達(dá)的異源蛋白質(zhì)的Western分析將遺傳學(xué)修飾的簡氏乳桿菌在37℃、5％CO2，培養(yǎng)在含100mMHEPES、pH7.1的Rogosa SL緩沖肉湯中。為測定可溶性蛋白質(zhì)水平，12,000xg離心后收集條件培養(yǎng)基，然后用終濃度20％的TCA沉淀蛋白。TCA沉淀物用乙醇洗滌，空氣干燥，在50mMTris-HCl、pH6.8，0.4％SDS，6％蔗糖，10mM二硫蘇糖醇和0.01％溴酚藍(lán)(1x還原性SDS-PAGE緩沖液)中加熱變性。為測定簡氏乳桿菌中細(xì)胞相關(guān)蛋白的相對量，不誘導(dǎo)細(xì)胞裂解，37℃每OD600單位用100μl的1xSDS-PAGE緩沖液抽提30分鐘。12,000xg離心5分鐘后收集抽提的蛋白質(zhì)，接著加熱使之變性。14,000xg離心細(xì)菌細(xì)胞分離可溶性蛋白，然后按照生產(chǎn)商建議使用抗氧化劑在4-12％NuPAGE系統(tǒng)(Invitrogen)中用SDS-PAGE分辨該可溶性蛋白質(zhì)。電泳分離后，蛋白在20％甲醇、20mMTris和50mM甘氨酸中電印跡到聚二氟乙烯(polyvinylidinedifluoride)膜(Millipore)上。然后用多克隆兔抗-CD4抗體、T4-4(NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program)或兔抗-CV-NpAb和抗c-Myc的單克隆抗體(Invitrogen)檢測印跡。用堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗-兔IgG(檢測CD4)的顯色檢測試劑(Promega，Madison，WI)或用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的抗-鼠IgG(檢測c-Myc)的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(Amercham Bioscience，Piscataway，NJ)顯現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)。類似的，c-Myc標(biāo)記蛋白的水平用抗c-Myc的mAb(Invitrogen)檢測，結(jié)合抗體用HRP偶聯(lián)的抗-鼠第二抗體檢測(Amersham Bioscience)。
用溶菌酶對簡氏乳桿菌細(xì)胞壁進(jìn)行酶消化將含有109個細(xì)菌的細(xì)菌培養(yǎng)物12,000xg離心5分鐘。所得到的細(xì)菌沉淀用pH7.2的20mMHEPES中洗滌一次，重懸在100μl的10mMTris-HCl、pH8.1，1mMEDTA，25％的蔗糖(Piard等著，J.Bacteriol.1793068-3072(1997))中。存在溶菌酶時，將細(xì)菌細(xì)胞壁在37℃、用終濃度為15單位/ml的變?nèi)芫?Sigma Chemical Co.)消化1小時。然后，2,500xg離心細(xì)胞10分鐘將富含細(xì)胞壁的組分與富含原生質(zhì)體的組分相分離。在富含細(xì)胞壁或原生質(zhì)體的組分中分別加入25μl的4x或125μl的1x還原性SDS-PAGE緩沖液，將所得樣品加熱變性。此外，不額外處理樣品，用CD4ELISA分析富含細(xì)胞壁組分中的蛋白質(zhì)。
用磺基-NHS-生物素標(biāo)記簡氏乳桿菌中表面暴露的蛋白質(zhì)用不滲透磺基-N-羥琥珀酰亞胺基(NHS)-生物素的膜檢測簡氏乳桿菌表面蛋白中表面暴露的賴氨酰殘基。NHS-生物素表面標(biāo)記的革蘭氏陰性菌幽門螺桿菌可以鑒定真性細(xì)胞表面蛋白(Sabarth等著，J.Biol.Chem.7027896-27902(2002))。取對數(shù)生長期的大約109個簡氏乳桿菌細(xì)菌用PBS洗滌一次并重懸。在1ml的細(xì)胞懸液中加入磺基-NHS-生物素至終濃度1mM，室溫、連續(xù)搖動孵育30分鐘。然后加入pH8.0、50mMTris終止生物素化反應(yīng)，細(xì)胞用pH7.2、20mMHEPES洗滌一次。不誘導(dǎo)細(xì)胞裂解，37℃，用pH6.8的125μ l0.4％SDS、6％蔗糖、10mMDTT、50mMTris-HCl中抽提細(xì)胞相關(guān)蛋白30分鐘。14,000xg離心5分鐘使抽提的蛋白與細(xì)菌細(xì)胞分離。加熱變性后，在4-12％NuPAGE(Invitrogen)中分辨蛋白質(zhì)。在用堿性磷酸酶偶聯(lián)的鏈霉親和素或其它免疫學(xué)探針檢測后，測定了生物素化蛋白質(zhì)和其遷移率。
用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析2D CD4的表面表達(dá)將含有能在pOSEL651中表面表達(dá)蛋白或分泌蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的簡氏乳桿菌37℃、5％CO2，在含有20μg/ml紅霉素的MRS肉湯中培養(yǎng)過夜(OD600＞3)。將過夜培養(yǎng)物以1∶50～100稀釋液亞培養(yǎng)在用pH7.1、100mMHEPES緩沖(除非另有暗示)的含紅霉素的MRS或Rogosa SL肉湯中。12,000離心1mlOD～＝0.4的細(xì)胞培養(yǎng)物5分鐘。洗滌所得細(xì)胞沉淀兩次，用含有2％FBS的1xPBS液重懸。然后，細(xì)胞用含2％FBS的1xPBS配制的特異性抗體(1∶1000稀釋的兔多克隆T4.4或每2×108個細(xì)胞用50μg/ml的單克隆Sim.4)處理30分鐘，接著用FITC或藻紅素-偶聯(lián)的抗-兔或鼠抗體(Becton-Dickinson，Mountain View，CA)處理進(jìn)行表面染色。檢測表面表達(dá)的CV-N方法類似。對照同型-匹配的單克隆抗體處理(Becton-Dickinson)。標(biāo)記的細(xì)胞用1％(v/v)多聚甲醛固定并用帶CellQuest軟件運(yùn)行的FACScalibur系統(tǒng)(Becton-Dickinson)分析。背景對照的密度圖譜輸出(側(cè)向散射或正向散射對熒光作圖)得自含有pOSEL175的簡氏乳桿菌。各圖譜之間平均熒光強(qiáng)度的改變用作抗體與細(xì)菌表面結(jié)合的一種衡量，并用FLOWJO軟件計(jì)算。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用McCallus等著(Viral Immunol.5209-219(1992))的改進(jìn)CD4捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來測定正確折疊的2D CD4蛋白質(zhì)濃度。在Maxisorp96孔板(Nalge Nunc International，Denmark)上，用2.5μg/ml的單克隆抗體Sim.4捕獲無菌條件培養(yǎng)基中的正確構(gòu)型的2D CD4蛋白。結(jié)合的CD4分子用含0.05％Tween20的1xTris緩沖鹽水洗滌后，以大腸桿菌重折疊的2D CD4標(biāo)準(zhǔn)品為參考，用兔多克隆抗體T4-4檢測，然后于室溫、黑暗中，在含有3，3’5，5’四甲基聯(lián)苯胺(Neogen Corp.，Lexington，KY)的情況下用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG(Amersham Bioscience)進(jìn)行了30分鐘的檢測。加入100μl0.5MH2SO4終止反應(yīng)，用微滴板閱讀儀(Molecular Device，Sunnyvale，CA)讀取450nm吸光度。
提供上述實(shí)施例是為了說明本發(fā)明而非限制其范圍。對本發(fā)明的其它改變對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難明白均包括在本發(fā)明的權(quán)利要求中。本文引用的所有出版物、數(shù)據(jù)庫、Genebank序列、專利和專利申請均包括在參考文獻(xiàn)中。
序列表SEQ ID NO1C14序列1MNDSSIGTINITNDITITGKVNGLTTSGISDINKHFLYLQSEGSARDLTINGNGHRINFAGYSLALQNKNYTNAANPWNITLKDMTIEGSKYDYSPISFYGRKSNTENSKLTFDGVTANLNDRPLVDKYGENLPVHFAGENNITLNNMSIGYNLVTGKTVKFDSGNTTFNVDGKVTGNSINPDNWVIRSTENASNSENPSTLINEGATVTINAKSDDLRGIYAGRQLTAGQPIYGVTVINGTLNAKMAAGHSTAIWSHDLEIGKKGNVTIHTKQTNQADGVENGTSNSVTNYNGTHYAPISLGVGPISSVASPLSKQTVSLINNGSLTIIRDTAKKTLVPLISMGDGSLSSNTTLKFSVGAGATLDLQDKAGTFRYGIEPSTPLNGLVTLWGTSGTDLLEFLTPAYVNLQRTGDIRGTLIRMEGVYNSTTVNGPTPVAGWDQGNKTTTPNDVWYVRYLISANQWGNNSGQFMGKDQHPNTVVAKKGVDTLYNSNATVLMSKNQGADKYENGTMPTEVQQALHLNSFLNNFNFWRPQRMAMGSKLNDNPDVKIDDFDKYHAEAQTIDGTTRQTLSDLDANKGLKDLIGPDEQPITDFKDIVKHVTWYNSATDKDEWNKIMIQPTDSKDPSARVPYPEPQNPTGNLRTTDGFAWAKVTYADGSVDFVKIPLKVTEKKYSEELTPSYPGVSVEQGKSDSVDPSFKDENDKAADAPAGTKYTAGENTPDWIKVDPDTGKVTVSPTDDTSVGSHDISVTVTYPDSSTDQLTVPVTVTEKSNLAEKYPVSYDKLNVEKPSGDTPATGAVDPKAAADMPEGAITGYEKGDFDAPAGVTIDVNHDTGKVTASVGKNATLGSFEVPVKVTYSDGTYAEVKVPVSITGNKVDPGSGDVVYYGDQSMVVFNGNLTTVHKTTDSHELSAKDSAFQTITYYSDWNKKGNIVSDYNKHVIYKLSADGTKYVNEADATDSFDASAISFNWQKGYEVNTGVDNFSNGSADTLYQLEKGAVNSEEQTDANDPSGLAGNSKYRYDFSISDTNVLQKLGLSPAGYNAWANVYNFLGATGKINIPVNYGSEVSTDEAGIKNYLATNSISGKTFVNGNPTGIKWAENGMPGKDGKFAASNMTGIVEFTFDNGTKLNVQVTFKTGSHVSTSGSKVNDDTNLYVERTIEYDVTGTGHSPINSVTQKVHYVRDGYHKINADGTDAGEIIWNEWKLADGQTAEFPEYSVDQITGYDAYINGAKATQVDAAKVAETNGTPQNGQNITVTYKKQNSTPVPYKPGKDGVNDAINRYVTRTIIVKEPGKEPQTITQTVHFTNEDKDGNSGYKDPVTGEIKYNTDWHVASDLNAKTGSWEEYTAPSVTGYTPSQAKVEAKTVTAETEAASVTISYTKNADIPVPYKPGKDGVNDAINRYVTRTIIVKEPGKEPQTITQTVHFTNEDKDGNSGYKDPVTGEIKYNIDWHVASDLNAKTGSWEEYTAPSVTGYTPSQAKVEAKTVTAETEAASVTISYTKNADIPVPFDPSNKDMYREVTRTNVVDPITGKISTSVQTAKFIREDKNSNAGYTDPVTGKTTMNPWTPAKPGLRAVNVEQIKGYVAKVDGNVDAVVVTPDSANMVVTTTYQANKPEGQNITVKKDTVPDPADGIKNKDDLPDGTKYTWKEVPDVNSVGEKTGIVTVTFPDGTSVDVKVTVYVDPVVESNRDTLSKEANTGNTNVAKAATVTSSKVESKKTLPQTGSKTEQVGILGLAIATVGSLLGLGVNRKKRQK1765SEQ ID NO2C191序列1MPVANKPEGTVHTTYSWKDNIIPDTTKPGTKYGIVEVNFPDGSTKDVPVEVKVTSLASDYQNKIDTKQIIAKYKGNIPQASDGIANKDQATKEGDKDFPSLADVLAPNGIQWKKNFEPDLSKPGLTSGEAILTFKDGSTAEVTIPVLVQTDADRNTPETQTIKTLPGQTVNPEDGVINLHKPGENNPQLPDGTKVTFDNQSDVDDFIKHGMPGSDKSFDATVTYPDGTTDKIKLPVHITADNEVNTPITQGIITPKDSVPDANKGIANLKKATTKEGKTYPALPENTTVEWVNPGQMKTELENAKGGTTKNYDAVVIYDKSTEIVSIPVTVATDADTYKVVTQPIDLKDRNLPDNADDGITNLHKPADFKTPQLPDGTHAEWQDKDAAQEVVKNLKPGETVKLPATVVFPDGSKKGEGIDVSVHLHGQSDDYNIETQPVNTDKDGNLPENADSGIKNLGKLPEGTHASWGDGAQDIAKNLKPGETKDVPATVVFPDGSKKEITIPVHREGQSDGYDVEPQLVNTDKNGQLPNAKEGIKNLADLPEGTNPTWADRAQDKINKTKPGTDT
TAQVVVTFPDGSTKEVTVPVHKHGQSDDYGDKIVTQRVETDSHGQLPENADSGIKNLGDLPEGTHAVWGQGAQTIVDGMKPGETKDVPATIEFPDGSTKDVTIPVYKTSTRDQGTLNPPTDKVSVDDTKHITDEDKGKVIDNVKKSNPDKDITDAHVDDDGTFHGKVDGQDVVIPGTETVVEKQKESLNPPTDKVPVDDTKHITDEDKGKVIDNVKKSNPDKDITDAHVDDDGGTFHGKVDGQDVVIPGTETVVEKQKESLNPPTDKVPVDDTKHTTDEDKGKVIDNVKKSNPDKDITDAHVDDDGTFHGKVDGQDVVIPGIETVVEKSTNNQKSDTNKGLISNDNSEKNSHMINANVNTKSRNSLSAKQNRLPQTGSETSGLSALGLAMLSLVGLGFLIKKRKED974SEQ ID NO3C370序列1MFYQIDPALAPYIDKIVFSRALLSDGEATKDTSNEVPGATNVWTSGVLTTQNGPIRAALAGSTSSTYKIYLKADTPNSILSKPLSPTMWARYSSGHDMVSDFSKNLILNDNETTTFSSNNFFKSLDIVNNDGPILDNMSVDYSNKTVNTRYPRVNGSLLGDKSNLTLRIRGNDNLLKLIDKVKISNKTYTLANNTLKYRTGELYINDIGGSLGFLSSLSNRQDFNVTFYLKNGKSFADALTSESQKFDFQFGIYDTTDYATAFHSLDTVTNSLSTKTYTTGDKYNNQTYDLSTFKTILDKLIKQKQDNPTTYLSFEDKKISATENNPYEAVKLALESPTFTNISIAKSLVNAADCKQLDNTAKWAWDNGARDDLLKYLDVATKVASYIHLEFPTKPTDFSGLLLRYTRAGTFISAVDSDRDGVLDITEIDNSYGMNPSVYDTDGDGISDGQELREGRDPGVAPFNWTDANGNQLSIDVDTTTISGQLGNHNYHNEVMQPRTVNLYKVDDTGKKTLIAYTTSAVDQNGSFTLSKFTLNKGDKLVIGYVTPRTNKSLTDKDTILQQAFPTEQFSNEIIVKGKQVTVTFNMNGVSDDENQDIKVEKDSSFNKDSLTLPTPTMKTGYSFKEWNTQADGKGTVVTADTIFDTDTTVYAIGEKIKLPNPTNIKAETRTDDKTKSQETIITGKATPGATVTIKDNLGNEIGTGVANDAGNFEIKTTSPLAEATKVSVEATKGGESSDAVEATVEQNNFQKGNPLIQPASPTAVTAVTIKASDGTNNSTTVTGKAAAGETVTVKDSSGNEIGTGVVGEDGTFTITTNKPIAENERIQVVVTKDDAESEPTEAVVTAKTEPTNPTEVTAKTLPDGNSDSTIVAGKGKAGEVVTVKNDAGKVIGTGKVSDDGTFSIKTDEVIEPGKQVSVITTNDGMDSIPVPVTVSGETITSIKQSAKAAVDNLTYLNNAQKQSAKDAIDSANTVDEITTAKNNNAYSTDTNMKDLSEDTKLAADKTQDPYLNADLDKKQAYDKAVEEAQKLLNKETGTSVGADKDPAEVARIKQAVDDAYDALNGNSSLDDAKQKAKDAVDKNYTNLNDKQKETAKKRIDSAKSEDEVNNADKINSGLNNEKMGELKEVSNLSDKIETTSNYSNADSDKKQAYKETADKIHETVAPSGDDLTTDDVNNLITDEATKRAALNGDAREKARQELENNYNSGKSLQDGSTLDPRYYNASEEKKQAFQKALDNAKKALDNSETTEAEYKSANDELQKAKADLDGQTTDKSKLDDAIKDANNAKGTDKYKNASDDTKSKFDEALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNNLNGQTTDKSKLDDAIKDANNAKGTDKYKNASDDTKSKFDDALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLDEAITDANNTKLTDKYNNASDDTKSKFDEALKKAENVKNDSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLDEAITDANNTKSTDKYNNASDDTKSKFDEALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNNLDGQTTDKSKLDEAITDANNTKSTDKYKNASDDTKSKFDDALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTNKDTLNDATKDANDAKGTDKYKNASDDTKSKLDETLKKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLDEAIKSADDTKSTDKYNNASDDTKSKFDEALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATKNLKQAQNDLDGQTTNKDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDDATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLIASKDNAKIHKQTLLPQTGTETNPLTAIGIGLMALGAGIFAKKKRKDDEA1903
SEQ ID NO4KKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLDEAIKSADDTKSTDKYNNASDDTKSDALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATKNLKQAQNDLDGQTTNKDAINDAIKDANNAKGTDKYNNADSSTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDDATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLIASKDNAKIHKOTLSEQ ID NO5GQTTNKDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDDATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLIASKDNAKIHKQTLSEQ ID NO6VIRTINVVDPITGKISTSVQTAKFTREDKNSNAGYTDPVTGKTTMNPWTPAKQGLRAVNVEQIKGYVAKVDGNVDAVVVTPDSANMVVTITYQANKPEGQNITVKKDTVPDPADGIKNKDDLPDGTKYTWKEVPDVNSVGEKTGIVTVTFPDGTSVDVKVTVYVDPVVESNRDTLSKEANTGNTNVAKAATVTSSKVESKKTSEQ ID NO7VTRTINVVDPITGKISTSVQTAKFTREDKNSNAGYTDPVTGKTTMNPWTPAKQGLRAVNVEQIKGYVAKVDGNVDAVVVTPDSANMVVTITYQANKPEGQNITVKKDTVPDPADGIKNKDDLPDGTKYTWKEVPDVNSYGEKTGIVTVTFPDGTSVDVKVTVYVDPVVESNRDTLSKEANTGNTNVAKAATVTSSKVESKKTLPQTGSKTEQVGILGLAIATVGSLLGLGVNSEQ ID NO8KKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLTEAIKSADDTKSTDKYNNASDDTKSKFDEALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATKNLKQAQNDLDGQTTNKDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDDATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLKDNAKIHKQTLLPQTGTETNPLTAIGIGLMALGAGIFA
權(quán)利要求
1.一種含有表達(dá)盒的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述表達(dá)盒含有操作性連接于編碼信號序列和生物活性多肽的多聚核苷酸的啟動子，其中，所述生物活性多肽與異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域相連，其中所述異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有按以下順序排列的序列細(xì)胞壁相關(guān)序列；LPQ(S/A/T)(G/A)；和疏水序列。
2.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)胞壁相關(guān)序列含有至少50個氨基酸。
3.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)胞壁相關(guān)序列含有至少200個氨基酸。
4.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域在該區(qū)域的羧基末端還含有一帶電荷的序列。
5.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述乳桿菌屬細(xì)菌是寄居在陰道的菌株。
6.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述乳桿菌屬細(xì)菌選自簡氏乳桿菌、加氏乳桿菌和干酪乳桿菌。
7.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQSG。
8.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQAG。
9.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQTG。
10.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQTA。
11.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有SEQ ID NO7。
12.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有SEQ ID NO8。
13.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述生物活性多肽表達(dá)在細(xì)菌細(xì)胞壁上。
14.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述生物活性多肽在10-600個氨基酸之間。
15.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，當(dāng)生物活性蛋白與病原體接觸時能與病原體結(jié)合。
16.如權(quán)利要求15所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述病原體是細(xì)菌病原體。
17.如權(quán)利要求15所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述病原體是真菌病原體。
18.如權(quán)利要求15所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述病原體是病毒病原體。
19.如權(quán)利要求18所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述病毒病原體是HIV。
20.如權(quán)利要求19所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述生物活性蛋白是CD4或CD4的HIV結(jié)合片段。
21.如權(quán)利要求19所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述生物活性蛋白是2D-CD4。
22.如權(quán)利要求18所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述生物活性蛋白是藍(lán)病毒素-N或藍(lán)病毒素-N的病毒結(jié)合片段。
23.如權(quán)利要求18所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述病毒病原體是單純皰疹病毒。
24.如權(quán)利要求18所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述生物活性蛋白是單純皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)C(HveC)或HveC的病毒結(jié)合片段。
25.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述生物活性多肽釋放自乳桿菌屬細(xì)菌。
26.如權(quán)利要求4所述的乳桿菌屬細(xì)菌，其特征在于，所述生物活性多肽錨定到乳桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞壁上。
27.一種在乳桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞壁上表達(dá)生物活性多肽的方法，其特征在于，所述方法包括提供含有一表達(dá)盒的乳桿菌屬細(xì)菌，該表達(dá)盒含有一通過操作性連接于編碼信號序列和生物學(xué)活性多肽的多聚核苷酸的啟動子，其中所述生物活性多肽與異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域相連，該異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有按下列順序排列的序列細(xì)胞壁相關(guān)序列；LPQ(S/A/T)(G/A)；和疏水序列；并且在誘導(dǎo)表達(dá)該多肽的條件下培養(yǎng)這種細(xì)菌，從而在乳桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞壁上表達(dá)生物活性多肽。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁相關(guān)序列至少含有50個氨基酸。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁相關(guān)序列至少含有200個氨基酸。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域在該區(qū)域的羧基末端還含有一帶電荷的序列。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，提供的步驟包括將所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到所述細(xì)菌中。
32.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQSG。
33.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQAG。
34.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQTG。
35.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有氨基酸序列LPQTA。
36.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有SEQID NO7。
37.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有SEQID NO8。
38.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有至少200個氨基酸。
39.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述乳桿菌屬細(xì)菌是寄居在陰道的菌株。
40.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述乳桿菌屬細(xì)菌選自簡氏乳桿菌、加氏乳桿菌和干酪乳桿菌。
41.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述生物活性多肽在10-600個氨基酸之間。
42.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，當(dāng)生物學(xué)活性蛋白與病原體接觸時能與病原體結(jié)合。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述病原體是細(xì)菌病原體。
44.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述病原體是真菌病原體。
45.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述病原體是病毒病原體。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒病原體是HIV。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述生物活性蛋白是CD4或CD4的HIV結(jié)合片段。
48.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述生物活性蛋白是2D-CD4。
49.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述生物活性蛋白是藍(lán)病毒素-N或藍(lán)病毒素-N的病毒結(jié)合片段。
50.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒病原體是單純皰疹病毒。
51.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)活性蛋白是單純皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)C(HveC)或HveC的病毒結(jié)合片段。
52.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述生物活性多肽釋放自乳桿菌屬細(xì)菌。
53.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述生物活性多肽錨定到乳桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞壁上。
54.一種在哺乳動物粘膜表面提供生物活性蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括使粘膜表面與乳桿菌屬細(xì)菌相接觸，該細(xì)菌經(jīng)重組轉(zhuǎn)變可表達(dá)操作性連接于一生物活性多肽的信號序列，而該生物活性多肽連接于異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域，該異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域含有按以下順序排列的序列細(xì)胞壁相關(guān)序列；LPQ(S/A/T)(G/A)；和疏水序列，其中，收集自粘膜表面的樣品中所述生物活性多肽的表達(dá)量要能被檢測到。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁相關(guān)序列至少含有50個氨基酸。
56.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁相關(guān)序列至少含有200個氨基酸。
57.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述異源性羧基末端細(xì)胞壁靶向區(qū)域在該區(qū)域的羧基末端還含有一帶電荷的序列。
58.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述乳桿菌屬細(xì)菌選自簡氏乳桿菌、加氏乳桿菌和干酪乳桿菌。
59.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述粘膜表面位于陰道內(nèi)。
60.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述粘膜表面位于胃腸道內(nèi)。
61.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述接觸步驟包括經(jīng)口給予所述乳桿菌屬細(xì)菌。
62.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述接觸步驟包括經(jīng)陰道給予所述乳桿菌屬細(xì)菌。
63.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述接觸步驟包括經(jīng)直腸給予所述乳桿菌屬細(xì)菌。
64.一種含有操作性連接于編碼一信號序列和生物活性多肽的多聚核苷酸的啟動子的表達(dá)盒，其特征在于，所述生物活性多肽與SEQ ID NO7或SEQ ID NO8相連。
65.一種含有權(quán)利要求64所述表達(dá)盒的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了將異源多肽靶向定位到細(xì)菌細(xì)胞壁上的方法和組合物。
文檔編號C12N1/21GK101076599SQ200480008164
公開日2007年11月21日 申請日期2004年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月29日
發(fā)明者張家華, 劉曉文, J·A·萊維克, 徐強(qiáng) 申請人:奧賽爾股份有限公司