專利名稱：抗體疫苗綴合物及其用途的制作方法
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背景技術(shù)：
免疫應(yīng)答起始于專職抗原呈遞細(xì)胞(APC)水平，此類細(xì)胞包括存在于機(jī)體組織中的樹突細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì)胞(Mg)。DC表達(dá)高水平的細(xì)胞表面分子和與T淋巴細(xì)胞相互作用的補(bǔ)體受體，從而誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。DC也分泌細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶，這些物質(zhì)啟動(dòng)免疫應(yīng)答并使細(xì)胞和體液兩種免疫的擴(kuò)增達(dá)到頂點(diǎn)。
DC在其表面表達(dá)結(jié)合抗原片段的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子。表達(dá)識(shí)別這類抗原-MHC復(fù)合體的T細(xì)胞受體(TCR)的T細(xì)胞成為活化的并啟動(dòng)免疫級(jí)聯(lián)。一般而言，有兩種類型的MHC分子，MHC I類和MHC II類分子。MHC I類分子將抗原呈遞給特異性分化群(CD)8+T細(xì)胞，MHC II類分子將抗原呈遞給特異性CD4+T細(xì)胞。
為有效治療許多疾病，特別是癌，疫苗必須引發(fā)有效的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，亦稱細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。細(xì)胞毒性T細(xì)胞主要包括在MHC I類情況下識(shí)別抗原的CD8+T細(xì)胞。與MHC I類分子有關(guān)的抗原加工明顯與MHC II類分子的不同。外源性遞送到APC的抗原主要與MHC II類分子一起加工。與此相對(duì)，由于MHC I類分子位于細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)源性遞送到APC的抗原主要與MHC I類分子一起加工。這不僅對(duì)APC成立，對(duì)所有表達(dá)MHC I類分子，并在它們的表面連續(xù)展示與MHC I類分子相關(guān)的內(nèi)源產(chǎn)生的抗原的有核細(xì)胞也成立。
由于這個(gè)原因，當(dāng)病毒或腫瘤抗原作為結(jié)合在MHC I類分子上的肽被展示時(shí)，表達(dá)獨(dú)特蛋白的感染病毒的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞可被CTL靶向。然而，在特定條件下，DC也能使外源抗原進(jìn)入內(nèi)部區(qū)室結(jié)合到MHC I類分子上，致使它們經(jīng)由MHC I類和II類兩種途徑呈遞給T細(xì)胞。此過(guò)程稱為交叉敏化或交叉呈遞。
因此，盡管抗體介導(dǎo)應(yīng)答已經(jīng)證明對(duì)具體疾病的給人留下深刻印象的預(yù)防或治療功效，但當(dāng)針對(duì)具體分泌的或細(xì)胞表面抗原時(shí)，許多疾病的最有效免疫療法看來(lái)都要求T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，尤其是CTL應(yīng)答。由于有效的CTL應(yīng)答并不限于細(xì)胞外抗原，所以有可能開發(fā)不為有效抗體靶的基于抗原的治療疫苗。因此，響應(yīng)疾病相關(guān)抗原而發(fā)生的CTL新的產(chǎn)生方法具有重大意義，因?yàn)?，一般認(rèn)為這些細(xì)胞對(duì)許多疫苗是至關(guān)重要的，并對(duì)大多數(shù)治療性癌疫苗是必不可少的。
至今，一種已經(jīng)過(guò)測(cè)試的接種方法使用抗原肽進(jìn)行免疫。此免疫方法繞過(guò)抗原攝取和加工的需求，并依賴所述肽直接結(jié)合到已經(jīng)表達(dá)在APC表面的MHC I類分子的能力。盡管此方法已經(jīng)清楚地顯示出患者體內(nèi)CTL誘導(dǎo)的證據(jù)，但是該方法有一些限制。所述抗原肽一定要預(yù)先建立，不同的肽要求具有不同MHC單元型的個(gè)體，并且肽在體內(nèi)存活期短。
另一種已經(jīng)過(guò)測(cè)試的接種方法使用抗體-抗原復(fù)合物。Paul等(62)表明，特異性針對(duì)所給抗原的抗體會(huì)增加小鼠針對(duì)所述抗原的體液免疫應(yīng)答，大概通過(guò)將免疫復(fù)合物傳遞給表達(dá)在APC上的IgG的Fc受體(FcγR)。Wernersson及其同事(63)用免疫復(fù)合物研究個(gè)體FcγR在增強(qiáng)體內(nèi)免疫應(yīng)答中的作用。他們的研究證明FcγRI足以介導(dǎo)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。然而，這類免疫復(fù)合物并不特異性靶向APC，雖然它們也在許多與抗原呈遞無(wú)關(guān)細(xì)胞上結(jié)合Fc受體，由此降低抗原遞送的效率。
后來(lái)的研究已經(jīng)使用了將抗原選擇性地靶向APC上的各種受體的抗體，并且已經(jīng)證明這類選擇性給予能夠誘導(dǎo)體液應(yīng)答(66，67)。此外，在MHC I類情況下，已經(jīng)表明結(jié)合到DC上FcR上的免疫復(fù)合物被加工并呈遞(64，65)。此外，許多這類FcR-靶向方法是受限制的，因?yàn)镕cR被表達(dá)在許多非APC例如血小板和嗜中性白細(xì)胞上。理想條件下，特異性靶向APC并能夠誘導(dǎo)有效MHC I類限制性CTL應(yīng)答，以及誘導(dǎo)有效MHC II類-限制性TH應(yīng)答的疫苗可在治療某些疾病上提供增強(qiáng)的功效。
類似地，甘露糖基化抗原已經(jīng)表現(xiàn)出誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，例如CTL應(yīng)答。然而，甘露糖基化抗原不特異性靶向APC，原因在于其它甘露糖結(jié)合蛋白非常豐富。而且，甘露糖基化蛋白由未成熟DC通過(guò)大胞飲機(jī)制內(nèi)化。因此，通過(guò)抗原的甘露糖基化產(chǎn)生的機(jī)制和免疫應(yīng)答的性質(zhì)與通過(guò)用抗體將抗原特異性靶向甘露糖受體所產(chǎn)生的截然不同。
由于現(xiàn)有方法并沒(méi)有有效和特異地靶向APC，許多治療用疫苗要求從患者中純化DC，接觸抗原后再回輸給同一患者。
因此，存在能夠有效靶向APC和產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答(包括抗原特異性CTL應(yīng)答，其為有效治療許多疾病所必需的)改進(jìn)疫苗的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明提供基于抗體的疫苗和產(chǎn)生有效治療許多疾病所必需的抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。具體地說(shuō)，有效抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答通過(guò)用結(jié)合到表達(dá)于APC的特定受體上的抗體，將一種或多種蛋白抗原靶向抗原呈遞細(xì)胞(APC)來(lái)誘導(dǎo)。優(yōu)選的受體包括C-凝集素，尤其是表達(dá)于樹突細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì)胞兩者上的人甘露糖受體。如本發(fā)明的方法所證明，用抗體-抗原綴合物靶向甘露糖受體導(dǎo)致經(jīng)由MHC I類和II類兩種途徑加工抗原。因此，抗原特異性CTL(例如CD8+T細(xì)胞)被誘導(dǎo)，其它重要的效應(yīng)T細(xì)胞，包括輔助T細(xì)胞(例如CD4+T細(xì)胞)也被誘導(dǎo)。
因此，一方面，本發(fā)明通過(guò)形成抗原和結(jié)合到人APC上的單克隆抗體(例如結(jié)合到表達(dá)于人APC上的人甘露糖受體上的單克隆抗體)的綴合物，提供一種誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)抗原的CTL應(yīng)答的方法。然后，使綴合物在體內(nèi)或活體外與APC接觸，致使抗原以誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)抗原的CTL應(yīng)答(例如CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)的方式被內(nèi)化、加工并呈遞給T細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這也用來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)抗原的輔助T細(xì)胞應(yīng)答(例如CD4+輔助T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)。因此，免疫應(yīng)答經(jīng)由MHC I類和MHC II類兩種途徑誘導(dǎo)。APC也可與佐劑、刺激樹突細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子和/或免疫刺激劑接觸以進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
不少合適的抗體可用于本發(fā)明綴合物中，包括但不限于來(lái)源于任何物種(例如人、鼠、兔等)的抗體和/或基因工程和重組表達(dá)的抗體(例如嵌合抗體、人源化抗體和人抗體)。優(yōu)選的抗體包括人單克隆抗體。用于本發(fā)明的抗體也可包括任何抗體同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE，盡管優(yōu)選的抗體為IgG同種型?？贵w可為全抗體或其抗原結(jié)合片段，包括例如Fab、F(ab′)2、Fv和單鏈Fv片段。
用于本發(fā)明的優(yōu)選抗體包括結(jié)合到人甘露糖受體上的人單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體由人重鏈和人κ輕鏈核酸編碼，該核酸在其可變區(qū)中包含分別示于SEQ ID NO3和SEQ ID NO7的核苷酸序列，或者與SEQ ID NO3或SEQ ID NO7同源性足夠高的核苷酸序列，致使抗體保持結(jié)合到樹突細(xì)胞上的能力。
另一些優(yōu)選的人抗體包括以結(jié)合到人甘露糖受體上并具有人重鏈可變區(qū)和人κ輕鏈可變區(qū)為特征的抗體，可變區(qū)包含分別示于SEQID NO4和SEQ ID NO8的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO4或SEQID NO8同源性足夠高的氨基酸序列，致使抗體保持結(jié)合到樹突細(xì)胞上的能力。
另一些本發(fā)明具體人抗體包括包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的抗體，互補(bǔ)決定區(qū)具有人重鏈和輕鏈CDR1區(qū)、人重鏈和輕鏈CDR2區(qū)及人重鏈和輕鏈CDR1區(qū)，其中(a)人重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)包含選自圖8中顯示的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO13、14、15)，及其保守序列修飾(conservative sequence modifications)；和(b)人輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)包含選自圖9中顯示的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO16、17、18)，及其保守序列修飾。
得自具體種系序列的抗體，例如，用人免疫球蛋白序列從系統(tǒng)中獲得的抗體，如通過(guò)免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或通過(guò)篩選人免疫球蛋白基因文庫(kù)獲得的抗體，也包括在本發(fā)明中。
用于本發(fā)明的人抗體可在宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生，例如含有抗體重鏈和輕鏈編碼核酸的轉(zhuǎn)染瘤(例如由無(wú)限增殖化CHO細(xì)胞或淋巴細(xì)胞組成的轉(zhuǎn)染瘤)，或者直接得自表達(dá)抗體的雜交瘤(例如其包括得自轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物如轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞，其基因組包含編碼抗體的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因，并且與無(wú)限增殖化細(xì)胞融合)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體由雜交瘤產(chǎn)生，或者由含有人重鏈和人輕鏈核酸的宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)轉(zhuǎn)染瘤產(chǎn)生，所述人重鏈和人輕鏈核酸分別包含核苷酸序列SEQ ID NO3和7，及其保守修飾。
用于本發(fā)明的合適抗原包括任何抗原或其抗原部分，其為保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答所必需的，包括例如各種腫瘤和感染性疾病。具體的抗原其中可選自人絨毛膜促性腺激素β亞單位(βhCG)、Gp100、前列腺相關(guān)抗原(PSA)、Pmel-17、來(lái)源于結(jié)腸、肺、胰腺、乳腺、卵巢和生殖細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞抗原、病毒蛋白、細(xì)菌蛋白、糖類和真菌蛋白。根據(jù)本發(fā)明，這類抗原結(jié)合抗體以形成高度有效的抗體疫苗綴合物。
另一方面，本發(fā)明提供具體包括與結(jié)合人甘露糖受體的抗體連接的βhCG的抗體疫苗綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物包含與βhCG連接的人重鏈，例如本文所述的其重鏈包含SEQ ID NO10中所示的氨基酸序列的B11-βhCG綴合物。也提供單鏈形式的B11-βhCG綴合物，其包含SEQ ID NO12中所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供含有一種或多種本發(fā)明抗體疫苗綴合物的組合物(例如藥物組合物)。
所述組合物可額外包括一種或多種佐劑或其它已知增強(qiáng)免疫應(yīng)答和/或增加APC活性的試劑。
根據(jù)下文的發(fā)明詳述和所附權(quán)利要求書，本發(fā)明其它特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示分子綴合物(SEQ ID NO11和12)圖譜，該綴合物編碼含有與βhCG抗原連接的單鏈B11抗體的融合蛋白(pB11sfv-βhCG)。
圖2顯示分子綴合物(SEQ ID NO9和10)圖譜，該綴合物編碼含有與βhCG抗原連接的全B11抗體的融合蛋白(βhCG-B11構(gòu)建體)。
圖3是分子綴合物的示意圖?？乖c完整抗體的重鏈發(fā)生遺傳性融合。
圖4是流式細(xì)胞術(shù)研究的圖，顯示βhCG-B11構(gòu)建體特異性結(jié)合表達(dá)MR的培養(yǎng)的人DC。
圖5是一幅曲線圖，顯示βhCG-B11構(gòu)建體誘導(dǎo)βhCG特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
圖6是一幅柱狀圖，顯示βhCG-B11構(gòu)建體誘導(dǎo)βhCG特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
圖7是一幅柱狀圖，顯示βhCG-B11構(gòu)建體誘導(dǎo)T輔助應(yīng)答。
圖8顯示帶有指定CDR區(qū)(SEQ ID NO13、14和15)的人單克隆抗體B11的重鏈V區(qū)核苷酸序列(SEQ ID NO3)和相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖9顯示帶有指定CDR區(qū)(SEQ ID NO16、17和18)的人單克隆抗體B11的輕(κ)鏈V區(qū)核苷酸序列(SEQ ID NO7)和相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
圖10是根據(jù)運(yùn)用基于網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)算法(BIMAS & SYFPEITHI)分析，顯示βhCG-B11構(gòu)建體的預(yù)測(cè)T細(xì)胞表位的示意圖。發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞表位潛在結(jié)合HLA-A2、HLA-B7和HLA-DR分子。根據(jù)βhCG-B11的B11區(qū)段，也預(yù)測(cè)了一些表位。在長(zhǎng)37個(gè)氨基酸的C端肽中沒(méi)有鑒定出T細(xì)胞表位。
圖11是一幅曲線圖，顯示對(duì)βhCG-B11構(gòu)建體特異性的CTL識(shí)別由DC呈遞的scFv形式的抗原，B11sfv-βhCG。
圖12顯示人單克隆抗體B11重鏈V區(qū)的氨基酸序列(SEQ IDNO4)和種系序列(SEQ ID NO30)即VH5-51種系，并將其進(jìn)行比較。
圖13顯示人單克隆抗體B11重鏈V區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO3)和種系序列(SEQ ID NO29)即VH5-51種系，并將其進(jìn)行比較。
圖14顯示帶有指定CDR區(qū)的人單克隆抗體B11輕(κ)鏈V區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO8)和種系序列(SEQ ID NO32)即Vκ5-L15種系，并將其進(jìn)行比較。
圖15顯示帶有指定CDR區(qū)的人單克隆抗體B11輕(κ)鏈V區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO7)和種系序列(SEQ ID NO31)即Vκ5-L15種系，并將其進(jìn)行比較。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)用針對(duì)特定細(xì)胞受體的抗體將抗原靶向抗原呈遞細(xì)胞(APC)，可以產(chǎn)生重要的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。準(zhǔn)確地說(shuō)，為了有效治療癌癥和感染性疾病等多種疾病，疫苗必須誘發(fā)有效的抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，在MHC I類情況下主要由識(shí)別抗原的CD8+T細(xì)胞所介導(dǎo)。為了優(yōu)化免疫，優(yōu)選伴有其它重要的效應(yīng)T細(xì)胞功能，包括誘導(dǎo)抗原特異性輔助T細(xì)胞，例如在MHC II類途徑情況下識(shí)別抗原的CD4+T細(xì)胞。因此，有效的疫苗應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)抗原特異性CTL，優(yōu)選與其它T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答一道經(jīng)由多種MHC途徑誘導(dǎo)抗原特異性CTL。
因此，本發(fā)明提供新型基于抗體的疫苗綴合物和誘導(dǎo)或增強(qiáng)抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的方法。本發(fā)明療法使用包含抗體的分子綴合物，所述抗體結(jié)合到帶有抗原的抗原呈遞細(xì)胞(APC)上，例如樹突細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì)胞。
靶向APC的抗體是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如靶向APC上I類或II類主要組織相容性(MHC)決定簇的抗體(78，79，81，83)。其它抗體包括靶向APC上Fc受體的抗體(77，79，80，81，82，83)，以及B細(xì)胞上的表面免疫球蛋白(84)。
在一個(gè)本文示例性的具體實(shí)施方案中，分子綴合物包括結(jié)合到人DC上甘露糖受體(MR)上的與βhCG抗原連接的抗體。這類綴合物可與APC在體內(nèi)或活體外接觸以產(chǎn)生所需的CTL應(yīng)答。
為使本發(fā)明更易于理解，首先定義某些術(shù)語(yǔ)。其它的定義在發(fā)明詳述中給出。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗原呈遞細(xì)胞(APC)”是指一類免疫細(xì)胞，該細(xì)胞能夠以能被免疫系統(tǒng)識(shí)別的方式內(nèi)化并加工抗原，致使抗原決定簇作為MHC相關(guān)復(fù)合體呈遞在細(xì)胞表面(例如MHC I類限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和/或MHC II類限制性輔助T淋巴細(xì)胞)。使得細(xì)胞起APC作用的兩個(gè)必要性質(zhì)為加工吞入細(xì)胞的抗原的能力和表達(dá)MHC基因產(chǎn)物的能力。APC的實(shí)例包括樹突細(xì)胞(DC)、單核吞噬細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞)、B淋巴細(xì)胞、皮膚朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cells)和人體中的內(nèi)皮細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“樹突細(xì)胞(DC)”，包括未成熟DC和成熟DC和能夠分化成DC的相關(guān)骨髓樣祖細(xì)胞或相關(guān)抗原呈遞細(xì)胞(例如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。DC表達(dá)高水平的細(xì)胞表面分子和與T淋巴細(xì)胞相互作用的補(bǔ)體受體(例如C型凝集素，諸如甘露糖受體)，因此能夠誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。DC也分泌細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶，這些物質(zhì)能夠啟動(dòng)免疫應(yīng)答并使細(xì)胞免疫和體液免疫的擴(kuò)增達(dá)到頂點(diǎn)。DC也在其表面表達(dá)結(jié)合抗原片段的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子。識(shí)別這些抗原-MHC復(fù)合體的T細(xì)胞成為活化的并啟動(dòng)免疫級(jí)聯(lián)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明分子綴合物的抗體部分結(jié)合到樹突細(xì)胞上，導(dǎo)致樹突細(xì)胞內(nèi)化所述綴合物。
術(shù)語(yǔ)“巨噬細(xì)胞甘露糖受體”或“MR”是指C型凝集素受體家族成員，其特征在于胞外部分重復(fù)的糖識(shí)別域(CDR)和含有兩種推定網(wǎng)格蛋白打靶序列的短胞質(zhì)尾區(qū)(34，35，37)。此外，MR含有N端豐富的半胱氨酸和纖連蛋白域。甘露糖受體的不同域具有特異性結(jié)合各種配體的能力，包括溶酶體酶、微生物、垂體激素、糖胺聚糖和硫酸化血型抗原(38-40)。
“MHC分子”包括兩類分子，MHC I類和MHC II類。MHC I類分子將抗原呈遞給特異性CD8+T細(xì)胞，MHC II類分子將抗原呈遞給特異性CD4+T細(xì)胞。外源性遞送到APC的抗原主要與MHC II類分子一起加工。與此相對(duì)，內(nèi)源性遞送到APC的抗原主要與MHCI類分子一起加工。但是，在特殊情況下，除MHC II類分子以外，DC具有獨(dú)特的能力使外源抗原進(jìn)入內(nèi)部區(qū)室以結(jié)合到MHC I類分子上。這一過(guò)程稱為“交叉敏化”或“交叉呈遞”。
本文所用的術(shù)語(yǔ)抗原“交叉呈遞”是指經(jīng)由APC上的MHC I類和II類兩種分子將外源蛋白抗原呈遞給T細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答”是指所有由T細(xì)胞，包括效應(yīng)T細(xì)胞(例如CD8+細(xì)胞)和輔助T細(xì)胞(例如CD4+細(xì)胞)介導(dǎo)的應(yīng)答。T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答包括例如T細(xì)胞細(xì)胞毒性和增殖。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答”是指由細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。CTL應(yīng)答主要由CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括全抗體或其抗原結(jié)合片段(包括例如Fab、F(ab′)2、Fv和單鏈Fv片段。合適的抗體包括任何形式的抗體，例如鼠抗體、人抗體、嵌合抗體或人源化抗體和任何類型的抗體同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE同種型。本文所用“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別。
全抗體含有通過(guò)二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(在本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由CH1、CH2和CH3三個(gè)區(qū)組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在本文縮寫為L(zhǎng)CVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)CL區(qū)組成。VH區(qū)和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，稱為“互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)”，該區(qū)散在更保守的區(qū)域中，所述保守區(qū)稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，按照以下順序從氨基端到羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白結(jié)合到宿主組織或因子上，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。
優(yōu)選的本發(fā)明抗體包括人抗體，例如具有IgG1(例如IgG1k)重鏈和κ輕鏈的人抗體。其它優(yōu)選的本發(fā)明抗體結(jié)合人DC，例如結(jié)合人DC上C型凝集素受體的抗體，如人DC上的MR。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗體為人單克隆抗體，該抗體結(jié)合到經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定分子量約為180kD的人巨噬細(xì)胞甘露糖受體(在本文亦稱“人B11抗原”)上。產(chǎn)生這類抗體的方案描述于WO 01/085798，其所述內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。具體人抗體包括包含分別如SEQ ID NO2和SEQ ID NO6中所示的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的抗體，或者與SEQ ID NO2或SEQ ID NO6同源性足夠高的氨基酸序列，致使所述抗體保持結(jié)合到樹突細(xì)胞上的能力。
本文所用的術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱“抗體部分”)，是指一種或多種保持特異性結(jié)合到抗原(例如樹突細(xì)胞上的抗原)上能力的抗體片段。已經(jīng)證明，抗體的抗原結(jié)合功能可由全長(zhǎng)抗體片段執(zhí)行。包括在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”之內(nèi)的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1區(qū)組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab′)2片段，包含由二硫橋在鉸鏈區(qū)連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CH1區(qū)組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL區(qū)和VH區(qū)組成的Fv片段，(v)由VH區(qū)組成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341544-546)；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。而且，盡管Fv片段的VL和VH兩個(gè)區(qū)由獨(dú)立的基因編碼，但是它們可以連接在一起，方式為用重組方法，通過(guò)合成接頭使它們以單一蛋白鏈形式產(chǎn)生，其中VL區(qū)和VH區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見(jiàn)例如Bird等(1988)Science242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。這類單鏈抗體也意指包括在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”之內(nèi)。這些抗體片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，并且以與完整抗體相同方式篩選所述片段的實(shí)用性。
本文所用術(shù)語(yǔ)“人抗體”，是用來(lái)包括具有來(lái)源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括不為人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如隨機(jī)或體外定點(diǎn)誘變或由體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。然而，本文所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”，不是用來(lái)包括抗體中來(lái)源于另一哺乳動(dòng)物種系(例如小鼠)的CDR序列例如已經(jīng)移植到人構(gòu)架序列中的抗體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指單分子組合物的抗體分子制劑。單克隆抗體組合物對(duì)特定表位表現(xiàn)出單一結(jié)合特異性和結(jié)合親和性。因此，術(shù)語(yǔ)“人單克隆抗體”是指表現(xiàn)出單一結(jié)合特異性的抗體，其可變區(qū)和恒定區(qū)來(lái)源于人種系免疫球蛋白序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括與無(wú)限增殖化細(xì)胞融合的得自轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因鼠，其基因組包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因)的B細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”，包括所有由重組方法制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離的人抗體，例如(a)從轉(zhuǎn)移了人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物(例如鼠)或由其制備的雜交瘤分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化可表達(dá)所述抗體的宿主細(xì)胞分離的抗體，例如，從轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，(c)從重組、組合人抗體文庫(kù)分離的抗體，和(d)通過(guò)任何涉及剪接人免疫球蛋白基因序列到其它DNA序列上的其它方法制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離的抗體。這類重組人抗體具有來(lái)源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實(shí)施方案中，可對(duì)這類重組人抗體進(jìn)行體外誘變(或當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此，當(dāng)?shù)米匀朔N系VH和VL序列并與其相關(guān)時(shí)，重組抗體的VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列可以不是天然存在于體內(nèi)人抗體種系庫(kù)中的序列。
本文所用的“特異性結(jié)合”是指結(jié)合到預(yù)定抗原上的抗體。典型地，所述抗體以解離常數(shù)(KD)10-7M或更少結(jié)合，并且結(jié)合到預(yù)定抗原上的KD比其結(jié)合到非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)而不是預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原上的KD值至少低兩倍。短語(yǔ)“識(shí)別抗原的抗體”和“抗原特異性抗體”在本文與術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合抗原的抗體”可互換使用。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“高親和性”，對(duì)于IgG抗體而言，是指抗體KD為10-8M或更小，更優(yōu)選為10-9M或更小，甚至更優(yōu)選為10-10M或更小。然而，“高親和性”結(jié)合可因其它抗體同種型而變化。例如，“高親和性”結(jié)合，對(duì)于IgM同種型而言，是指抗體KD為10-7M或更小，更優(yōu)選為10-8M或更小。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“K締合”或“Ka”，是指具體抗體-抗原相互作用的締合率，而本文所用術(shù)語(yǔ)“K解離”或“Kd”，是指具體抗體-抗原相互作用的解離率。本文所用術(shù)語(yǔ)“KD”，是指解離常數(shù)，其得自Kd與Ka之比值(即Kd/Ka)并表示為摩爾濃度(M)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“βhCG”是指人絨毛膜促性腺激素的β亞單位，并且包括任何得自βhCG序列(SEQ ID NO20)的全抗原、其抗原性片段、其等位變異體和任何多態(tài)變異體。βhCG為建立成功妊娠所必需的激素。除妊娠之外，這種抗原的表達(dá)主要限于生殖細(xì)胞腫瘤，以及大量的腺癌。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“核酸分子”，包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但優(yōu)選為雙鏈DNA。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離的核酸分子”，是指編碼本發(fā)明分子綴合物或其部分(例如SEQ ID NO9和11或其部分，諸如抗原或抗體部分(即VH、VL或CDR))的核酸。分離的核酸分子是指編碼分子綴合物的核苷酸序列中不含其它污染核苷酸序列(例如不編碼任何部分分子綴合物的核苷酸序列)的核酸分子。
如本文所公開和所要求，SEQ ID NO1-28中所示的序列可包括“保守序列修飾”，即核苷酸和氨基酸序列修飾，其不顯著影響或改變由核苷酸序列編碼或含有氨基酸序列的分子綴合物的功能特征，例如構(gòu)建體抗體部分的結(jié)合性質(zhì)或抗原部分的免疫原性。這類保守序列修飾包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。修飾可通過(guò)本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入SEQ ID NO1-28中，例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)誘變。保守氨基酸取代包括氨基酸殘基由具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代的取代。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已在本領(lǐng)域定義。這些家族包括帶堿性側(cè)鏈氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、帶酸性側(cè)鏈氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分枝側(cè)鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基在人抗DC抗體中優(yōu)選用相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基替代。
或者，在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所有或部分分子綴合物編碼序列中隨機(jī)引入突變，例如通過(guò)飽和誘變，并且所得修飾的分子綴合物可用來(lái)篩選合適的功能活性。
因此，本文公開的由核苷酸序列編碼的分子綴合物，和/或含有本文公開的氨基酸序列的分子綴合物(即SEQ ID NO1-28)，包括由經(jīng)過(guò)保守修飾的類似序列編碼或含有所述類似序列核苷酸序列的基本類似的綴合物。具體地說(shuō)，至于可產(chǎn)生何等基本類似抗體用于基于部分(即重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū))序列(即SEQ ID NO3、4、7或8)的分子綴合物的討論提供如下。
就核酸而言，術(shù)語(yǔ)“基本同源”表示兩個(gè)核酸或其明確序列，當(dāng)任選比對(duì)和比較時(shí)是相同的，在至少約80％的所述核苷酸中，通常至少約90％-95％，更優(yōu)選至少約98％-99.5％的核苷酸中帶有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔А?br> 兩個(gè)序列間的百分同一性為由所述序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)(即％同源性＝相同位置數(shù)/總位置數(shù)×100)，考慮到空位數(shù)，以及每個(gè)空位的長(zhǎng)度等，兩個(gè)序列最佳比對(duì)需要引入的空位。序列比較和兩個(gè)序列間百分同一性的確定可用數(shù)學(xué)算法完成，如以下非限制實(shí)例所述。
兩個(gè)核苷酸序列間的百分同一性可用GCG軟件包中GAP程序(在http//www.gcg.com上提供)確定，該軟件包使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的空位加權(quán)以及1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度加權(quán)。兩個(gè)核苷酸序列間的百分同一性也可用E.Meyers和W.Miller算法(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))確定，該算法已經(jīng)結(jié)合到用PAM120權(quán)重殘基表、空位長(zhǎng)度12罰分和4空位罰分的ALIGN程序(2.0版)中。此外，兩個(gè)氨基酸序列間的百分同一性可用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))算法確定，該算法已結(jié)合到GCG軟件包中GAP程序(在http//www.gcg.com上提供)確定，該軟件包使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位加權(quán)以及1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度加權(quán)。
例如，本發(fā)明核酸序列和蛋白質(zhì)序列還可用作“查詢序列”搜索公共數(shù)據(jù)庫(kù)，以鑒定相關(guān)序列。這類搜索可用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進(jìn)行。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序，分值＝100、字長(zhǎng)＝12進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可用XBLAST程序，分值＝50、字長(zhǎng)＝3進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得以比較為目的的空位比對(duì)，可如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述利用Gapped BALST。當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，可使用各自程序的缺省參數(shù)(例如XBLAST和NBLAST)。參見(jiàn)http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
所述核酸可存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或部分純化的或基本純的形式中。當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括堿/SDS處理、CsCl分帶、柱色譜、瓊脂糖凝膠電泳和其它本領(lǐng)域眾所周知的方法，從其它細(xì)胞組分或其它污染物如其它細(xì)胞核酸或蛋白中純化出核酸，所述核酸為“分離的”或“提煉的基本純的”。參見(jiàn)F.Ausubel等編輯Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，NewYork(1987)。
當(dāng)將核酸置于與另一核酸序列功能性關(guān)系中時(shí)，核酸為“有效連接”。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則它有效連接于編碼序列。就轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列而言，有效連接是指被連接的DNA序列為相鄰的，并當(dāng)有必要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)時(shí)為閱讀框內(nèi)相鄰。就開關(guān)序列而言，有效連接是指所述序列能夠有效開關(guān)重組本文所用術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體為“質(zhì)粒”，其為環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其中可接入額外DNA區(qū)段。另一類型載體為病毒載體，其中額外DNA區(qū)段可接入病毒基因組中。某些載體能夠在其被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自我復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，可整合到宿主細(xì)胞基因組中，并因此與宿主基因組一起復(fù)制。不僅如此，某些載體能夠指導(dǎo)與其有效連接的基因的表達(dá)。這類載體本文稱為“重組表達(dá)載體”(或簡(jiǎn)稱“表達(dá)載體”)。一般而言，重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體通常為質(zhì)粒形式。在本說(shuō)明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明包括這類其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，其發(fā)揮等價(jià)功能。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞”(或簡(jiǎn)稱“宿主細(xì)胞”)，是指重組表達(dá)載體已經(jīng)引入其中的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，這類術(shù)語(yǔ)不僅指具體研究的細(xì)胞，也指這類細(xì)胞的子代。因?yàn)槟承┬揎椏捎捎谕蛔兓颦h(huán)境影響而發(fā)生于后代中，實(shí)際上，這類子代可能與親代細(xì)胞不同，但仍包括與本文所用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。重組宿主細(xì)胞包括例如CHO細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“受試者”包括任何人或非人類動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“非人類動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長(zhǎng)類、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物等。
本發(fā)明的各個(gè)方面在以下小節(jié)作更詳細(xì)的描述。
I.抗原例如，用于本發(fā)明的合適抗原包括保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答所必需的感染性疾病抗原和腫瘤抗原，例如腫瘤細(xì)胞或病原生物體表達(dá)的抗原或感染性疾病抗原。例如，合適的抗原包括用于預(yù)防或治療癌的腫瘤相關(guān)抗原。腫瘤相關(guān)抗原的實(shí)例包括但不限于βhCG、gp100或Pmel17、HER2/neu、CEA、gp100、MART1、TRP-2、melan-A、NY-ESO-1、MN(gp250)、獨(dú)特型、MAGE-1、MAGE-3、酪氨酸酶、端粒酶、MUC-1抗原和生殖細(xì)胞來(lái)源的腫瘤抗原。腫瘤相關(guān)抗原也包括血型抗原例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原?；蛘撸恢挂环N抗原可包括在本發(fā)明抗原-抗體構(gòu)建體中。例如，MAGE抗原可與其它抗原(例如黑色素A、酪氨酸酶和gp100)以及綴合物(例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或IL-12)組合，并連接到抗APC抗體上。
其它合適的抗原包括用于預(yù)防或治療病毒疾病的病毒抗原。病毒抗原的實(shí)例包括但不限于HIV-1 gag、HIV-1 env、HIV-1 nef、HBVcore、FAS、HSV-1、HSV-2、p17、ORF2和ORF3抗原。細(xì)菌抗原的實(shí)例包括但不限于鼠弓形體(Toxoplasma gondii)或蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)。本發(fā)明抗體-細(xì)菌抗原綴合物可用于治療或預(yù)防各種細(xì)菌疾病，例如炭疽、肉毒中毒、破傷風(fēng)、衣原體病、霍亂、白喉、萊姆病、梅毒和結(jié)核。
在一個(gè)本文示例性的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明使用包含βhCG的抗原。該抗原包括完整βhCG序列(SEQ ID NO20)或該序列的任何免疫原性(例如含T細(xì)胞表位)部分。如下所述，這類免疫原性部分可用本領(lǐng)域已知T細(xì)胞表位作圖技術(shù)鑒定，包括算法和已知T細(xì)胞表位作圖技術(shù)。來(lái)自βhCG的免疫原性肽的具體實(shí)例包括包含SEQ IDNO21、22、23、24、25、26、27或28的肽，及其保守修飾(conservativemodifications)。來(lái)自βhCG的另外的免疫原性肽，以及這類肽的鑒定方法描述于美國(guó)專利號(hào)US 6,096,318和6,146,633中，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
蛋白的抗原肽(即含有T細(xì)胞表位的肽)可以各種本領(lǐng)域眾所周知的方式鑒定。例如，可用基于網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)算法(BIMAS &SYFPEITHI)，通過(guò)分析所述蛋白質(zhì)序列，預(yù)測(cè)T細(xì)胞表位，來(lái)產(chǎn)生潛在MHC I類和II類結(jié)合肽，該肽與10000個(gè)此前由CTL定義的完全鑒定的MHC結(jié)合肽的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)匹配。高打分肽可根據(jù)與給出的MHC分子的高親和性進(jìn)行排列并選擇為“有意義”。如圖10所示，并用βhCG綴合物的序列(SEQ ID NO10)，所有算法用于鑒定來(lái)自βhCG部分(芥子)的抗原肽，合成型可由其形成，并可檢測(cè)它們體外引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的能力。因此，尋找潛在結(jié)合到HLA-A2、HLA-B7和HLA-DR分子上的T細(xì)胞表位。一些表位也由βhCG-B11綴合物的抗體(B11)片段預(yù)測(cè)(結(jié)果未顯示)。此外，在長(zhǎng)37個(gè)氨基酸的C端肽(CTP)中沒(méi)有鑒定出T細(xì)胞。
鑒定含有T細(xì)胞表位抗原肽的另一種方法為將蛋白分成所需長(zhǎng)度的非重疊肽，或者所需長(zhǎng)度的重疊肽，其可通過(guò)重組、合成或在某些限制性位點(diǎn)用化學(xué)裂解蛋白并測(cè)試免疫原性質(zhì)(例如引發(fā)T應(yīng)答，即增殖或淋巴因子分泌)產(chǎn)生。
例如，為用精細(xì)作圖技術(shù)精確確定所述蛋白的T細(xì)胞表位，具有T細(xì)胞刺激活性并因此包含至少一個(gè)T細(xì)胞表位的肽(如T細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)所確定)，可通過(guò)在所述肽的氨基或羧基端添加或缺失氨基酸殘基而修飾，并測(cè)試以確定相對(duì)于所修飾的肽的T細(xì)胞中的變化。如果發(fā)現(xiàn)在天然蛋白質(zhì)序列中重疊區(qū)共享的兩種或更多種肽具有人T細(xì)胞刺激活性(如T細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)所確定)，可以產(chǎn)生包含全部或部分這類肽的額外肽，并且可以通過(guò)類似的方法對(duì)這些額外多肽進(jìn)行測(cè)試。根據(jù)這一技術(shù)，對(duì)肽進(jìn)行選擇并用重組或合成方法來(lái)生產(chǎn)。根據(jù)包括對(duì)所述肽的T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)度(例如刺激指數(shù))在內(nèi)的多種因素對(duì)肽進(jìn)行選擇。隨后對(duì)這些所選肽的理化性質(zhì)(例如溶解性、穩(wěn)定性)進(jìn)行檢測(cè)以確定該肽是否適合用于治療性組合物中，或者是否需要進(jìn)行修飾。
II.抗體疫苗綴合物本發(fā)明提供各種治療性疫苗綴合物，其中包括抗原如腫瘤抗原或病毒抗原，所述抗原經(jīng)甘露糖受體(MR)連接在與APC結(jié)合的抗體上。這使得抗原被靶向到APC(例如樹突細(xì)胞)，以增強(qiáng)加工、呈遞并最終增強(qiáng)針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答，例如CTL應(yīng)答。
本發(fā)明抗體-抗原疫苗綴合物可通過(guò)基因方法或化學(xué)方法制備。在這兩種情況下，綴合物的抗體部分都可由全抗體或部分抗體，例如Fab片段或單鏈Fv組成。此外，不止一種抗原可加入到單鏈抗體構(gòu)建體中。
遺傳構(gòu)建的抗樹突抗體-抗原綴合物(例如作為單一重組融合蛋白表達(dá)的綴合物)可通過(guò)將所選的抗原結(jié)合到抗體的不同位置上而制備。具體的基因方法產(chǎn)生的本發(fā)明綴合物(融合構(gòu)建體)包括例如βhCG-B11構(gòu)建體，如圖2所示。βhCG-B11構(gòu)建體包含人抗樹突細(xì)胞抗體B11，其與腫瘤相關(guān)抗原βhCG融合。編碼該構(gòu)建體的核苷酸序列示于SEQ ID NO9。
例如，如βhCG-B11遺傳融合構(gòu)建體所示，βhCG-B11抗原可融合到人抗體重鏈CH3區(qū)的末端。所述抗原也可融合在Fab-融合構(gòu)建體中抗體重鏈鉸鏈區(qū)，或者在單鏈融合構(gòu)建體(ScFv構(gòu)建體)中帶有可變輕鏈和重鏈(VH和VL)的序列。或者，所述抗原可融合到抗體輕鏈而不是抗體重鏈上?？梢允褂每乖涂贵w間其它融合點(diǎn)，只要基因融合構(gòu)建體可引發(fā)CTL應(yīng)答。完整βhCG-B11構(gòu)建體和單鏈B11構(gòu)建體(pB11sfv-βhCG)的詳細(xì)圖譜分別示于表1和表2。
表1βhCG-B11特征圖譜編碼序列(共3個(gè))BUsfr-bHCG開始921結(jié)束2153neo開始3375結(jié)束4169新霉素抗性基因Amp開始5671結(jié)束6531(互補(bǔ))氨芐青霉素抗性基因其他特征(共5個(gè))啟動(dòng)子開始863結(jié)束882啟動(dòng)子信號(hào)序列開始921結(jié)束977 B11 VL開始978結(jié)束1296 B11 VH
開始1344 結(jié)束1691βHCG開始1712 結(jié)束2164聚腺苷酸化信號(hào)(共2個(gè))聚腺苷酸開始2267結(jié)束2491聚腺苷酸聚腺苷酸開始4343結(jié)束4473SV40聚腺苷酸化信號(hào)真核啟動(dòng)子(共1個(gè))啟動(dòng)子開始232結(jié)束819真核啟動(dòng)子原核啟動(dòng)子(共1個(gè))啟動(dòng)子開始6566結(jié)束6572(互補(bǔ))啟動(dòng)子復(fù)制起點(diǎn)(共3個(gè))SV40啟動(dòng)子和起點(diǎn)開始1結(jié)束1復(fù)制起點(diǎn)F1起點(diǎn)開始2537結(jié)束2965復(fù)制起點(diǎn)pUC起點(diǎn)開始4856結(jié)束5526(互補(bǔ))起點(diǎn)表2pB11sfv-βhCG特征圖譜編碼序列(共4個(gè))輕鏈開始735結(jié)束1433 B11輕鏈Cκ開始1113結(jié)束1433AMP開始7810結(jié)束8670(互補(bǔ))amp
起始位點(diǎn)說(shuō)明互補(bǔ)的1..6871)DHFR開始8921結(jié)束9484dhfr起始位點(diǎn)說(shuō)明7122-7685其他特征(共9個(gè))B11VL開始792結(jié)束1112SV40啟動(dòng)子/Ori開始2298結(jié)束2622SV40啟動(dòng)子和復(fù)制起點(diǎn)Neo開始2658結(jié)束3452新霉素抗性基因βHCG開始4015結(jié)束4467(互補(bǔ))bHCGCHS開始4470結(jié)束4790(互補(bǔ))重鏈恒定區(qū)3CH2開始4791結(jié)束5120(互補(bǔ))重鏈恒定區(qū)2CH1開始5166結(jié)束5459(互補(bǔ))重鏈恒定區(qū)1B11VH開始5460結(jié)束5807(互補(bǔ))啟動(dòng)子開始5905結(jié)束6559(互補(bǔ))聚腺苷酸化信號(hào)(共3個(gè))聚腺苷酸開始1526結(jié)束1757聚腺苷酸開始3744結(jié)束3975(互補(bǔ))聚腺苷酸化信號(hào)2開始10282結(jié)束10411SV40聚腺苷酸起始位點(diǎn)說(shuō)明8483..8612真核啟動(dòng)子(共1個(gè))
啟動(dòng)子開始9結(jié)束655化學(xué)構(gòu)建的抗體-抗原綴合物可用各種熟知和易于獲得的交聯(lián)試劑制備。這些交聯(lián)試劑可為同官能化合物或雜官能化合物，例如SPDP、SATA、SMCC、DTNB，該化合物與抗樹突抗體和所選抗原上不同反應(yīng)性氨基酸或糖側(cè)鏈形成共價(jià)鍵。
任何可被克隆和表達(dá)或純化的抗原可選擇用于本發(fā)明。獲得這類抗原的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，腫瘤相關(guān)抗原可從癌細(xì)胞直接純化，并由理化技術(shù)例如串聯(lián)質(zhì)譜鑒定?；蛘撸捎媚[瘤特異性T細(xì)胞克隆測(cè)試抗原陰性細(xì)胞，該細(xì)胞已經(jīng)通過(guò)用質(zhì)粒DNA克隆轉(zhuǎn)染獲得抗原，來(lái)分離表達(dá)所述抗原的克隆。然后可構(gòu)建合成肽以精確鑒定抗原位點(diǎn)或表位。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗構(gòu)建體的部分抗體序列可用于表達(dá)完整抗體。包括在本發(fā)明疫苗綴合物中的抗體如抗APC抗體(如B11)，主要通過(guò)位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的氨基酸殘基，與靶抗原(例如C型凝集素受體，例如MR)相互作用。為此，CDR中的氨基酸序列在個(gè)體抗原間比CDR外的序列更為多樣化。因?yàn)镃DR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，所以有可能通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體而表達(dá)模擬特異性天然存在抗體性質(zhì)的重組抗體，所述表達(dá)載體包括從不同性質(zhì)的不同抗體上移植到構(gòu)架序列上的來(lái)自特異性天然存在抗體的CDR序列(參見(jiàn)例如Riechmann，L.等(1998)Nature 332323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321522-525；和Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.8610029-10033)。這類構(gòu)架序列可由包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。這些種系序列會(huì)不同于成熟抗體基因序列，因?yàn)樗鼈儗⒉话ㄍ暾b配的可變基因，該基因在B細(xì)胞成熟期間由V(D)J連接形成。種系基因序列在也將不同于個(gè)體中高親和性第二抗體所有組成成分的序列，該序列均勻分布于可變區(qū)。例如，體細(xì)胞突變?cè)跇?gòu)架區(qū)氨基端部分相對(duì)少見(jiàn)。例如，體細(xì)胞突變?cè)跇?gòu)架區(qū)1氨基端部分和構(gòu)架區(qū)4羧基端部分相對(duì)少見(jiàn)。此外，許多體細(xì)胞突變不顯著改變抗體的結(jié)合性質(zhì)。為此，沒(méi)有必要獲得具體抗體的完整DNA序列，以重建具有與原始抗體結(jié)合性質(zhì)類似的完整重組抗體(參見(jiàn)WO 99/45962，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中，用于所有的目的)?？缭紺DR區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列一般足以滿足此目的。所述部分重鏈和輕鏈序列用于確定哪個(gè)種系可變和J基因區(qū)段有助于重組抗體可變基因。然后，種系序列用來(lái)填補(bǔ)可變區(qū)的缺少部分。重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列在蛋白成熟期間被切割，并且無(wú)助于最終抗體的性質(zhì)。為此，有必要使用相應(yīng)的表達(dá)構(gòu)建體的種系前導(dǎo)序列。為了添加缺少序列，克隆cDNA序列可與合成寡核苷酸通過(guò)連接或PCR擴(kuò)增結(jié)合?；蛘?，完整可變區(qū)可合成為一套短的、重疊寡核苷酸，并由PCR擴(kuò)增結(jié)合以創(chuàng)建完整合成可變區(qū)克隆。這一過(guò)程具有某些優(yōu)點(diǎn)如消除或包含或具體限制位點(diǎn)，或者優(yōu)化具體密碼子。
雜交瘤的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列用來(lái)設(shè)計(jì)一套重疊合成寡核苷酸，以創(chuàng)建合成帶有氨基酸編碼能力與天然序列相同的V序列。所述合成的重鏈和κ鏈序列可在三方面與天然序列不同間插成串重復(fù)核苷酸堿基以促進(jìn)關(guān)核苷酸合成和PCR擴(kuò)增；最優(yōu)翻譯起始位點(diǎn)根據(jù)Kozak規(guī)則(Kozak(1991)J.Biol.Chem.26619867-19870)加入；并且HindIII位點(diǎn)裝在翻譯起始位點(diǎn)的上游。
就重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)兩者而言，優(yōu)化的編碼鏈和相應(yīng)的非編碼鏈序列被斷裂成相應(yīng)的30-50個(gè)核苷酸左右的中位非編碼寡核苷酸。因此，對(duì)于每個(gè)側(cè)鏈來(lái)說(shuō)，所述寡核苷酸可裝配成跨距為150-400核苷酸的重疊雙鏈組。然后，所述庫(kù)用作模板來(lái)產(chǎn)生150-400核苷酸區(qū)段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。典型地，將一組可變區(qū)寡核苷酸組分成兩個(gè)庫(kù)，該庫(kù)獨(dú)立地?cái)U(kuò)增以產(chǎn)生兩個(gè)重疊PCR產(chǎn)物。這些重疊產(chǎn)物接著通過(guò)PCR擴(kuò)增結(jié)合形成完全可變區(qū)。也可期望在PCR擴(kuò)增中包括重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)重疊片段(包括κ輕鏈的BbsI位點(diǎn)，或者γ重鏈的AgeI位點(diǎn))，以產(chǎn)生可容易地克隆到表達(dá)載體構(gòu)建體中的片段。
然后，重建的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動(dòng)子、翻譯起點(diǎn)、恒定區(qū)、3’非翻譯聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止序列結(jié)合，形成表達(dá)載體構(gòu)建體。所述重鏈和輕鏈表達(dá)載體構(gòu)建體可結(jié)合到單一載體中，共同轉(zhuǎn)染、依次轉(zhuǎn)染或獨(dú)立轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，然后融合產(chǎn)生表達(dá)兩條鏈的宿主細(xì)胞。
用于構(gòu)建人IgGκ的表達(dá)載體的質(zhì)粒描述如下。構(gòu)建所述質(zhì)粒以使得PCR擴(kuò)增的V重鏈和Vκ輕鏈cDNA序列可用來(lái)重建完全重鏈和輕鏈小基因。這些質(zhì)?？捎脕?lái)表達(dá)完全人或嵌合IgG1κ和IgG4κ抗體。類似的質(zhì)?？蓸?gòu)建來(lái)表達(dá)其它重鏈同種型，或者表達(dá)包含λ輕鏈的抗體。
因此，在本發(fā)明另一方面，本文所述疫苗綴合物抗體部分的結(jié)構(gòu)特征如B11，用來(lái)創(chuàng)建保留至少一種本發(fā)明B11抗體功能性質(zhì)(例如結(jié)合APC)的結(jié)構(gòu)相關(guān)抗體。更具體地說(shuō)，B11的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)可與已知構(gòu)架區(qū)和CDR重組結(jié)合，來(lái)創(chuàng)建用于本發(fā)明疫苗綴合物的額外、重組工程的、抗APC抗體。
因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備包含抗DC抗體的疫苗綴合物的方法，所述方法包括制備包含以下的抗體(1)人重鏈構(gòu)架區(qū)和人重鏈CDR，其中至少一種人重鏈CDR包含選自圖8中所示CDR氨基酸序列(SEQ ID NO13、14或15)的氨基酸序列；和(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)和人輕鏈CDR，其中至少一種人輕鏈CDR包含選自圖9中所示CDR氨基酸序列(SEQ ID NO16、17或18)的氨基酸序列；其中所述抗體保留結(jié)合到APC上的能力。
抗體結(jié)合到APC上的能力可用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合試驗(yàn)如實(shí)施例中所述(如ELILSA)試驗(yàn)測(cè)定。因?yàn)椋绢I(lǐng)域眾所周知，抗體重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在抗體特異性/親和力結(jié)合抗原上起特別重要的作用，本發(fā)明如上述制備的重組抗體優(yōu)選包含B11的重鏈和輕鏈CDR3。所述抗體還包含B11的CDR2。所述抗體還可包含B11的CDR1。因此，本發(fā)明還提供包含以下的抗APC抗體(1)人重鏈構(gòu)架區(qū)、人重鏈CDR1區(qū)、人重鏈CDR2區(qū)、人重鏈CDR3區(qū)，其中人重鏈CDR3區(qū)為圖8中所示的B11的CDR3(SEQ ID NO15)；和(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)、人輕鏈CDR1區(qū)，人輕鏈CDR2區(qū)，人輕鏈CDR3區(qū)，其中人輕鏈CDR3區(qū)為圖9中所示的B11的CDR3(SEQ ID NO18)，其中所述抗體結(jié)合DC。所述抗體還包含B11的重鏈CDR2和/或輕鏈CDR2。所述抗體還可包含B11的重鏈CDR1和/或輕鏈CDR1。
優(yōu)選地，上述基因工程抗體的CDR1、CDR2和/或CDR3包含本文公開的B11的恰切氨基酸序列。然而，普通技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，在仍保留抗體有效結(jié)合DC的能力的同時(shí)，B11的恰切CDR序列的改變是可行的(例如保守取代)。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因工程抗體可由一種或多種CDR組成，該CDR例如至少90％、95％、98％或99.5％等同于B11的一種或多種CDR。
除了或撇開簡(jiǎn)單結(jié)合APC外，基因工程抗體如上述抗體可以根據(jù)其保留本發(fā)明抗體的其它功能性質(zhì)進(jìn)行選擇，例如(1)結(jié)合APC上的高親和性；(2)結(jié)合到APC上的獨(dú)特表位上(當(dāng)用于結(jié)合時(shí)，來(lái)消除由補(bǔ)體活性的單克隆抗體會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一抗原表位的可能性)；(3)誘導(dǎo)針對(duì)所述抗原而產(chǎn)生的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答；和/或(4)誘導(dǎo)包含CD4+和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答的T細(xì)胞應(yīng)答。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化表達(dá)目標(biāo)抗原如βhCG的全細(xì)胞，來(lái)表達(dá)抗APC抗體如抗MR抗體，致使抗原和抗體由細(xì)胞共表達(dá)。例如，通過(guò)用編碼含有跨膜域和抗APC抗體的融合蛋白的核酸轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的方式，可以做到這一點(diǎn)。表達(dá)疫苗綴合物的細(xì)胞可接著用于靶向APC如DC，以誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。
產(chǎn)生這類核酸、融合蛋白和表達(dá)這類融合蛋白的細(xì)胞的方法描述于美國(guó)專利申請(qǐng)第09/203,958號(hào)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。
或者，所述抗體可通過(guò)使用化學(xué)接頭、脂質(zhì)標(biāo)簽或其它相關(guān)方法連接到細(xì)胞或病原體上(deKruif，J.等(2000)Nat.Med.6223-227；Nizard，P.等(1998)FEBS Lett.43383-88)。表達(dá)目標(biāo)抗原和表面錨定抗體的細(xì)胞可用于誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答如CTL應(yīng)答，以對(duì)抗細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞或微生物病原體。
III.藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供治療性組合物如藥物組合物，其含有一種或組合的與藥物可接受載體一起配制的本發(fā)明疫苗綴合物。為遞入受試者血流與受試者T細(xì)胞相互作用，而給予本發(fā)明疫苗綴合物。這類T細(xì)胞的靶向可在體內(nèi)或活體外直接用所述綴合物或用已經(jīng)事先用疫苗綴合物靶向的細(xì)胞來(lái)完成。
本發(fā)明組合物可額外包括其它治療試劑如其它抗體、細(xì)胞毒素或藥物(例如免疫抑制劑)，并可單獨(dú)給予或與其它療法如放療聯(lián)合給予。例如，由APC快速內(nèi)化的疫苗綴合物可與增強(qiáng)樹突細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞活性(例如釋放免疫刺激性細(xì)胞因子)的單克隆抗體結(jié)合。
本文所用的“藥物可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等生理相容物質(zhì)。優(yōu)選的載體適用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、胃腸外、脊柱或表皮給予(例如注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，所述疫苗綴合物可包在材料中以保護(hù)所述化合物免受酸和其它可使所述化合物失活的自然條件的作用。
“藥物可接受的鹽”是指保留母體化合物所需生物活性并且不產(chǎn)生任何不良毒性效應(yīng)的鹽(參見(jiàn)例如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這類鹽的實(shí)例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括得自無(wú)毒無(wú)機(jī)酸的鹽，例如鹽酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、亞磷酸鹽等，以及得自無(wú)毒有機(jī)酸的鹽，例如脂肪族一和二羧酸鹽、苯基取代的烷酸鹽、羥基烷酸鹽、芳族酸鹽、脂族和芳族磺酸鹽等。堿加成鹽包括得自堿土金屬的鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等，以及得自無(wú)毒有機(jī)胺的鹽，例如N，N′-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等。
本發(fā)明組合物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法給予。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，給藥途徑和/或模式將取決于所需結(jié)果。活性化合物可與防止所述化合物快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物和微囊化遞藥系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到獾?、生物相容性多聚物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這類制劑的許多制備方法申請(qǐng)了專利或?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知。參見(jiàn)例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
為通過(guò)某些給藥途徑給予本發(fā)明疫苗綴合物，可能有必要用材料包住化合物或與將化合物與材料一起給予以防止其失活。例如，所述化合物可在合適的載體中給予受試者，例如脂質(zhì)體或稀釋劑。藥物可接受的稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。脂質(zhì)體包括水包油包水CGF乳劑，以及常規(guī)脂質(zhì)體(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.727)。
藥物可接受的載體包括無(wú)菌水溶液或分散體和用于臨時(shí)配制成無(wú)菌注射液或分散液的無(wú)菌粉末。這類介質(zhì)和藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域已知的。除任何與所述活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或藥物的情況外，考慮了其在本發(fā)明藥物組合物中的用途。補(bǔ)充活性化合物也可加入到所述組合物中。
治療性組合物一般必須無(wú)菌并在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定。所述組合物可制備成溶液劑、微乳劑、脂質(zhì)體或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可為含有例如水、醇、多元醇(例如乙二醇、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？杀３趾线m的流動(dòng)性，例如，通過(guò)使用包衣例如卵磷脂，通過(guò)在分散體的情況下保持所需的顆粒大小，以及通過(guò)使用表面活性劑等。在許多情況下，會(huì)在組合物中優(yōu)選包括等滲劑，例如糖、糖醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉。注射組合物的延長(zhǎng)吸收可通過(guò)在組合物包括延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠引起。
無(wú)菌注射液可通過(guò)將活性化合物以所需量加入到上述帶有一種或組合成分的合適溶劑中制備，如果需要，再進(jìn)行無(wú)菌微濾。一般而言，分散體通過(guò)將活性化合物加入到無(wú)菌溶媒中制備，該無(wú)菌溶媒含有基本分散介質(zhì)和來(lái)自上述所需其它成分。在用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和凍干(冷凍干燥)，可得到活性成分的粉末外加任何來(lái)自其此前無(wú)菌過(guò)濾溶液的額外所需成分。
調(diào)整劑量方案以提供最優(yōu)所需反應(yīng)(例如治療反應(yīng))。例如，可給予一次大劑量，可在某時(shí)間段內(nèi)給予幾個(gè)分劑量或根據(jù)治療情況的急迫性的指示按比例減少或增加劑量。尤其有利地是，為了簡(jiǎn)便給藥和同一劑量，以劑量單位形式配制胃腸外組合物。本文所用劑量單位形式是指適于用作要治療受試者單一劑量的物理分離單位；每個(gè)單位含有經(jīng)計(jì)算與所需藥用載體一起產(chǎn)生所需療效的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格按照和直接根據(jù)(a)所述活性化合物的獨(dú)特的特征和要達(dá)到的具體療效，和(b)配制這類治療個(gè)體中敏感性活性化合物的本領(lǐng)域固有的限制。
藥物可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒(méi)食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
就治療性組合物而言，本發(fā)明制劑包括適用于口服和/或胃腸外給藥的制劑。所述制劑可以適當(dāng)?shù)膯挝粍┬痛嬖?，并可由藥學(xué)領(lǐng)域任何已知方法制備?？膳c載體物質(zhì)混合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量，會(huì)根據(jù)要治療受試者和具體的給藥模式而變動(dòng)。可與載體物質(zhì)混合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量，一般會(huì)是產(chǎn)生療效的組合物的量。一般而言，在百分之百外，此量的范圍為約0.01％至約99％的活性成分，優(yōu)選約0.1％至約70％，最優(yōu)選約1％至約30％。
本文所用的短語(yǔ)“胃腸外給藥”和“胃腸外給予”是指不是腸道和局部給藥的給藥模式，通常通過(guò)注射，包括并不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)的注射和輸注。
可用于本發(fā)明藥物組合物中的合適的水和非水載體包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物，植物油如橄欖油，和注射用有機(jī)酯如油酸乙酯?？赏ㄟ^(guò)例如使用包衣材料如卵磷脂，通過(guò)在分散體情況下保持所需顆粒大小，以及通過(guò)使用表面活性劑保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。
這些組合物也可含有輔料例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑。可通過(guò)滅菌程序，見(jiàn)上，以及通過(guò)包括各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑如對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等確保防止微生物的存在。將等滲劑，例如糖、氯化鈉等包括進(jìn)組合物中也是可取的。此外，注射用藥物形式吸收的延長(zhǎng)，可通過(guò)包括延長(zhǎng)吸收劑如單硬脂酸鋁和明膠產(chǎn)生。
當(dāng)本發(fā)明化合物作為藥物給予人和動(dòng)物時(shí)，可單獨(dú)給予或作為含有例如與藥物可接受載體混合的0.01-99.5％(更優(yōu)選0.1-90％)的活性成分的藥物組合物給予。
不管所選的給藥途徑，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，將可在合適的水合形式中使用的本發(fā)明化合物，和/或本發(fā)明藥物組合物，配制成藥物可接受的劑型。
本發(fā)明藥物組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可變動(dòng)，以獲得適量的針對(duì)具體患者的有效取得所需治療反應(yīng)的活性成分、組合物和給藥模式，而不引起患者毒性。所選的劑量水平將取決于各種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括本發(fā)明所用具體組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥時(shí)間、所用具體化合物的排泄率、療程、與所述具體組合物聯(lián)用的其它藥物、組合物和/或材料、待治療患者的年齡、性別、體重、病情、一般健康狀況和先前就醫(yī)史和醫(yī)療領(lǐng)域熟知的類似因素。
具有本領(lǐng)域普通技能的執(zhí)業(yè)醫(yī)師或獸醫(yī)可輕易的確定有效量的所需藥物組合物并開出處方。例如，執(zhí)業(yè)醫(yī)師或獸醫(yī)可以低于所需量的用于所述藥物組合物中的本發(fā)明化合物開始，以取得所需療效并逐漸增加劑量直到取得所需效果。一般而言，合適的本發(fā)明組合物的日劑量會(huì)是有效產(chǎn)生療效的所述化合物的最低劑量。這類有效劑量通常會(huì)取決于上述因素。優(yōu)選給藥途徑為靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下，優(yōu)選在靶部位附近給藥。如果需要，治療組合物的有效日劑量可在全天的適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔內(nèi)以獨(dú)立給藥的2、3、4、5、6或更多分劑量給予，任選以單位劑型給予。雖然由可能單獨(dú)給予本發(fā)明化合物，但優(yōu)選以藥物制劑(組合物)給予所述化合物。
治療組合物可以用本領(lǐng)域已知醫(yī)療裝置給予。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明治療組合物可用無(wú)針皮下注射裝置給予，例如公布于美國(guó)專利第5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556號(hào)的裝置。用于本發(fā)明的眾所周知的植入物和模塊的實(shí)例包括美國(guó)專利第4,487,603號(hào)，該專利公開以可控速率分配藥物的可植入微量輸液泵；美國(guó)專利第4,486,194號(hào)，該專利公開通過(guò)皮膚給藥的治療裝置；美國(guó)專利第4,447,233號(hào)，該專利公開以精確輸注速率遞藥的醫(yī)用輸液泵；美國(guó)專利第4,447,224號(hào)，該專利公開連續(xù)遞藥用流速可變可移植輸液裝置；美國(guó)專利第4,439,196號(hào)，該專利公開具有多室隔間的滲透遞藥系統(tǒng)；和美國(guó)專利第4,475,196號(hào)，該專利公開滲透遞藥系統(tǒng)。這些專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。許多其它這類植入物、遞藥系統(tǒng)和模塊是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
所述組合物必須是無(wú)菌的，流動(dòng)性要滿足組合物用注射器遞送的要求。除了水以外，所述載體可為等滲緩沖鹽溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物?？赏ㄟ^(guò)例如使用包衣材料如卵磷脂，通過(guò)在分散體情況下保持所需顆粒大小，以及通過(guò)使用表面活性劑保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，在所述組合物中優(yōu)選包括等滲劑如糖、糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇和氯化鈉?？赏ㄟ^(guò)在所述組合物中包括延遲吸收劑如單硬脂酸鋁和明膠等產(chǎn)生注射用組合物的長(zhǎng)時(shí)間吸收。
當(dāng)所述活性化合物如上所述得到適當(dāng)保護(hù)時(shí)，所述化合物可與例如惰性稀釋劑或可吸收的食用載體一起口服給予。
IV.本發(fā)明的用途和方法本發(fā)明疫苗綴合物可用于治療和/或預(yù)防(例如免疫針對(duì))各種疾病和病癥。
主要的疾病適應(yīng)癥之一為癌。這包括但不限于結(jié)腸癌、黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、肥大細(xì)胞瘤、乳腺癌、白血病或類風(fēng)濕成纖維細(xì)胞瘤。另一主要的疾病適應(yīng)癥為感染性疾病，包括但不限于HIV、肝炎(例如甲型、乙型、丙型)、流行性感冒、皰疹、賈第蟲病、瘧疾、利什曼原蟲病、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)病、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)病。另一種主要的疾病適應(yīng)癥為自身免疫病。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述疫苗綴合物用于治療或預(yù)防由βhCG或表達(dá)βhCG的細(xì)胞介導(dǎo)的疾病和病癥，其為半胱氨酸環(huán)生長(zhǎng)因子超家族的成員。有證據(jù)表明，βhCG作為生長(zhǎng)因子、血管生成和/或轉(zhuǎn)移促進(jìn)因子，或者作為免疫功能抑制劑在癌的建立或發(fā)展中起作用(73)。因此，本發(fā)明可用于治療癌和其它涉及血管生成的疾病的發(fā)展。本發(fā)明也可通過(guò)抑制βhCG或表達(dá)βhCG的細(xì)胞在妊娠中的作用而用于預(yù)防或終止意外妊娠。
就治療用途而言，可以將本發(fā)明的疫苗綴合物直接給予受試者(即體內(nèi))?；蛘撸梢詫⑺鼍Y合物間接給予受試者，即首先通過(guò)使所述綴合物與APC例如樹突細(xì)胞接觸(例如通過(guò)培養(yǎng)或孵育)，然后將所述細(xì)胞給予受試者(即體外)。所述綴合物的接觸與遞送到APC，致使它們被在給藥前由APC加工并呈遞，亦稱抗原或細(xì)胞“負(fù)載”。將抗原加載到APC的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括例如Gunzer和Grabbe，Crit Rev Immunol 21(1-3)133-45(2001)和Steinman，ExpHematol 24(8)859-62(1996)。
在所有情況下，所述疫苗綴合物都以有效量給予以發(fā)揮其所需要的療效。術(shù)語(yǔ)“有效量”是指必需或足以實(shí)現(xiàn)所需生物效應(yīng)的量。例如，有效量可為消除腫瘤、癌或細(xì)菌、病毒或真菌感染的必需量。任何具體應(yīng)用的有效量可根據(jù)待治療疾病或病癥、待給予的具體綴合物、受試者體型或疾病或病癥的嚴(yán)重程度等各種因素而變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無(wú)需進(jìn)行過(guò)多的實(shí)驗(yàn)，憑經(jīng)驗(yàn)就可確定具體多特異性分子的有效量。
所述疫苗綴合物的優(yōu)選給藥途徑包括例如注射(例如皮下、靜脈內(nèi)、胃腸外、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi))。所述注射可為快速濃注或連續(xù)輸注。其它給藥途徑包括口服給藥。
本發(fā)明疫苗綴合物也可與輔料和其它治療劑例如免疫刺激劑共同給予。所述綴合物通常單獨(dú)配制在藥物可接受的載體中，或者與這類藥物混合配制。這類載體的實(shí)例包括溶液、溶劑、分散介質(zhì)、延遲劑、乳劑等。藥物活性物質(zhì)的這類介質(zhì)的用途是本領(lǐng)域眾所周知的。任何其它適合與所述分子聯(lián)用的常規(guī)載體在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
與所述疫苗綴合物共同給予的合適的治療劑包括其它抗體、細(xì)胞毒素和/或藥物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑為已知幫助或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗溶細(xì)胞性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑為化療藥。所述疫苗綴合物也可與放療一同給予。
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，以下實(shí)施例不得解釋為對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限制。本申請(qǐng)全篇中所引用的所有數(shù)字和所有參考文獻(xiàn)、專利和公布的專利申請(qǐng)的內(nèi)容，全都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
實(shí)施例方法與材料從全血或leukopak產(chǎn)生DC通過(guò)將肝素化全血或帶有Ficoll-Paque的單采血液成分制劑進(jìn)行密度梯度離心，獲得人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。然后，通過(guò)粘附塑料培養(yǎng)皿或淘析分離單核細(xì)胞，并通過(guò)向培養(yǎng)基中添加細(xì)胞因子(10ng/ml GM-CSF和2ng/ml IL-4)使其分化成未成熟DC。在第5天和第7天之間收獲DC，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。以這種方式制備的DC為CD14-、HLA-DR+、CD11c+甘露糖受體+和高水平表達(dá)的MHC I類和II類、CD80和CD86。
腫瘤抗原βhCG的選擇βhCG是人絨毛膜促性腺激素(成功建立妊娠所必需的激素)的亞單位。此糖蛋白亞單位具有若干特點(diǎn)使其成為癌免疫治療中值得關(guān)注的抗原(有關(guān)綜述參見(jiàn)Triozzi P.L.和StevensV.(1999)Oncology Reports 67-17)。首先，除妊娠外，此抗原的表達(dá)主要限于生殖細(xì)胞腫瘤，以及大量腺癌(表3)。其次，hCG為半胱氨酸環(huán)生長(zhǎng)因子超家族的成員，并可作為生長(zhǎng)因子、血管生成和/或轉(zhuǎn)移促進(jìn)劑，或者作為免疫功能抑制劑在癌的建立或發(fā)展中起作用。因此，限制功能性hCG表達(dá)的免疫療法可提供額外的治療益處。
表3通過(guò)免疫組織化學(xué)對(duì)βhCG呈陽(yáng)性的腫瘤百分率(Triozzi P.L.和Stevens V.(1999))
增殖試驗(yàn)在96孔平底微量板中，效應(yīng)T細(xì)胞(5×104)與有或沒(méi)有荷載抗原(MDX-1307或其它)的自身DC(5×103)共同培養(yǎng)，終體積為0.2ml。所述混合物于37℃共同培養(yǎng)。第4天，培養(yǎng)物用3H-胸苷(1μCi/孔)進(jìn)行脈沖，18小時(shí)后，直接在濾器(Millipore)上收獲細(xì)胞。濾器用水洗滌三次，然后用乙醇洗滌一次，并在通風(fēng)櫥中干燥5-10分鐘。隨后將閃爍液(Packard，20μl/孔)加入到濾器中。在Wallacβ計(jì)數(shù)器上通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)確定濾器結(jié)合的放射性。結(jié)果表示為用抗原刺激的對(duì)未用抗原或用對(duì)照抗原刺激的CTL的刺激指數(shù)(S.I.)值(cpm)。就MHC阻斷分析而言，標(biāo)記的靶與HLA-特異性mAb一起在室溫下預(yù)孵育30分鐘，W6/32用于阻斷所有I類，L243用于阻斷所有II類HLA分子(20μg/ml)。通過(guò)離心除去未結(jié)合的mAb。
流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)在GM-CSF和IL-4中培養(yǎng)5天，由單核細(xì)胞制備人DC。將DC與10μg/ml的βhCG抗原/抗MR抗體疫苗綴合物或同種型對(duì)照一起在冰上孵育。疫苗綴合物直接用FITC-標(biāo)記或用FITC-標(biāo)記的抗βhCG第二單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。用LSR流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)合熒光的細(xì)胞。
細(xì)胞毒性試驗(yàn)靶細(xì)胞(3×106)、對(duì)照和荷載抗原(βhCG-B11)用RPMI培養(yǎng)基洗滌兩次，將沉淀重懸于200μl培養(yǎng)基中并用100μCi51Na2CrO4于37℃標(biāo)記60分鐘。標(biāo)記的靶用RPMI培養(yǎng)基洗滌三次，將沉淀重懸浮以使細(xì)胞濃度為3×104細(xì)胞/ml。抗原特異性CTL在96孔V-形底板中滴定，以得出100∶1(效應(yīng)T細(xì)胞，E靶，T)直到12.5∶1或更低的比值。加入恒定數(shù)目的標(biāo)記靶(100μl/孔或3,000靶細(xì)胞/孔)，將板以低速(180xg)離心并于37℃孵育。4小時(shí)后，收獲100-120μl上清液，用γ-計(jì)數(shù)器(Wallac Instruments，Perkin-Elmer)測(cè)定釋放的放射性。CTL活性用以下方程計(jì)算并表示為％特異性裂解(殺傷) 其中實(shí)驗(yàn)性釋放(cpm)，是指含有CTL(E)和靶(T)的孔中的放射性(釋放的鉻)；自發(fā)釋放(cpm)，是指在0.1ml培養(yǎng)基中只有靶(即沒(méi)有添加CTL)的孔中的放射性；而最大釋放，是指在0.1ml去污劑溶液(Igepal CA 630；syn.NP-40；RPMI培養(yǎng)基中的5％溶液)中有靶的孔中的放射性。在孔-控制的實(shí)驗(yàn)條件下，自發(fā)釋放值應(yīng)為最大釋放的10％或以下。就MHC阻斷分析而言，將標(biāo)記的靶與HLA-特異性mAb一起在室溫下預(yù)孵育30分鐘，W6/32用于阻斷所有I類，L243用于阻斷所有II類HLA分子(20μg/ml)。通過(guò)離心除去未結(jié)合的mAb，將mAb-包被的靶加到CTL上。用同種型匹配的mAb作為對(duì)照。
還有另一種方法來(lái)檢查細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，該方法對(duì)抗原-驅(qū)動(dòng)的T細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行研究。當(dāng)事先暴露的抗原存在于MHC II類和程度較低的I類分子時(shí)，抗原敏化的T細(xì)胞往往優(yōu)先增殖。因此，分裂細(xì)胞攝取放射性示蹤劑的計(jì)數(shù)提供了刺激的度量。
實(shí)施例1βhCG-B11的產(chǎn)生疫苗綴合物的設(shè)計(jì)通過(guò)將βhCG抗原與B11即結(jié)合樹突細(xì)胞上的人巨噬細(xì)胞甘露糖受體上的完全人抗體連接，產(chǎn)生該構(gòu)建體。通過(guò)基因融合方法，使所述抗原與所述抗體的重鏈通過(guò)共價(jià)結(jié)合完成鍵合，如圖3所示。
βhCG-B11疫苗綴合物的重組表達(dá)如圖2所示，產(chǎn)生含有新霉素基因和二氫葉酸還原酶基因的質(zhì)粒，其含有與抗體B11在重鏈CH3區(qū)融合的βhCG編碼序列(SEQ ID NO9和10)。采用標(biāo)準(zhǔn)化方案(QiagenInc，Valencia，CA)，將所得質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在含有抗生素G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。讓細(xì)胞在濃度逐漸增高的氨甲蝶呤中生長(zhǎng)來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)增表達(dá)。擴(kuò)增后，通過(guò)有限稀釋克隆細(xì)胞，穩(wěn)定的克隆系用來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞庫(kù)供進(jìn)一步研究用。為確證βhCG-B11構(gòu)建體的表達(dá)，在還原性條件下，通過(guò)SDS-PAGE對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。觀察到該融合蛋白具有預(yù)期分子量并適當(dāng)裝配(即既含有重鏈融合物又含有輕鏈)。準(zhǔn)確地說(shuō)，所述疫苗綴合物和所述抗體單獨(dú)通過(guò)SDS-PAGE用變性條件進(jìn)行分析，用蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行檢測(cè)。然后所述印跡分別用山羊抗人IgG重鏈和輕鏈和βhCG C端肽特異性的mAb(Sigma)進(jìn)行探測(cè)。結(jié)果證明，轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞特異性表達(dá)B11-βhCG疫苗綴合物，證據(jù)為融合產(chǎn)物的合適的大小和組成。
實(shí)施例2B11scfv-βhCG的產(chǎn)生疫苗綴合物的設(shè)計(jì)通過(guò)使βhCG抗原與B11單鏈融合體(ScFv)連接產(chǎn)生第二構(gòu)建體，B11單鏈融合體(ScFv)為結(jié)合樹突細(xì)胞上的人巨噬細(xì)胞甘露糖受體并且含有完全人B11抗體VL和VH片段的單鏈抗體。通過(guò)基因融合方法，使所述抗原與B11ScFv的羧基端通過(guò)共價(jià)結(jié)合完成鍵合，如圖1所示(稱為B11sfv-βhCG構(gòu)建體)。
B11sfv-βhCG疫苗綴合物的重組表達(dá)如圖1所示，產(chǎn)生含有B11sfv-βhCG構(gòu)建體(SEQ ID NO11和12)的質(zhì)粒。采用標(biāo)準(zhǔn)化方案(Qiagen Inc，Valencia，CA)，將所得質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在含有抗生素G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。進(jìn)行ELISA以證實(shí)B11sfv-βhCG構(gòu)建體的表達(dá)。
實(shí)施例3疫苗綴合物的功能特征抗體-靶向疫苗對(duì)其在APC表面的關(guān)聯(lián)受體的識(shí)別是此遞藥平臺(tái)的第一步。用流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)研究來(lái)證實(shí)βhCG-B11和B11sfv-βhCG構(gòu)建體與表達(dá)MR的培養(yǎng)的人DC特異性結(jié)合(圖4)。
用抗MR抗體作為探針，檢查人皮膚DC和各種人體組織切片中巨噬細(xì)胞上MR的原位染色。人體組織冷凍切片用抗MR人抗體B11染色。存在于皮膚表皮層的DC用B11抗體清楚地標(biāo)記(數(shù)據(jù)未顯示)。注意到在皮膚表皮層有與DC的結(jié)合。而且，用所有組織中的抗MR B11 HuMAb染色的樹突細(xì)胞進(jìn)行的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)并顯示沒(méi)有意外的交叉反應(yīng)性(結(jié)果未顯示)。這些研究已經(jīng)用βhCG-B11重復(fù)進(jìn)行，得到相同的結(jié)果。
實(shí)施例4將βhCG抗原/抗MR抗體疫苗綴合物交叉呈遞給T細(xì)胞評(píng)價(jià)了βhCG-B11構(gòu)建體被DC加工以將βhCG抗原經(jīng)由DC上的MHC I類和II類分子呈遞給T細(xì)胞(交叉呈遞)的能力。具體地說(shuō)，通過(guò)將正常T細(xì)胞庫(kù)與暴露于所述疫苗的DC一起培養(yǎng)，用βhCG-B11構(gòu)建體引發(fā)抗原特異性T細(xì)胞(應(yīng)答)。然后，分析所得“敏化”T細(xì)胞的活性(增殖和殺傷)和特異性。通過(guò)將具有βhCG抗原的靶細(xì)胞產(chǎn)生的T細(xì)胞活性與抗原陰性對(duì)照進(jìn)行比較，可以證明T細(xì)胞的特異性。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，如果存在，應(yīng)當(dāng)只殺傷呈遞βhCG相關(guān)抗原的那些靶，而放過(guò)缺乏所述抗原或呈遞無(wú)關(guān)抗原的對(duì)照靶。因?yàn)镃TL介導(dǎo)的抗原識(shí)別總是發(fā)生在帶有所述肽的給定MHC分子的情況下，阻斷MHC肽-CTL與MHC特異性mAb的相互作用，從而證實(shí)I類或II類呈遞。
抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞的誘導(dǎo)通過(guò)將貼壁單核細(xì)胞與25ng/ml重組人GM-CSF(R&D systems，MN)和100ng/ml重組人IL-4一起培養(yǎng)5天，由正常供體外周血單核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生樹突細(xì)胞。第5天，收獲DC(未成熟)并將其重懸于AIM-V(無(wú)血清)培養(yǎng)基中。將βhCG-B11免疫綴合物(20μg/ml)加入到1.2×106DC中并于37℃孵育45分鐘。使荷載抗原的DC在CD40L(Peprotech，NJ；20ng/ml)存在下成熟至少24小時(shí)。洗滌成熟的DC(1×106)一次，并以1×106細(xì)胞/ml(DC∶T細(xì)胞比值，20)加入到預(yù)先接種到24孔板的T細(xì)胞(2×107；總量)中。使用下述培養(yǎng)條件首先在第0天，加入10ng/ml IL-7，其次在第1天，加入10ng/ml IL-10(在24小時(shí))，最后在第2天，加入20U/mlIL-2(在48小時(shí))。在第7、14和21天如上所述重新刺激，只是βhCG-B11的濃度減半(分別為10μg/ml、5μg/ml和2.5μg/ml)。檢驗(yàn)T細(xì)胞(以大量或用純化T細(xì)胞亞群)對(duì)51Cr標(biāo)記的DC、荷載βhCG-B11、B11sfv-βhCG或B11的51Cr標(biāo)記的DC的反應(yīng)性。在HLA-特異性mAb存在下確定MHC-特異性。
如圖5所示，βhCG-B11構(gòu)建體誘導(dǎo)βhCG-特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。如果T細(xì)胞用不呈遞βhCG的靶培養(yǎng)，則不能保證殺傷。用在這些實(shí)驗(yàn)中的靶細(xì)靶為用βhCG-B11構(gòu)建體或?qū)φ湛乖幚淼腍LA-匹配的DC。只用抗MR抗體(B11)處理的靶細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒活性不敏感，證實(shí)只有所述疫苗的抗原部分能夠引起CTL活性。這些結(jié)果表明βhCG-B11構(gòu)建體誘導(dǎo)有效的CTL活性，準(zhǔn)確地說(shuō)，CTL活性針對(duì)βhCG抗原而不是靶向抗體(B11)。
而且，呈遞βhCG抗原的靶的有效殺傷用純化的CD8+T細(xì)胞再現(xiàn)，在抗MHC I類抗體存在下，該殺傷被阻斷(圖6)。具體地說(shuō)，βhCG-B11構(gòu)建體用來(lái)由兩個(gè)供體的外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生βhCG-特異性T細(xì)胞。用免疫磁珠從大量培養(yǎng)物中純化CD8+和CD4+T細(xì)胞。細(xì)胞毒性試驗(yàn)如上所述進(jìn)行，效應(yīng)物∶靶比值設(shè)在40∶1。靶細(xì)胞(未成熟DC)未處理(對(duì)照)或負(fù)載βhCG-B11構(gòu)建體。為證明MHC I類特異性，通過(guò)用HLA特異性抗體預(yù)孵育阻斷靶細(xì)胞殺傷(W6/32)。
總起來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)(圖6和圖7)證實(shí)βhCG-B11構(gòu)建體誘導(dǎo)有效的βhCG-特異性CTL的能力，也證實(shí)CTL活性由CD8+T細(xì)胞以HLA-依賴性方式介導(dǎo)。用純化的CD4+T細(xì)胞沒(méi)有觀察到殺傷活性。
如圖7所示，βhCG-B11構(gòu)建體引起的T細(xì)胞在響應(yīng)靶向DC的βhCG-B11構(gòu)建體時(shí)增殖。具體地說(shuō)，用βhCG-B11構(gòu)建體處理DC，由外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生βhCG-特異性T細(xì)胞。檢測(cè)來(lái)自大量培養(yǎng)物T細(xì)胞(CD4+和CD8T細(xì)胞)在響應(yīng)抗原刺激時(shí)的增殖。T細(xì)胞與未處理DC(對(duì)照)或荷載βhCG-B11構(gòu)建體的DC在有或沒(méi)有HLA阻斷抗體存在下共同培養(yǎng)。為測(cè)量增殖，培養(yǎng)5天后，用3H-胸苷分析DNA合成。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于對(duì)照的增殖的倍數(shù)增長(zhǎng)(刺激指數(shù))。就CTL活性來(lái)看，當(dāng)T細(xì)胞由DC單獨(dú)刺激(即無(wú)抗原)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)合適的應(yīng)答。只用未綴合的抗體(抗MR B11 mAb)靶向的DC不能誘導(dǎo)由βhCG-B11構(gòu)建體引起的T細(xì)胞的增殖。T細(xì)胞的增殖能力在抗MHCI類以及II類-特異性mAb存在下被有效阻斷，證明CD4+和CD8+T細(xì)胞是感應(yīng)的。這些數(shù)據(jù)顯示由DC對(duì)βhCG-B11構(gòu)建體的攝取使得疫苗可以進(jìn)入MHC I類和II類的加工途徑，該途徑與帶有MHC區(qū)室的MR的共區(qū)域化一致。
實(shí)施例5DC對(duì)抗MR抗體B11的內(nèi)化較之于DC對(duì)甘露糖基化抗原的內(nèi)化(對(duì)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化的抑制)未成熟DC可通過(guò)胞飲或受體介導(dǎo)的胞吞機(jī)制吸收可溶性抗原(55)?？乖瓋?nèi)化機(jī)制決定其細(xì)胞內(nèi)命運(yùn)并可影響對(duì)它的免疫應(yīng)答的質(zhì)量(54，55，56)。通過(guò)MR的內(nèi)化被描述為快速、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化事件(57，58)。MR本身在其胞質(zhì)尾區(qū)內(nèi)具有兩個(gè)推定的網(wǎng)絡(luò)蛋白靶向序列，甘露糖基化金顆粒的內(nèi)化已經(jīng)被EM定位到披網(wǎng)格蛋白小窩(58，59)。網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞可通過(guò)短暫高滲休克或K+排除特異性中斷(61)。為了確定甘露糖基化抗原或B11結(jié)合到甘露糖受體上是否經(jīng)披網(wǎng)格蛋白小窩內(nèi)化，在B11mAb或甘露糖基化BSA存在下，將未成熟DC在含有或不含400nM蔗糖的AIM5培養(yǎng)基中在冰上培養(yǎng)30分鐘。細(xì)胞隨后加熱到37℃并使其內(nèi)化20分鐘。洗滌并固定后，細(xì)胞用共焦顯微鏡法進(jìn)行分析(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)B11結(jié)合到MR時(shí)，其攝取被高滲休克抑制，表明其內(nèi)化機(jī)制是通過(guò)披網(wǎng)格蛋白小窩。甘露糖基化BSA的攝取相反，不被高滲休克抑制，表明其內(nèi)化機(jī)制不依賴于披網(wǎng)格蛋白小窩的形成。甚至在比B11濃度高20倍的情況下，甘露糖基化BSA FITC的表面染色相對(duì)較弱。其后的研究揭示出內(nèi)化的甘露糖基化BSA FITC與非特異性、液相示蹤劑共定位，其中作為含有內(nèi)化B11的小囊泡排除非特異性示蹤劑(數(shù)據(jù)未顯示)。與B11-FITC相反，甘露糖基化的BSA-FITC和液相示蹤劑的攝取，通過(guò)用PI3K抑制劑渥曼青霉素預(yù)處理，而大半被阻(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明絕大多數(shù)甘露糖基化BSA，通過(guò)未成熟樹突細(xì)胞經(jīng)非特異性大胞飲機(jī)制吸收，提示對(duì)甘露糖基化抗原的免疫應(yīng)答質(zhì)量可能與特異性靶向MR的抗原相差甚遠(yuǎn)。
實(shí)施例6B11sfv-βhCG與DC的結(jié)合將單核細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的DC暴露于PBS-BSA緩沖液中的B11sfv-βhCG或βhCG-B11中，于37℃持續(xù)45分鐘，并在CD40L存在下，使其成熟過(guò)夜。收獲的DC隨后洗滌并先后用小鼠抗βhCG、山羊抗hu IgG(Fc)-PE綴合物染色。染色的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀(BD-LSR)上進(jìn)行分析。每個(gè)樣品大約收集10,000個(gè)事例。背景自動(dòng)熒光和同種型匹配的抗體染色用作對(duì)照。根據(jù)平均熒光強(qiáng)度(MFI)(數(shù)據(jù)未顯示)，B11sfv-βhCG的與表達(dá)于DC上的MR的結(jié)合類似于βhCG-B11的。
實(shí)施例7對(duì)βhCG-B11構(gòu)建體有特異性的CTL識(shí)別由DC呈遞的抗原(B11sfv-βhCG)的scFv形式針對(duì)抗DC-呈遞的βhCG-B11產(chǎn)生的CTL，要測(cè)試其暴露于βhCG-B11和B11sfv-βhCG的自體DC靶，同時(shí)未處理DC或暴露于B11的DC用作對(duì)照。抗原暴露后，靶用51鉻標(biāo)記并在一個(gè)4小時(shí)的試驗(yàn)中與CTL混合，該試驗(yàn)測(cè)量上清液中放射性的釋放。在該實(shí)驗(yàn)中，βhCG-B11-特異性T細(xì)胞識(shí)別呈遞MHC I類分子上抗原的4個(gè)靶中的2個(gè)。當(dāng)DC缺少抗原時(shí)，不發(fā)生靶的殺傷(圖11)。因此，DC對(duì)βhCG-B 11的攝取導(dǎo)致βhCG-來(lái)源的T細(xì)胞表位被CTL識(shí)別。等同實(shí)施方案僅用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員就會(huì)認(rèn)識(shí)或者能夠確定本文所述發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同實(shí)施方案。這些等同實(shí)施方案包括在所附權(quán)利要求書中。
文獻(xiàn)引用本文引用的所有專利、待審批的專利申請(qǐng)和其它出版物，全都通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。
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<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>9atgggatgga gctgtatcat cctgttcctc gtggccacag caaccggtgt ccactctgag 60gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 120tgtaagggtt ctggagacag ttttaccacc tactggatcg gctgggtgcg ccagatgccc 180gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc tatcctggtg actctgatac catatacagc 240ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac cgcctacctg 300cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtacgag aggggaccgg 360ggcgttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcagctag caccaagggc 420ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgag ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260tccttcttcc tctacag1aa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcag1a gagcctctcc 1380ctgtctccgg gtaaaggctc gagctccaag gagccgcttc ggccacggtg ccgccccatc 1440aatgccaccc tggctgtgga gaaggagggc tgccccgtgt gcatcaccgt caacaccacc 1500atctgtgccg gctactgccc caccatgacc cgcgtgctgc agggggtcct gccggccctg 1560cctcaggtgg tgtgcaacta ccgcgatgtg cgcttcgagt ccatccggct ccctggctgc 1620ccgcgcggcg tgaaccccgt ggtctcctac gccgtggctc tcagctgtca atgtgcactc 1680tgccgccgca gcaccactga ctgcgggggt cccaaggacc accccttgac ctgtgatgac 1740ccccgcttcc aggactcctc ttcctcaaag gcccctcccc ccagccttcc aagtccatcc 1800cgactcccgg ggccctcgga caccccgatc ctcccacaat aa1842<210>10<211>613<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>10Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Ser Phe35 40 45Thr Thr Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly450 455 460Lys Gly Ser Ser Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile465 470 475 480Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr485 490 495Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val500 505 510Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg515 520 525Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val530 535 540Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu545 550 555 560Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu565 570 575Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro580 585 590Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr595 600 605Pro Ile Leu Pro Gln610<210>11<211>1325<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>11aagcttcacc atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtggccacag ctaccggtgt 60ccactccgac atccagatga cccagtctcc atcctcactg tctgcatctg taggagacag 120agtcaccatc acttgtcggg cgagtcaggg tattagcagg tggttagcct ggtatcagca 180gaaaccagag aaagccccta agtccctgat ctatgctgca tccagtttgc aaagtggggt 240cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcggcct 300gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg ccaacagtat aatagttacc ctcggacgtt 360cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaagg agggggcggt tccggaggag gcggcagcgg 420gggaggaggt agcgaggtgc agctggtgca gtctggagca gaggtgaaaa agcccgggga 480gtctctgagg atctcctgta agggttctgg agacagtttt accacctact ggatcggctg 540ggtgcgccag atgcccggga aaggcctgga gtggatgggg atcatctatc ctggtgactc 600tgataccata tacagcccgt ccttccaagg ccaggtcacc atctcagccg acaagtccat 660cagcaccgcc tacctgcagt ggagcagcct gaaggcctcg gacaccgcca tgtattactg 720tacgagaggg gaccggggcg ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc 780aggctctacc ggtgggggag gctcgagctc caaggagccg cttcggccac ggtgccgccc 840catcaatgcc accctggctg tggagaagga gggctgcccc gtgtgcatca ccgtcaacac 900caccatctgt gccggctact gccccaccat gacccgcgtg ctgcaggggg tcctgccggc 960cctgcctcag gtggtgtgca actaccgcga tgtgcgcttc gagtccatcc ggctccctgg 1020ctgcccgcgc ggcgtgaacc ccgtggtctc ctacgccgtg gctctcagct gtcaatgtgc 1080actctgccgc cgcagcacca ctgactgcgg gggtcccaag gaccacccct tgacctgtga 1140
tgacccccgc ttccaggact cctcttcctc aaaggcccct ccccccagcc ttccaagtcc 1200atcccgactc ccggggccct cggacacccc gatcctccca caataagcgg ccgcagaaca 1260gaaactcatc tcagaagagg atctgaatgg cgccgcacat caccatcatc accattgatt 1320ctaga 1325<210>12<211>411<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>12Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala20 25 30Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile35 40 45Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys50 55 60Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg65 70 75 80Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly85 90 95Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser100 105 110Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly115 120 125Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln130 135 140Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg145 150 155 160Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Ser Phe Thr Thr Tyr Trp Ile Gly165 170 175Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile180 185 190Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln195 200 205Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp210 215 220Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly225 230 235 240Asp Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser245 250 255Ser Gly Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Lys Glu Pro Leu Arg260 265 270Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly275 280 285Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys290 295 300
Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln305 310 315 320Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro325 330 335Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu340 345 350Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly355 360 365Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser370 375 380Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu385 390 395 400Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln405 410<210>13<211>5<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>13Thr Tyr Trp Ile Gly1 5<210>14<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>14Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15Gly<210>15<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>15Gly Asp Arg Gly Val Asp Tyr1 5<210>16<211>11<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
<400>16Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp Leu Ala1 5 10<210>17<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>17Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5<210>18<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>18Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr1 5<210>19<211>143<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>19Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu1 5 10 15Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr20 25 30Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val35 40 45Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe50 55 60Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val65 70 75 80Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser85 90 95Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp100 105 110Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu115 120 125Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu130 135 140<210>20<211>9
<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>20Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu1 5<210>21<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>21Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>22Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn1 5<210>23<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>23Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr1 5<210>24<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>24Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala1 5<210>25<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>25
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile1 5<210>26<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>26Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val1 5<210>27<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>27Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val1 5<210>28<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>28Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu1 5<210>29<211>294<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>29gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gaga 294<210>30<211>98<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>30Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg<210>31<211>285<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>31gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctggagcct 240gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accct 285<210>32<211>95<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>32Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro85 90 9權(quán)利要求
1.一種包含單克隆抗體的分子綴合物，所述單克隆抗體結(jié)合在與β人絨毛膜促性腺激素(βhCG)連接的人抗原呈遞細(xì)胞(APC)上。
2.權(quán)利要求1的分子綴合物，其中所述抗體結(jié)合到表達(dá)于人樹突細(xì)胞上的C型凝集素上。
3.權(quán)利要求1或2的分子綴合物，其中所述抗體結(jié)合到人甘露糖受體上。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分子綴合物，其中所述抗體選自人抗體、人源化抗體和嵌合抗體。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分子綴合物，其中所述抗體選自全抗體、Fab片段和單鏈抗體。
6.權(quán)利要求1的分子綴合物，其中所述綴合物為重組融合蛋白。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分子綴合物，其中所述抗體包含人重鏈可變區(qū)，包括構(gòu)架區(qū)(FR)1、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列；和人輕鏈可變區(qū)，包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列，其中(a)所述人重鏈可變區(qū)CDR3序列包含SEQ ID NO15，及其保守修飾；和(b)所述人輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含SEQ ID NO18，及其保守修飾。
8.權(quán)利要求6的分子綴合物，其中所述人重鏈可變區(qū)CDR2序列包含SEQ ID NO14，及其保守修飾；所述人輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含SEQ ID NO17，及其保守修飾。
9.權(quán)利要求7或8的分子綴合物，其中所述人重鏈可變區(qū)CDR1序列包含SEQ ID NO13，及其保守修飾；所述人輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含SEQ ID NO16，及其保守修飾。
10.權(quán)利要求1的分子綴合物，其中所述抗體包含(a)源自人重鏈可變區(qū)(VH)5-51種系序列即SEQ ID NO30的重鏈可變區(qū)；(b)源自人輕鏈可變區(qū)κ鏈(Vκ-L)15即SEQ ID NO32種系序列的輕鏈可變區(qū)。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分子綴合物，其中所述抗體包含人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)，所述可變區(qū)包含分別示于SEQ ID NO4和SEQ ID NO8的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO4或SEQ ID NO8同源性足夠高的氨基酸序列，致使所述抗體保持結(jié)合到人樹突細(xì)胞上的能力。
12.一種包含人抗體重鏈和人抗體輕鏈的分子綴合物，其中任一條或兩條鏈連接在βhCG上。
13.權(quán)利要求12的分子綴合物，其中所述重鏈連接在βhCG上并且包含SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求12或13的分子綴合物，其中所述輕鏈包含SEQ IDNO6中所示的氨基酸序列。
15.一種包含單克隆抗體的分子綴合物，所述單克隆抗體結(jié)合在與β人絨毛膜促性腺激素(βhCG)連接的人抗原呈遞細(xì)胞(APC)上，其中所述抗體包含(a)源自人VH5-51種系序列即SEQ ID NO30的重鏈可變區(qū)；和(b)源自人Vκ-L15即SEQ ID NO32種系序列的輕鏈可變區(qū)。
16.一種包含人單鏈抗體的分子綴合物，所述人單鏈抗體結(jié)合到與β人絨毛膜促性腺激素(βhCG)連接的人抗原呈遞細(xì)胞(APC)上，其中所述綴合物包含SEQ ID NO12中所示的氨基酸序列。
17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分子綴合物，所述綴合物由APC內(nèi)化并加工，致使T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是針對(duì)所述抗原產(chǎn)生的。
18.權(quán)利要求17的分子綴合物，其中所述T細(xì)胞應(yīng)答由細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)。
19.權(quán)利要求17或18的分子綴合物，其中所述T細(xì)胞應(yīng)答由CD4+和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)。
20.權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的分子綴合物，其中所述T細(xì)胞應(yīng)答經(jīng)由主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類和MHC II類兩種途徑誘導(dǎo)。
21.一種組合物，所述組合物包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分子綴合物和藥物可接受的載體，并任選與佐劑聯(lián)用。
22.一種誘導(dǎo)或增強(qiáng)抗βhCG的T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括使前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分子綴合物與APC接觸，致使所述抗原以誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述抗原的T細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答的方式被加工并呈遞給T細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述T細(xì)胞應(yīng)答由CD4+和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)。
24.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述T細(xì)胞應(yīng)答由細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或輔助T細(xì)胞介導(dǎo)。
25.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述T細(xì)胞應(yīng)答經(jīng)由MHC I類和MHC II類兩種途徑將所述抗原交叉呈遞給T細(xì)胞而誘導(dǎo)。
26.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述βhCG抗原由腫瘤細(xì)胞表達(dá)。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞選自結(jié)腸、肺、胰腺、乳腺、卵巢和生殖細(xì)胞來(lái)源的腫瘤細(xì)胞。
28.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述分子綴合物與所述樹突細(xì)胞在體內(nèi)接觸。
29.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述分子綴合物與所述樹突細(xì)胞在活體外接觸。
30.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括使所述樹突細(xì)胞與刺激樹突細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子、任選粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或FLT3-L接觸。
31.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括使所述樹突細(xì)胞與免疫刺激劑、任選抗溶細(xì)胞性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)抗體接觸。
32.一種免疫受試者的方法，所述方法包括給予前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分子綴合物、任選聯(lián)用的佐劑、刺激樹突細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子和/或免疫刺激劑。
33.一種誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述方法包括形成抗原與結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的單克隆抗體的綴合物；和使所述綴合物在體內(nèi)或活體外與APC接觸，致使所述抗原以誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的方式被內(nèi)化、加工并呈遞給T細(xì)胞。
34.權(quán)利要求33的方法，所述方法還誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述抗原的輔助T細(xì)胞應(yīng)答。
35.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述T細(xì)胞應(yīng)答由CD4+和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)。
36.權(quán)利要求33-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述T細(xì)胞應(yīng)答經(jīng)由MHC I類和MHC II類兩種途徑誘導(dǎo)。
37.權(quán)利要求33-36中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體結(jié)合到表達(dá)于人樹突細(xì)胞的C型凝集素上。
38.權(quán)利要求33-37中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體結(jié)合到所述人甘露糖受體上。
39.權(quán)利要求33-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體選自人抗體、人源化抗體和嵌合抗體。
40.權(quán)利要求33-39中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體選自全抗體、Fab片段和單鏈抗體。
41.權(quán)利要求33-40中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體包含人重鏈可變區(qū)，包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列；和人輕鏈可變區(qū)，包括FRI、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列，其中(a)所述人重鏈可變區(qū)CDR3序列包含SEQ ID NO15，及其保守修飾；和(b)所述人輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含SEQ ID NO18，及其保守修飾。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述人重鏈可變區(qū)CDR2序列包含SEQ ID NO14，及其保守修飾；所述人輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含SEQ ID NO17，及其保守修飾。
43.權(quán)利要求41或42的方法，其中所述人重鏈可變區(qū)CDR1序列包含SEQ ID NO13，及其保守修飾；所述人輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含SEQ ID NO16，及其保守修飾。
44.權(quán)利要求41-43中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體包含人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)，所述可變區(qū)包含分別示于SEQ ID NO4和SEQ ID NO8的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO4或SEQ ID NO8同源性足夠高的氨基酸序列，致使所述抗體保持結(jié)合到樹突細(xì)胞上的能力。
45.權(quán)利要求33-44中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原由腫瘤細(xì)胞或病原生物體表達(dá)。
46.權(quán)利要求33-45中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原選自βhCG、Gp100、前列腺相關(guān)抗原和Pmel-17。
47.權(quán)利要求33-46中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括使所述樹突細(xì)胞與佐劑、刺激樹突細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子和/或免疫刺激劑接觸。
48.權(quán)利要求33-47中任一項(xiàng)的方法，其中將所述綴合物體內(nèi)給予受試者。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述受試者獲得針對(duì)所述抗原的免疫力。
全文摘要
本發(fā)明提供了新型抗體疫苗綴合物以及用其誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的方法。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該疫苗綴合物包括連接在抗甘露糖受體(MR)抗體上的人絨毛膜促性腺激素β亞單位(βhCG)抗原。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1767852SQ200480008178
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2004年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月31日
發(fā)明者T·克勒, M·恩德雷斯, L·何, V·拉馬克里什納 申請(qǐng)人:塞爾德克斯醫(yī)療公司