專(zhuān)利名稱：：抗日本腦炎疫苗的工業(yè)生產(chǎn)方法和所獲得的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基于日本腦炎病毒(JEV)的預(yù)防日本腦炎的疫苗尤其是可用于人類(lèi)的疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明還涉及由該方法所獲得的疫苗。在許多遠(yuǎn)東國(guó)家以及世界其它地區(qū)，傳播媒介為蚊的日本腦炎病毒是導(dǎo)致已知為日本腦炎的嚴(yán)重感染的原因。業(yè)已知抗日本腦炎的疫苗，它由將JEV顱內(nèi)注射至幼年小鼠中并收集感染組織的方法來(lái)獲得。接著通常通過(guò)沉淀方法，尤其是用魚(yú)精蛋白沉淀來(lái)純化所得到的組織懸液。在文獻(xiàn)中還提到其它用于純化這些組織制備物的方法，例如超濾、過(guò)濾和離心，或用聚乙二醇沉淀等方法，這些方法可相互結(jié)合或與凝膠過(guò)濾方法或硫酸纖維素或交聯(lián)的硫酸多糖層析方法結(jié)合(JP-B-65,000,611，JP-A-53,133,627，JP-A-50,048,118，JP-A-2,223,531，US-A-4,725,546，JP-A-49,020,322和B-81,005,204，JP-B-67,025,408)。在現(xiàn)有技術(shù)中，如世界衛(wèi)生組織所建議，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法，通過(guò)化學(xué)試劑如甲醛來(lái)滅活病毒制劑，由于病毒在該環(huán)境中更高溫度下不穩(wěn)定，所以在4℃下甲醛濃度為1/2000時(shí)長(zhǎng)時(shí)間滅活50-60天。由此獲得的商業(yè)疫苗是有效的，但是其制備、純化和滅活困難且昂貴。此外，由于來(lái)自幼年小鼠組織的污染物可能導(dǎo)致副反應(yīng)，從而往往限制它們的應(yīng)用。因此希望能通過(guò)其它更工業(yè)化的方法，尤其是通過(guò)利用病毒在細(xì)胞系中繁殖和增殖來(lái)生產(chǎn)疫苗。然而，利用高度工業(yè)化的方法大量生產(chǎn)疫苗比顱內(nèi)增殖的情況更為困難，這不僅由于必須處理相當(dāng)大的數(shù)量，而且因?yàn)楂@得和控制高的產(chǎn)率很困難，還由于接著要遇到的，可能來(lái)自細(xì)胞或來(lái)自病毒增殖培養(yǎng)基的污染物所造成的純化問(wèn)題?，F(xiàn)有技術(shù)已知日本腦炎病毒可在各種細(xì)胞培養(yǎng)物上繁殖，包括細(xì)胞系培養(yǎng)物，尤其是Vero細(xì)胞。然而，公開(kāi)的培養(yǎng)方法不可能在大規(guī)模工業(yè)培養(yǎng)條件(僅以適當(dāng)?shù)某杀旧a(chǎn))下獲得滿意的產(chǎn)率?，F(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有描述任何高度純化來(lái)自細(xì)胞系繁殖和增殖的病毒制備物的方法。因此本發(fā)明建議克服這些缺陷，并且提供抗日本腦炎的疫苗的生產(chǎn)方法，該方法可大規(guī)模及在安全、迅速和經(jīng)濟(jì)的條件下使用，并且可獲得非常高純度和非常好的工業(yè)產(chǎn)率的有效疫苗。為了達(dá)到這些目的，本發(fā)明的主題是抗日本腦炎疫苗的工業(yè)生產(chǎn)方法，特征在于它包括下列步驟a)培養(yǎng)來(lái)自細(xì)胞系的細(xì)胞，b)在存在病毒增殖培養(yǎng)基時(shí)，用日本腦炎病毒接種獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物，c)病毒在細(xì)胞中繁殖和增殖。d)收集細(xì)胞所產(chǎn)生的病毒懸液形式的病毒增殖培養(yǎng)基，e)通過(guò)至少一個(gè)離子交換層析步驟和一個(gè)凝膠滲透步驟純化病毒懸液，f)將病毒懸液配制和轉(zhuǎn)化成藥物形式以保存至使用時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的具體特征，接種的病毒量相當(dāng)于感染復(fù)數(shù)小于0.1。因此，對(duì)于病毒增殖和繁殖獲得了良好的產(chǎn)率。根據(jù)本發(fā)明的具體特征，該方法還包括在純化步驟e)之前或之后滅活病毒懸液這一步驟。因此在使用毒性株用于病毒增殖和繁殖時(shí)，可以生產(chǎn)滅活的疫苗。根據(jù)本發(fā)明的方法的特征，在室溫使用化學(xué)試劑來(lái)進(jìn)行滅活。因此可迅速進(jìn)行滅活。根據(jù)具體實(shí)施方案，該方法特征在于使用Vero細(xì)胞系以確保病毒增殖。由于這些細(xì)胞對(duì)日本腦炎病毒是非常相容的，因此可以獲得良好的產(chǎn)率。根據(jù)實(shí)施本發(fā)明另一特征，該方法特征在于通過(guò)進(jìn)行下述步驟來(lái)純化病毒懸液·離子交換層析，·吸附層析，·凝膠滲透。因此可以獲得很高純度的疫苗。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，該方法還在于在收集步驟(d)之后，再加入新的病毒增殖培養(yǎng)基，等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間以允許進(jìn)一步的病毒增殖和進(jìn)行進(jìn)一步的收集病毒增殖培養(yǎng)基。因此可以從相同的細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得相當(dāng)大量的收集物。本發(fā)明的主題還在于通過(guò)在來(lái)自細(xì)胞系的細(xì)胞中的培養(yǎng)而獲得的疫苗，特征在于它包括日本腦炎病毒，和細(xì)胞DNA含量小于100pg/劑。從污染病毒和蛋白方面來(lái)看，該疫苗既具有功效又具有對(duì)可能與病毒接觸的任何人進(jìn)行全身性給藥時(shí)所必需的安全性。本發(fā)明的其它主題和優(yōu)點(diǎn)將在閱讀下面的描述時(shí)表現(xiàn)出來(lái)。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞培養(yǎng)可在發(fā)酵罐或按傳統(tǒng)在燒瓶(Roux盤(pán)，旋轉(zhuǎn)燒瓶，MultitrayTM，Cell-CubeTM，等)中進(jìn)行。然而，優(yōu)選將含有微載體的大體積發(fā)酵罐(500-2000L)與細(xì)胞培養(yǎng)基一起使用，將來(lái)自與日本腦炎病毒相容的細(xì)胞系的細(xì)胞接種物加入其中；該細(xì)胞系可以為BHK21(幼年倉(cāng)鼠腎臟)細(xì)胞或?yàn)閂ero細(xì)胞。能在發(fā)酵罐懸液中培養(yǎng)的微載體可為各種已知用于該用途的微載體；尤其可能提到濃度為1-3g/L培養(yǎng)基的Cytodex1TM顆粒，它用于培養(yǎng)Vero細(xì)胞尤其合適。持續(xù)時(shí)間、溫度和其它培養(yǎng)條件，尤其是培養(yǎng)基的組成根據(jù)Cytodex1TM微載體上的Vero細(xì)胞的性質(zhì)而改變，為了獲得良好的細(xì)胞生長(zhǎng)，4天的持續(xù)時(shí)間是適合的，并且因此可以在培養(yǎng)物的穩(wěn)定期之前接種病毒。接著用病毒增殖培養(yǎng)基取代該培養(yǎng)基，并將日本腦炎病毒的接種物以較低感染復(fù)數(shù)(或MOI)的量加入到發(fā)酵罐中，感染復(fù)數(shù)為加入的病毒顆粒的量與存在的細(xì)胞數(shù)目的比值。感染復(fù)數(shù)優(yōu)選小于約0.1，較優(yōu)選小于0.01。使用的病毒株可為減毒株，例如SA14-14-2株或任何已知的毒性免疫原毒株，例如Nakayama或Beijing株。由NVSI(國(guó)家疫苗和血清研究所，北京)提供的第88代毒株P(guān)3非常適合本發(fā)明的需要。用于病毒增殖的培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，如MEM，其中盡可能地減少蛋白質(zhì)的量是非常重要的。優(yōu)選使用其中通常為人清蛋白的蛋白質(zhì)濃度小于5g/L的培養(yǎng)基。同樣優(yōu)選使用完全缺乏蛋白質(zhì)的互補(bǔ)培養(yǎng)基。病毒增殖和繁殖所需的時(shí)間可以通過(guò)監(jiān)測(cè)感染效價(jià)來(lái)確定。當(dāng)LD50/ml效價(jià)為約107或108時(shí)，收集病毒被認(rèn)為是可能的。通過(guò)簡(jiǎn)單地取出含有細(xì)胞產(chǎn)生的病毒的病毒增殖培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行收集。有利地，在取出病毒增殖培養(yǎng)基后，將新培養(yǎng)基再加入到發(fā)酵罐中以使得病毒進(jìn)一步增殖來(lái)導(dǎo)致進(jìn)一步收集。因此在相同的發(fā)酵罐中從相同的細(xì)胞培養(yǎng)物中可容易地獲得高達(dá)8次連續(xù)的收集。為了獲得LD50/ml為107或108的劑量，病毒增殖和繁殖所需的時(shí)間通常為2至3天；首次收集優(yōu)選在病毒接種之后3天來(lái)進(jìn)行，接著每2或3天連續(xù)進(jìn)行收集。因此，發(fā)酵罐中的一個(gè)完整周期可持續(xù)23天，其按如下劃分D0發(fā)酵罐中微載體上的細(xì)胞培養(yǎng)的開(kāi)始，·D4用病毒增殖培養(yǎng)基取代細(xì)胞培養(yǎng)基并接種病毒，·D7首次收集，·D9第二次收集，·D11第三次收集，·D14第四次收集，·D16第五次收集，·D18第六次收集，·D21第七次收集，·D23第八次收集。接著所獲得的各種收集物可分別或以混合物進(jìn)行加工。加工僅由純化或由純化和滅活組成，滅活可在純化步驟之前或之后進(jìn)行。當(dāng)開(kāi)始所用的病毒株為毒株時(shí)，在根據(jù)本發(fā)明的加工中，滅活是一個(gè)必需的步驟；另一方面，當(dāng)用于病毒殖殖的毒株為減毒株時(shí)，例如SA14-14-2株，可省去該滅活步驟或在盡可能安全的條件下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，在室溫下使用化學(xué)試劑進(jìn)行滅活，根據(jù)本發(fā)明，室溫指大大高于+4℃的溫度，+4℃是滅活JEV常用的溫度。該溫度可有利地在20和37℃之間，優(yōu)選約25℃的溫度。實(shí)際上，已觀察到在該溫度下病毒被迅速滅活，并且還令人驚奇地注意到盡管溫度較高在病毒增殖培養(yǎng)基中含有的病毒是穩(wěn)定的；從工業(yè)化觀點(diǎn)來(lái)看，該非常短的滅活時(shí)間是本發(fā)明方法的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)。用于滅活的化學(xué)試劑尤其可為甲醛或β-丙醇酸內(nèi)酯；優(yōu)選甲醛。例如可在25或37℃下，使用甲醛14天或更短來(lái)進(jìn)行滅活；時(shí)間優(yōu)選至少7天。有利地，根據(jù)本發(fā)明，使用的甲醛濃度可小于JEV滅活中常用的濃度；它可為例如約1/2000-1/8000，尤其為1/4000。還可使用例如2種不同的化學(xué)試劑來(lái)進(jìn)行2次連續(xù)的不同滅活步驟。還可在滅活步驟之前過(guò)濾每次收集物以除去細(xì)胞碎片(蛋白質(zhì)，核酸等)，以及濃縮每次收集物以提高病毒效價(jià)和液體培養(yǎng)基的蛋白含量。濃縮倍數(shù)優(yōu)選至少等于10，例如約1000，可通過(guò)常用方法，尤其是超濾來(lái)進(jìn)行濃縮。必須純化病毒懸液，根據(jù)所使用的方法該懸液是或不是滅活的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)重要特征，純化步驟包括至少一個(gè)層析步驟。有利地，連續(xù)進(jìn)行下面3個(gè)步驟·離子交換層析·吸附層析·凝膠滲透。離子交換層析優(yōu)選為弱或強(qiáng)的陰離子交換層析。采用的載體為例如DEAE-SpherodexTM(美國(guó)Biosepra出售)，它選擇性地保留病毒顆粒并允許大部分污染蛋白通過(guò)。接著可在載體例如羥基磷灰石或螯合凝膠(鈣螯合等)上進(jìn)行包含病毒的洗脫液的洗脫。在此情況下，病毒不與載體結(jié)合，該載體尤其保留核酸。此步驟后，在任何適宜的載體上，例如Sepharose6FFTM(Pharmacia)或FractogelTM(E.Merck)上進(jìn)行凝膠過(guò)濾或分子篩(又稱為凝膠滲透)。在此操作期間，洗脫后可回收第一級(jí)分中的病毒顆粒；后面的洗脫峰相當(dāng)于病毒蛋白和殘留的不純物。因此，對(duì)于疫苗的生產(chǎn)，僅僅洗脫物的第一級(jí)分被保留。有利地，在吸附層析和凝膠過(guò)濾之間可進(jìn)行濃縮步驟，優(yōu)選通過(guò)用截止閾為10000道爾頓的膜超濾。接著配制純化和任選被滅活的病毒懸液以獲得所需的抗原效價(jià)；還可向其中加入穩(wěn)定劑或佐劑；接著將它制成藥物形式以在良好的條件下保存，直至使用。實(shí)施例1.材料-Vero細(xì)胞用于接種發(fā)酵罐的Vero細(xì)胞來(lái)自第137代的Vero細(xì)胞庫(kù)，該庫(kù)已進(jìn)行了其鑒定和定性所必需的檢測(cè)。-JEV病毒采用的病毒株為由NVSI提供的第88代毒株P(guān)3。將收到的一安瓿病毒懸浮在100ml培養(yǎng)基中，并使用0.1μm濾器過(guò)濾。該溶液用來(lái)感染兩個(gè)75cm2的燒瓶。5天后，過(guò)濾所收集的上清液(0.2μm濾器)。進(jìn)行幾次收集，形成初級(jí)接種物的混合物L(fēng)D50/ml效價(jià)＝108.16。以10ml初級(jí)接種物感染12個(gè)850cm2振蕩燒瓶的比例來(lái)制備工作接種物。進(jìn)行幾次收集，30.2升混合物具有LD50/ml＝108.31的效價(jià)。隨后檢測(cè)初級(jí)和工作接種物以確保它們的鑒定和定性。2.培養(yǎng)方法將500升發(fā)酵罐中裝滿含有濃度為3g/l的Cytodex1TM微載體的常規(guī)用于Vero細(xì)胞的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基用Vero細(xì)胞接種(200000細(xì)胞/ml)。讓細(xì)胞附著并生長(zhǎng)4天。在第4天末，將培養(yǎng)基用病毒增殖培養(yǎng)基取代。將具有計(jì)算量病毒的病毒接種物加入罐中，以使感染復(fù)數(shù)MOI等于1/500。在37℃溫度下制備各種培養(yǎng)物。在病毒接種后3天，收集病毒增殖培養(yǎng)基，這產(chǎn)生第一收集物。將病毒增殖培養(yǎng)基用新培養(yǎng)基取代，每?jī)商爝M(jìn)行一次收集，收集的總次數(shù)等于6。表I表明在每次收集時(shí)獲得的效價(jià)。</tables>將收集物在濾膜上過(guò)濾(孔直徑0.2μm)。將收集物全部混合在一起。將收集混合物通過(guò)在10000道爾頓膜上超濾而濃縮100倍。將最終濃度為1/4000的甲醛溶液加入到濃縮的收集混合物中，并連續(xù)攪拌下將得到的混合物保存于室溫下(20-25℃)14天。接著進(jìn)行進(jìn)一步過(guò)濾，并根據(jù)WHO方法，通過(guò)兩步驟檢查來(lái)證實(shí)滅活(1988年的技術(shù)報(bào)告771)。用甲醛滅活的所有制劑被證實(shí)是令人滿意的。將滅活溶液通過(guò)含有DEAE基團(tuán)、平衡于pH8的離子交換層析柱(DEAE-SpherodexTM樹(shù)脂)。病毒被保留于柱中。在用磷酸鹽緩沖液洗滌后，將病毒用磷酸鹽緩沖液，0.2MNaCl洗脫。從而除去了大部分蛋白污染物。用通過(guò)鈣相互作用的螯合親和純化洗脫液，將洗脫液注射通過(guò)ChelatingSepharoseTM柱(Pharmacia)。病毒未被結(jié)合，直接穿過(guò)該柱。接著通過(guò)在截止閥為10000Da的膜上超濾來(lái)進(jìn)行濃縮，以便將病毒懸液的體積減少約20倍。將預(yù)純化病毒的濃縮液加入到Sepharose6FFTM柱中。用0.2MNaCl磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫。病毒顆粒被洗脫在被排除的級(jí)分中。純化過(guò)程的特點(diǎn)示于表II中。表II</tables>(*)每階段的收率通過(guò)在第0天和第7天注射，將純化的滅活病毒溶液用于免疫小鼠。在第30天，使用含有105LD50/ml的溶液進(jìn)行毒株病毒的試驗(yàn)。用純化的未稀釋制劑和用稀釋至1/32的純化制劑接種的所有小鼠受到保護(hù)。在相同試驗(yàn)中，檢測(cè)了用Biken疫苗(1/32稀釋)接種的小鼠，其中僅2/5受到保護(hù)。權(quán)利要求1.工業(yè)化生產(chǎn)抗日本腦炎的疫苗的方法，特征在于它包括下述步驟a)培養(yǎng)來(lái)自細(xì)胞系的細(xì)胞，b)在存在病毒增殖培養(yǎng)基時(shí)，用日本腦炎病毒接種獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物，c)病毒在細(xì)胞中增殖和繁殖，d)收集細(xì)胞所產(chǎn)生的病毒懸液形式的病毒增殖培養(yǎng)基，e)通過(guò)至少一個(gè)離子交換層析步驟和一個(gè)凝膠滲透步驟純化病毒懸液，f)將病毒懸液配制和轉(zhuǎn)化成藥物形式以保存至使用時(shí)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，特征在于接種的病毒量相當(dāng)于感染復(fù)數(shù)(MOI)小于0.1。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，特征在于它還包括在純化步驟(e)之前或之后的一個(gè)病毒懸液的滅活步驟。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于在室溫下使用化學(xué)試劑進(jìn)行滅活。5.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，特征在于用于病毒增殖的細(xì)胞為Vero細(xì)胞。6.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，特征在于通過(guò)下面的方法進(jìn)行純化·離子交換層析，·吸附層析，·凝膠滲透。7.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，特征在于它在收集步驟d)之后，還再加入新的病毒增殖培養(yǎng)基，等待足夠的時(shí)間以允許進(jìn)一步的病毒增殖和進(jìn)行進(jìn)一步的病毒增殖培養(yǎng)基的收集。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，特征在于收集病毒增殖培養(yǎng)基并用新培養(yǎng)基取代，次數(shù)為1至7之間。9.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，特征在于它還在步驟d)之后，過(guò)濾所收集的病毒懸液。10.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，特征在于病毒增殖培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)濃度小于5g/l。11.抗日本腦炎的疫苗，特征在于它包括通過(guò)在來(lái)自細(xì)胞系的細(xì)胞中培養(yǎng)而獲得的日本腦炎病毒，以及在于細(xì)胞DNA含量小于100pg/劑。全文摘要公開(kāi)了工業(yè)化生產(chǎn)抗日本腦炎的疫苗的方法,其中(a)培養(yǎng)來(lái)自細(xì)胞系的細(xì)胞,(b)在存在病毒生長(zhǎng)培養(yǎng)基時(shí),用日本腦炎病毒接種得到的細(xì)胞培養(yǎng)物,(c)病毒在細(xì)胞中繁殖和增殖,(d)以由細(xì)胞產(chǎn)生的病毒懸液的形式回收病毒生長(zhǎng)培養(yǎng)基,(e)在至少一個(gè)離子交換層析步驟和一個(gè)凝膠滲透步驟中純化病毒懸液,和(f)將病毒懸液配制和轉(zhuǎn)化為藥物形式以保存至使用時(shí)。還公開(kāi)了日本腦炎疫苗,其特征在于它包括通過(guò)培養(yǎng)來(lái)自細(xì)胞系的細(xì)胞所生產(chǎn)的日本腦炎病毒,及在于細(xì)胞DNA含量小于100pg/劑。文檔編號(hào)C12N7/06GK1194584SQ96196620公開(kāi)日1998年9月30日申請(qǐng)日期1996年7月29日優(yōu)先權(quán)日1995年8月1日發(fā)明者B·帆吉特,A·弗蘭康,P·海曼丁杰申請(qǐng)人:巴斯德格諾血清和疫苗公司