專利名稱：生產(chǎn)肽混合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的和工業(yè)上有用的生產(chǎn)肽混合物的方法，這種肽混合物具有所需要的性質(zhì)，具體地說(shuō)分子量、滲透勢(shì)、細(xì)菌學(xué)、和礦物質(zhì)含量。
這樣的混合物非常適于用作或者用于腹膜滲析和胃腸外給藥的藥劑中，另外也適于其它藥物和化妝品方面的應(yīng)用。
哺乳動(dòng)物腎的正常功能包括下列活性，如保持不變的以酸為基礎(chǔ)的平衡和電解質(zhì)平衡、從血液中除去過(guò)量的液體和身體代謝產(chǎn)生的廢物。在患有腎部疾病的個(gè)體中，腎的這種功能可降低到正常水平的5％或者更少。當(dāng)腎臟功能明顯降低時(shí)，如果想繼續(xù)維持生命則必需使用人工手段來(lái)取代腎臟的這種活性。臨床上通過(guò)使用滲析來(lái)完成這一過(guò)程。用于完成這一過(guò)程的最普通的方法之一是血液滲析，在這種方法中是使患者的血液通過(guò)人工腎臟滲析器。在這種滲析器中，合成的半透膜作為人工腎臟，患者的血液與人工腎臟的一邊接觸，在滲透膜的另一邊有滲析液或滲析物，其組分可以使患者血液中不需要的產(chǎn)物通過(guò)擴(kuò)散作用經(jīng)此半透膜自然進(jìn)入體液中。這樣，實(shí)質(zhì)上以與腎臟相同的方式清洗了血液，并使血液返回到患者的體內(nèi)。這種滲析的方法要求滲析器對(duì)患者的身體處理幾小時(shí)，通常是一周幾次。盡管這種方法是有效的，但由于明顯的原因，這種方法存在很多不便之處。
通過(guò)使用以患者自身的腹膜作為所需要的半透膜的技術(shù)克服了需要體外處理血液的血液滲析方法的一些缺點(diǎn)。腹膜是膜襯，其中含有大量的血管和毛細(xì)管，并且能夠充當(dāng)天然的半透膜?？梢酝ㄟ^(guò)腹腔壁上的導(dǎo)管將滲析液導(dǎo)入到腹腔中。滲析物合適的滯留時(shí)間使其在滲析物和血液之間進(jìn)行溶質(zhì)交換。通過(guò)在血液和滲析物之間提供合適的滲透梯度除去體液，以便使血液中的水分流出。這樣，可以使血液具有正確的以酸為基質(zhì)的平衡、電解質(zhì)平衡和體液平衡，不從血液中除去不需要的產(chǎn)物。在完全滲析后可以很容易地通過(guò)所說(shuō)的導(dǎo)管從體腔中除去滲析液。盡管存在不止一種的腹膜滲析，但是稱為連續(xù)流動(dòng)的腹膜滲析(CAPD)技術(shù)是尤其受歡迎的，這是因?yàn)樵谌苜|(zhì)和體液的交換期間其不需要將患者一直固定在儀器上。唯一需要的靜坐期是滲析液流入和流出期間。
對(duì)于用于腹膜滲析藥劑的組分有特殊的要求。這些要求還根據(jù)患者有所變化。當(dāng)然這些藥劑必需無(wú)毒。此外，它們必須在分子大小、傳導(dǎo)率、鹽和礦物質(zhì)含量方面具有特殊性。
對(duì)于達(dá)到所需的滲透梯度，目前最普遍接受的藥劑是葡萄糖。
葡萄糖的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)毒，并且如果其進(jìn)入血液能夠很容易地被代謝掉。然而，使用它的主要問(wèn)題是滲析物中的葡萄糖很容易被血液吸收。盡管任何物質(zhì)都有其最終進(jìn)入血液循環(huán)的途徑，但葡萄糖通過(guò)腹膜十分迅速，以致于在流入2-3小時(shí)內(nèi)，滲透梯度就不存在了。這甚至可以引起逆向的超濾，產(chǎn)生不需要的結(jié)果，即在滲析處理結(jié)束時(shí)滲透物中的水被重新吸收。此外，吸收的葡萄糖的量可以占患者攝入的能量的大部分，可能高達(dá)12％-35％。而這一過(guò)程對(duì)非糖尿病患者沒(méi)有明顯的影響，對(duì)葡萄糖耐受能力已經(jīng)受損的患者其可能是嚴(yán)重的代謝負(fù)擔(dān)。這種增加的負(fù)擔(dān)可導(dǎo)致高血糖和肥胖癥(這兩種疾病在許多CAPD患者中已經(jīng)觀察到)。糖尿病患者還受到不得不向腹膜滲透物中加入胰島素(目的是降低由于增加的葡萄糖負(fù)擔(dān)而導(dǎo)致高血糖的危險(xiǎn))的不便和危險(xiǎn)。
由于腹膜中蛋白質(zhì)的非酶催糖基化，包含葡萄糖的滲析液可以降低腹膜的過(guò)濾效率。在這方面可以參考James W.Dobbie發(fā)表在美國(guó)腎臟疾病雜志(Vol.XV，No.2，1990年2月，第97-109頁(yè))的文章“腹膜分子生物學(xué)和超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)中的新概念它們對(duì)腹膜滲析的重要性”。
葡萄糖的使用在滲析液的制備方面也存在問(wèn)題。通常滲析液的消毒是通過(guò)加熱來(lái)完成的，在生理pH值時(shí)這種加熱將導(dǎo)致葡萄糖焦糖化。為了彌補(bǔ)這一點(diǎn)，通常將滲析液的pH值調(diào)節(jié)到5.0-5.5。這樣低的pH值低于身體的正常pH值可能導(dǎo)致流入時(shí)某些患者疼痛，并且可能導(dǎo)致腹膜硬化，這種硬化接下來(lái)引起溶質(zhì)平衡或除去方面的疾病(Schmidt等，國(guó)際醫(yī)藥史，1411265-1266，1980)。
這些不利因素使得發(fā)現(xiàn)了葡萄糖的合適的替代品作為急需的滲透劑。已經(jīng)提出了很多能夠滿足下列標(biāo)準(zhǔn)的物質(zhì)具有生物惰性、不易穿過(guò)腹膜、無(wú)毒、提供足夠的滲透壓。已經(jīng)證明許多所建議的物質(zhì)不適宜替代葡萄糖。例如，由于葡聚糖(Gjessing，醫(yī)藥博覽學(xué)報(bào)，185237-239，1960)或者聚陰離子(美國(guó)專利說(shuō)明書4 339 433)具有高分子量，所以已經(jīng)提出它們作為葡萄糖的替代品。因此它們通過(guò)腹膜進(jìn)入血液的擴(kuò)散作用降低。然而，淋巴系統(tǒng)在溶質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中的作用明顯地限制了高分子量物質(zhì)本身所具有的優(yōu)點(diǎn)(Allen等，美國(guó)生理學(xué)雜志，119776-782，1937)。另外，對(duì)于聚陰離子，它們的毒性作用如何還不清楚，因?yàn)榇蠖鄶?shù)聚陰離子是不能代謝的。關(guān)于下列化合物(如山梨醇、木糖醇和葡萄糖聚合物)觀察到了與代謝類似的問(wèn)題。代謝十分緩慢的山梨醇與和高滲昏迷和死亡現(xiàn)象相關(guān)(Raja等，國(guó)際醫(yī)藥年鑒，73993-994，1970)，因此不再使用。木糖醇和葡萄糖聚合物也都傾向于在血液中積累，并且可能與副作用有關(guān)(BazyaLo等，Trans Amer.Sec.artif.Interm.Organs，28280-286，1982)。在滲透能力上可以與葡萄糖相比的果糖也顯示出許多同樣的不利之處。由于其成本較高，無(wú)法廣泛使用。
所提出的使用氨基酸替代葡萄糖是更有前途的。氨基酸是完全可以耐受的，并且沒(méi)有已知的副作用(Oren等，Perit.Dial.Bull，366-72)。由于它們的分子量較低，和葡萄糖相比在量的基礎(chǔ)上表現(xiàn)出更高的滲透作用。然而，這也有可能導(dǎo)致氨基酸迅速吸收到血液中，使?jié)B透梯度迅速消失。
雖然與葡萄糖的吸收相比，氨基酸的吸收是有利的(因?yàn)槠淇梢匝a(bǔ)充在許多CAPD患者中觀察到的蛋白質(zhì)消耗)，但是與葡萄糖相比，在氨基酸溶液的幾乎抑制購(gòu)買的成本方面存在許多不利之處。此外，氨基酸的迅速吸收導(dǎo)致相當(dāng)大的氮負(fù)擔(dān)，這種氮負(fù)擔(dān)明顯地增加血液脲氮水平。這樣，可以看出甚至是氨基酸也不是合適的替代品。
通過(guò)DK 168 080中公開的發(fā)明(下文將更詳細(xì)地描述)已經(jīng)完成了腹膜滲析方法的改進(jìn)。這里使用的滲透劑不僅是安全且有利的葡萄糖替代品，而且在使用中也是非常經(jīng)濟(jì)的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)(如乳清蛋白質(zhì))的酶促水解的分子量相對(duì)較低的寡肽(300-2000道爾頓)的混合物可以在腹膜滲析溶液中用作有效的滲透劑。與氨基酸溶液相比，分子量稍微高的這種肽能防止血液對(duì)其迅速地吸收，更有效地保持滲透梯度，并防止血液中不需要的氮的增加。這種最終被血清吸收(盡管十分緩慢)的肽混合物還能提供有價(jià)值的飲食補(bǔ)充，所說(shuō)的肽混合物來(lái)源于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。最后，本發(fā)明的肽混合物能提供成本低廉且來(lái)源容易的滲透劑。
分子量超過(guò)大約5000道爾頓的肽可能存在過(guò)敏問(wèn)題，對(duì)于注射到體內(nèi)的產(chǎn)品這種問(wèn)題尤其不能接受。
本發(fā)明的這種類型的肽混合物還可與任何適合用作腹膜滲析液的滲透平衡水溶液結(jié)合。為了達(dá)到本發(fā)明的有效的滲透平衡目的，有用的滲析液必須包含其濃度足以使水和不需要的代謝產(chǎn)物通過(guò)腹膜擴(kuò)散的電解質(zhì)。例如通常的溶液包含一定量的鈉、氯化物、乳酸鹽、鎂和鈣。典型的滲析液的濃度見下表，沒(méi)有指出滲透劑的量。在葡萄糖溶液中，一般加入大約1.5至4.25％的葡萄糖一水合物。應(yīng)該理解這只代表可能溶液的一個(gè)例子，這種溶液模式的變化對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。滲析液中肽混合物的比例可以變化，但通常占滲析液重的大約l至15％的范圍內(nèi)。任何情況下，所用的肽量必需和支持電解質(zhì)一道足以提供大約300至大約500mOsm/l的滲透勢(shì)(正常血清的滲透勢(shì)為280mOsm/l)。滲析液的施用以通常用于腹膜滲析的方式完成。在“腹膜滲析”(K.Nolph編輯，MartinusNighoff出版社，1981)中描述了腹膜滲析的例證性方式。任何個(gè)別患者所需的特殊治療很容易由患者的醫(yī)生確定。
典型的腹膜滲析溶液的成分(meq/l)鈉 132.0鈣 3.5鎂 0.5氯化物 96.0乳酸鹽陰離子40.0從國(guó)際專利申請(qǐng)WO 87/01286、相應(yīng)的EP專利說(shuō)明書270 545、美國(guó)專利說(shuō)明書4 906 616、丹麥專利說(shuō)明書165 734中已知如何通過(guò)奶制品的酶促水解產(chǎn)生滲析液。在這些奶制品中，提到了乳清組分，但是也提到了這種組分的不利之處化學(xué)成分相當(dāng)不明確；含有大量的不易除去的殘留蛋白質(zhì)，因而，就有可能使水解不能再現(xiàn)，并且使水解產(chǎn)物污染。因此，使用β-乳球蛋白和α-乳清蛋白，特別是酪蛋白組分是理想的。在酪蛋白酸鈉的水溶液中完成所說(shuō)的酶促水解。水解后，通過(guò)濾菌器進(jìn)行過(guò)濾，將產(chǎn)物調(diào)節(jié)到所需的滲透勢(shì)，通過(guò)加入鹽調(diào)節(jié)pH。
然而，酪蛋白是不太適宜的，這是因?yàn)樗母吡缀坎贿m于患腎疾病的患者。
由EP專利說(shuō)明書218 900、相應(yīng)的丹麥專利書168 692和168 080、美國(guó)專利說(shuō)明書5 039 609(前文已經(jīng)提到)已知具有大約300-2000道爾頓分子量的肽混合物完全適宜用作與腹膜滲析有關(guān)的滲透活性劑。這些參考文獻(xiàn)也公開了經(jīng)酶促水解、之后是滲析和反滲透由優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生這種混合物的方法。使用乳清蛋白作為所說(shuō)的蛋白質(zhì)。此過(guò)程是相當(dāng)麻煩的，同時(shí)需要特殊的設(shè)備，并且改變其組分是不可能的。這一點(diǎn)對(duì)含有氮的低分子量物質(zhì)、乳糖和礦物質(zhì)(特別是鋁)是十分重要的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)此過(guò)程不可能除去這些組分(一旦滲析液中包含這些組分)。
另外，WO 94/14468公開了含有肽和葡萄糖的滲析液。但沒(méi)有公開任何產(chǎn)生這些肽的特殊方法。
美國(guó)專利說(shuō)明書4 427 658公開了特別適用于營(yíng)養(yǎng)目的的乳清蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物。這種水解充分，因此游離氨基酸的含量很高?？梢院卸嘀?5％游離氨基酸。通常這是不理想的，對(duì)于需要濃度低于5％的滲析尤其不理想。所說(shuō)的水解產(chǎn)物是通過(guò)使用蛋白水解酶(例如胰酶)的水解產(chǎn)生的，水解持續(xù)到使用12％的三氯乙酸不能沉淀氮時(shí)。
國(guó)際專利申請(qǐng)WO 92/21248敘述了一種方法，這種方法通過(guò)使用蛋白含量至少為65％(以干物質(zhì)計(jì)算)的乳清蛋白產(chǎn)品作為起始材料、非pH-穩(wěn)定水解、然后進(jìn)行超濾和微量過(guò)濾生產(chǎn)用于營(yíng)養(yǎng)目的的乳清蛋白水解產(chǎn)物。此方法提供了味覺(jué)良好且感官上可接受的高產(chǎn)量產(chǎn)品。然而，對(duì)于滲析產(chǎn)品該產(chǎn)品的礦物質(zhì)含量太高。
現(xiàn)在已經(jīng)能夠生產(chǎn)適于滲析、胃腸外給藥和其它目的的肽制劑，這種肽制劑能根據(jù)需要具有較適宜的分子量、氮和礦物質(zhì)含量。這可以通過(guò)一種特別好的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，這種方法簡(jiǎn)便易行而且可更經(jīng)濟(jì)地控制制劑的組成。所說(shuō)的方法能借助于容易得到的設(shè)備來(lái)完成。
按照本發(fā)明的用于生產(chǎn)適用于腹膜滲析和/或胃腸外給藥和其它目的的肽混合物(這種肽混合物的分子量在200-2000道爾頓、具有較低的礦物質(zhì)含量)的方法是這樣一種方法，即通過(guò)這種方法在水解條件下處理水溶液中的蛋白質(zhì)，這種方法的特征在于a)水解，直到滲透勢(shì)增加到120-250mOsm/kg H2O，這種測(cè)定是在8％蛋白質(zhì)溶液中完成的；b)微量過(guò)濾、離心或者層析分離，以便除去不需要的高分子物質(zhì)；c)將步驟(b)中的滲透物進(jìn)行超濾，或者通過(guò)色譜方法進(jìn)行處理以便分離所需的肽；d)將步驟(c)中的滲透物進(jìn)行納米過(guò)濾，或者通過(guò)色譜方法進(jìn)行處理；e)從納米過(guò)濾物中收集滲余物，使之盡可能冷卻；f)首先將步驟(e)滲余物的pH調(diào)節(jié)到適于電滲析，之后對(duì)其進(jìn)行電滲析；g)可以將獲得的產(chǎn)物進(jìn)行或者不進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾；h)此后，如果需要，干燥無(wú)菌產(chǎn)物。
通過(guò)本發(fā)明的這種方法可能生產(chǎn)分子量為200至2000道爾頓，優(yōu)選地400至1500道爾頓，特別是少于1000道爾頓的肽混合物，這種肽混合物是所需要的滲析成分。通過(guò)本發(fā)明的方法也可能生產(chǎn)礦物質(zhì)含量極低的肽混合物。
磷含量低于0.01％，鋁含量低于0.5ppm，鈉含量低于0.6％，氯化物含量低于0.7％，鉀含量低于0.02％，鎂含量低于0.01％。
乳清蛋白是非常合適的起始材料蛋白。尤其是乳清蛋白的濃縮物。特別理想的乳清蛋白濃縮物是以商標(biāo)BIPROR出售的產(chǎn)品。其包含90％蛋白質(zhì)，極少量的脂肪、乳糖和礦物質(zhì)。乳清蛋白具有高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，如與大豆分離物和酪蛋白相比具有較高的TD(實(shí)際的可消化性)、BV(生物價(jià)值)、NPU(凈蛋白質(zhì)利用)、PER(蛋白質(zhì)效率比)，這些值的大小和整個(gè)蛋(蛋白+蛋黃)的值相同。
在本發(fā)明的方法產(chǎn)生的肽混合物中有大約50％的肽由必需的氨基酸組成。因而，這種肽混合物也完全適合于與碳水化合物、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等等進(jìn)行恰當(dāng)?shù)幕旌希M(jìn)行胃腸外和胃腸周圍給藥。在本發(fā)明中參考了食品科學(xué)的百科全書，食品技術(shù)和營(yíng)養(yǎng)，3420-3422頁(yè)，″腸胃外營(yíng)養(yǎng)″；營(yíng)養(yǎng)和飲食療法的基本原則，1994，Mosby，第18章，進(jìn)食方法“腸內(nèi)和腸外營(yíng)養(yǎng)”。
然而，使用其它蛋白(如酪蛋白和大豆蛋白)作為起始材料也是可能的，但是，正如所提到的，它們不如以乳清蛋白作為起始材料有利。
原則上，可以使用酸或堿的水解，但是通過(guò)酶促水解可以獲得更好的產(chǎn)量。酸或堿水解還可以導(dǎo)致更無(wú)法控制的過(guò)程，使組分發(fā)生變化，并且通過(guò)這一過(guò)程，一些氨基酸(如亮氨酸、纈氨酸和/或異亮氨酸)甚至受到破壞。因此通常優(yōu)選使用酶促水解。
有用的酶包括如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰酶。特別是Novo Nordisk A/S的酶產(chǎn)品Alcalase和Neutrase證明是較為合適的。
根據(jù)酶的選擇和起始材料，可以進(jìn)行在水解前溶解在水中的起始材料的熱處理，這樣可以打開蛋白質(zhì)，增加產(chǎn)量和/或者減少處理時(shí)間。如果進(jìn)行熱處理，對(duì)于乳清蛋白在大約80-90℃下處理1-3分鐘通常是合適的。使用Alcalase和Neutrase的酶促水解在30-65℃，優(yōu)選的是52-53℃下進(jìn)行，但是水解的溫度當(dāng)然取決于這些酶或所使用的其它酶。
通過(guò)測(cè)量滲透勢(shì)的增加或者測(cè)定氨基氮或者通過(guò)使用堿滴定率來(lái)監(jiān)測(cè)水解程度。在水解過(guò)程中依賴于所使用的酶，pH值可以不變或者改變。當(dāng)使用Alcalase和Neutrase時(shí)，pH值經(jīng)常在8.5和6.0之間變化。
從水解混合物中(例如通過(guò)微量過(guò)濾、離心或者層析方法)分離非水解蛋白的水解混合物的成分、集合物和脂肪成分，目的是從原來(lái)的水解混合物中分離出所說(shuō)的肽。
通過(guò)對(duì)滲余物進(jìn)行膜滲濾，在滲析物中獲得的肽產(chǎn)量增加。在高分離能力下進(jìn)行此步驟，這樣可以從所說(shuō)的肽(所說(shuō)的滲析物)中除去大多數(shù)高分子物質(zhì)。為了從所說(shuō)的滲析物中除去余下的高分子物質(zhì)，進(jìn)行超濾，或者對(duì)滲析物進(jìn)行色譜純化。這些步驟在明顯低于在先的微量過(guò)濾的分離能力下進(jìn)行，可以確保從所說(shuō)的肽混合物中除去所有的高分子物質(zhì)。為了除去水分、含氮的低分子物質(zhì)和鹽，通過(guò)納米過(guò)濾或者層析方法分離所說(shuō)的肽混合物。因此，將所得的肽混合物濃縮成干物質(zhì)，同時(shí)降低了礦物質(zhì)和含氮物質(zhì)的含量。
在電滲析步驟中，在pH4-5，特別大約4.5時(shí)能較好地除去礦物質(zhì)。通過(guò)測(cè)量傳導(dǎo)率(其在除去礦物質(zhì)的步驟中降低)很容易監(jiān)測(cè)電滲析。在用于腹膜滲析、腸胃外和腸胃外圍給藥的產(chǎn)品中礦物質(zhì)的這種去除是明顯的。
一般地，在每個(gè)步驟中調(diào)節(jié)pH和溫度以便達(dá)到酶和分離的理想的操作條件。
另外，引入了消毒步驟以除去細(xì)菌來(lái)獲得具有高細(xì)菌學(xué)質(zhì)量的最終產(chǎn)品。
按照本發(fā)明的方法與已知的技術(shù)相比具有很大的優(yōu)點(diǎn)。特別是那些分離步驟，可以提高在適當(dāng)?shù)奈恢酶深A(yù)此過(guò)程和控制此過(guò)程的可能性，結(jié)果得到了所需要的產(chǎn)品組分。此外，這是一種能高產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)有利的方法。
如以上提及，能夠利用普通的設(shè)備進(jìn)行本發(fā)明，即用于乳制品業(yè)的設(shè)備，有關(guān)EP 218 900的已知方法與此不同，該已知方法使用了特殊構(gòu)建的儀器。當(dāng)然這意味著與已知的技術(shù)相比，僅僅由于這一原因按照本發(fā)明的方法操作起來(lái)更經(jīng)濟(jì)。
在上述的丹麥專利168 080(參見第14頁(yè)，第27ff行)認(rèn)為超濾的嚴(yán)重缺點(diǎn)是不能獲得可靠的分離。利用本發(fā)明的方法通過(guò)使用特殊的超濾膜(UF-膜)已經(jīng)解決了這一問(wèn)題，這樣分子量大大超過(guò)2000道爾頓的分子僅以最小限度和微乎其微的量存在于通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的肽混合物中。自1984年始，這種UF-膜可以買到。
此外，如上所述，在本發(fā)明的方法中優(yōu)選使用特殊的起始材料，即蛋白質(zhì)含量多達(dá)90％且脂肪、乳糖和礦物質(zhì)的含量十分低的乳清蛋白。通常脂肪的含量為大約0.5％，乳糖的含量也為0.5％，而礦物質(zhì)的含量為1.6％。因?yàn)橹?、乳糖和礦物質(zhì)對(duì)上述的應(yīng)用是多余的，所以這樣可以更容易地獲得足夠純的產(chǎn)品。此外細(xì)菌的含量也非常低。
通過(guò)下列實(shí)施例將更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
實(shí)施例把20.0kg的乳清蛋白分離物粉劑溶解在210升軟化水中。將此溶液在85℃下熱處理2分鐘，冷卻到大約50℃，然后轉(zhuǎn)移到水解罐中。加入0.2％的酶產(chǎn)品ALCALASE-2.4L和0.1％的酶制劑NEUTRASE-0.5L。所用的兩種酶是Novo-Nordisk A/S出售的。大約在50℃下水解15小時(shí)后，滲透勢(shì)的增加為166 mOsm/kg H2O。將此產(chǎn)物加熱到60℃，然后在Sociétédes Céramique技術(shù)公司(法國(guó))的0.2μm膜上進(jìn)行微量過(guò)濾，微量過(guò)濾在大約60℃下進(jìn)行，使用大約200升的軟化水進(jìn)行膜滲濾。平均流速為大約150l/(m2*小時(shí))。收集滲析物并在85℃下熱處理3分鐘，然后冷卻到50℃。50℃下在脫鹽系統(tǒng)公司(美國(guó)，加利福尼亞，Escondido)的Desal G50型超濾膜上對(duì)滲析物進(jìn)行超濾。此膜具有15000的截?cái)?。超濾過(guò)程中的平均流速為5.8l/(m2*小時(shí))。將滲析物在70℃下熱處理2分鐘，冷卻到60℃，然后在PCI膜系統(tǒng)有限公司(英國(guó))的PCI AFC 30型膜上進(jìn)行納米過(guò)濾。平均流速為240l/(m2*小時(shí))。將納米過(guò)濾的滲余物在70℃下熱處理2分鐘，冷卻到5℃，此后使用稀釋的鹽酸將pH調(diào)節(jié)到4.5。在大約10℃下將所得的產(chǎn)物進(jìn)行電滲析，此時(shí)的電壓為50V左右，在此期間電流從6.5A降低到0.5A。因此傳導(dǎo)率減少到0.8mS。電滲析膜是Eurodia公司(法國(guó))的NEOSEPTA-AMX和-CMX型膜。之后，收集電滲析滲余物，70℃下熱處理2分鐘，冷卻到60℃，然后60℃下在Société des Céramique技術(shù)公司(法國(guó))的0.05μm型濾器上進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。平均流速為2300l/(m2*小時(shí))。將收集到的無(wú)菌過(guò)濾產(chǎn)物在Niro Atomizer公司(丹麥)的Niro Minor型噴射塔上進(jìn)行干燥，獲得9.0kg粉末形式的肽混合物。
分析所獲得的產(chǎn)物，結(jié)果如下pH 4.75蛋白質(zhì)含量重量比90.5％(N％*6.38)干物質(zhì)含量重量比96.8％脂肪含量 重量比＜0.02％乳糖含量 重量比＜0.1％灰分含量 重量比0.17％磷含量重量比0.007％鈉含量重量比0.012％鉀含量重量比0.006％氯化物含量重量比＜0.05％鈣含量重量比0.008％鋁含量 稱重后＜0.5ppmMw*)620Mn*)410分子量＜2000D*) 99.24分子量＜1000D*) 86.46總細(xì)菌含量 每克＜1*)使用Waters高壓泵(510)、注射器和檢測(cè)器(214nm)確定分子量。所用的柱是在環(huán)境溫度下連接并操作的3×TSK G2000 SWXL系列。流動(dòng)相由0.05M磷酸鹽緩沖液/0.5M氯化銨溶液(含有0.1％TFA和25％的乙腈)組成。此柱用幾種分子量不同的肽標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)。通過(guò)最小平方法計(jì)算最適合的第三等級(jí)polynomium。所得的曲線用作校準(zhǔn)曲線。
將樣品以5mg/ml的濃度溶解在流動(dòng)相中。注射20微升的樣品。記錄檢測(cè)器對(duì)洗脫體積的反應(yīng)。將色譜分割成時(shí)間段(和洗脫體積段)，每一段的特征在于在此時(shí)間間隔內(nèi)的洗脫體積和色譜圖的面積。
按照下列方程確定分別稱重和計(jì)數(shù)后的分子量Mw-=Σi(Ai=Mwj)ΣiAi]]>Mn-=ΣiAjΣi(Ai/Mwj),]]>其中Mn是稱重后的平均分子量，Mn是計(jì)數(shù)后的平均分子量，Ai是每一段的色譜面積，根據(jù)在每一時(shí)間間隔內(nèi)積累的檢測(cè)器反應(yīng)而測(cè)量的。Mw，i是每一段的相應(yīng)的分子量。通過(guò)使用整個(gè)時(shí)間間隔的平均洗脫體積經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算該值。
氨基酸分析，百分重酪氨酸3.70色氨酸1.90胱氨酸2.62甲硫氨酸 2.05天冬氨酸 10.9蘇氨酸4.53絲氨酸3.95谷氨酸17.1脯氨酸4.43甘氨酸1.70丙氨酸5.69纈氨酸5.14異亮氨酸 5.38亮氨酸12.0苯丙氨酸 3.53組氨酸2.33賴氨酸10.3精氨酸1.9權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)適于在腹膜滲析和/或者胃腸外給藥中使用和在其它應(yīng)用中使用的肽混合物的方法，這種混合物的肽分子量在200至2000道爾頓之間，礦物質(zhì)含量低；可以通過(guò)這種方法在水溶液中于水解條件下處理蛋白質(zhì)，這種方法的特征在于其包括下列幾個(gè)步驟a)水解，直到滲透勢(shì)增加到120-250mOsm/kg H2O，這種測(cè)定是在8％蛋白質(zhì)溶液中完成的；b)微量過(guò)濾、離心或者層析分離，以便除去不需要的高分子物質(zhì)；c)將步驟(b)中的滲透物進(jìn)行超濾，或者通過(guò)色譜方法進(jìn)行處理以便分離所需的肽；d)將步驟(c)中的滲透物進(jìn)行納米過(guò)濾，或者通過(guò)色譜方法進(jìn)行處理；e)從納米過(guò)濾物中收集滲余物，使之盡可能冷卻；f)首先將步驟(e)滲余物的pH調(diào)節(jié)到適于電滲析，之后對(duì)其進(jìn)行電滲析；g)可以將獲得的產(chǎn)物進(jìn)行或者不進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾；h)此后，如果需要，干燥無(wú)菌產(chǎn)物。
2.按照權(quán)利要求1的生產(chǎn)礦物質(zhì)含量較低的肽混合物的方法，所說(shuō)的礦物質(zhì)組成如下磷含量低于0.01％，鋁含量低于0.5ppm，鈉含量低于0.6％，氯化物含量低于0.7％，鉀含量低于0.02％，鎂含量低于0.01％這種方法的特征在于根據(jù)所需要的礦物質(zhì)含量選擇過(guò)濾條件和其它條件。
3.按照權(quán)利要求1的生產(chǎn)分子量在400至1500道爾頓的肽混合物的方法，這種方法的特征在于根據(jù)所需要的分子量選擇水解和過(guò)濾條件以及其它條件。
4.按照權(quán)利要求1的生產(chǎn)分子量高至1000道爾頓的肽混合物的方法，這種方法的特征在于根據(jù)所需要的分子量選擇水解和過(guò)濾條件以及其它條件。
5.按照權(quán)利要求1的方法，這種方法的特征在于用作起始材料的蛋白物質(zhì)是乳清產(chǎn)品，具體地說(shuō)是乳清蛋白濃縮物。
6.按照權(quán)利要求5的方法，這種方法的特征在于用作起始材料的蛋白物質(zhì)是以商標(biāo)BIPROR出售的絕緣型乳清蛋白或者相應(yīng)的產(chǎn)品。
7.按照權(quán)利要求1的方法，這種方法的特征在于所說(shuō)的水解是酶促水解。
8.按照權(quán)利要求8的方法，這種方法的特征在于使用Alcalase和Neutrase或者相應(yīng)酶產(chǎn)品進(jìn)行所說(shuō)的酶促水解。
9.按照權(quán)利要求1的方法，這種方法的特征在于在各個(gè)步驟之間根據(jù)需要進(jìn)行熱處理和/或冷卻。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種工業(yè)上生產(chǎn)肽制劑的方法,這種肽制劑在水解蛋白物質(zhì)(優(yōu)選的是以乳清為基礎(chǔ))時(shí)具有特定的性質(zhì)。此方法包括幾個(gè)步驟,這些步驟使得能夠容易地控制此方法,以便獲得,例如由于礦物質(zhì)含量較低,適于腹膜滲析和胃腸外給藥的產(chǎn)品。此方法給出高產(chǎn)率。
文檔編號(hào)A23J3/34GK1192656SQ96196263
公開日1998年9月9日 申請(qǐng)日期1996年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月30日
發(fā)明者D·E·W·查特頓, G·比爾特森, K·阿比爾特森, B·E·皮德森 申請(qǐng)人:Md食品公司