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利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法及其應(yīng)用與流程

文檔序號(hào):12412170閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,其特征在于,包括以下步驟:

1)取處于對(duì)數(shù)生長期的含有外源基因的農(nóng)桿菌,重懸于第一培養(yǎng)基中,得到轉(zhuǎn)化菌液;

2)取成熟的花生種子,萌發(fā)0-5天,然后將子葉縱切為兩半,再切掉胚軸頂端的胚芽,得到轉(zhuǎn)化受體;

3)將所述轉(zhuǎn)化受體浸泡在轉(zhuǎn)化菌液中,侵染20-50分鐘,接著取出轉(zhuǎn)化受體,吸干表面的液體,再置于吸水紙上,于22±2℃暗培養(yǎng)3-4天;培養(yǎng)過程中,向吸水紙上噴施液體營養(yǎng)液,使得吸水紙保持濕潤;所述液體營養(yǎng)液為含有1-10mg/L的6-芐氨基腺嘌呤的MS培養(yǎng)基;

4)將經(jīng)步驟3)處理的轉(zhuǎn)化受體沖洗干凈,利用第二培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng),得到花生幼苗;所述第二培養(yǎng)基為含有1-10mg/L的6-芐氨基腺嘌呤和0.2-0.4vol.%的抗性篩選物質(zhì)的MS培養(yǎng)基;所述抗性篩選物質(zhì)用于篩選含外源基因的花生;

5)將所述花生幼苗繼續(xù)培養(yǎng)至得到花生植株,對(duì)花生植株進(jìn)行鑒定,即可確定轉(zhuǎn)基因植株。

2.如權(quán)利要求1所述的利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,其特征在于,在步驟1)中,所述的外源基因?yàn)殡p丙酰磷抗性基因;在步驟4)中,所述抗性篩選物質(zhì)為草胺膦。

3.如權(quán)利要求1所述的利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,其特征在于,在步驟1)中,采用YEP液體培養(yǎng)基,于28℃下將含有外源基因的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600為0.5-0.8,即得所述處于對(duì)數(shù)生長期的含有外源基因的農(nóng)桿菌。

4.如權(quán)利要求1所述的利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,其特征在于,在步驟1)中,所述第一培養(yǎng)基為含100-200μM的乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基。

5.如權(quán)利要求1所述的利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,其特征在于,在步驟1)中,將含有外源基因的農(nóng)桿菌接種于含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中,28℃搖床過夜,再按體積百分比1%的接種量轉(zhuǎn)接入50-800mL含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2-4小時(shí)至OD600為0.6,收集菌體;然后用50-800mL含100-200μM的乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基重新懸浮沉淀,將菌液轉(zhuǎn)入50-800mL含100-200μM的乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基中,于28℃搖床上培養(yǎng)至OD600到0.6,即得轉(zhuǎn)化菌液。

6.如權(quán)利要求1所述的利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,其特征在于,在步驟2)中,所述成熟的花生種子為剛好萌發(fā)、子葉分離的花生種子。

7.如權(quán)利要求1所述的利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,其特征在于,在步驟3)中,將所述轉(zhuǎn)化受體浸泡在轉(zhuǎn)化菌液中,使得轉(zhuǎn)化菌液剛好浸沒轉(zhuǎn)化受體。

8.如權(quán)利要求1所述的利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,其特征在于,在步驟3)中,所述侵染的時(shí)間為30-50min。

9.如權(quán)利要求1所述的利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,其特征在于,在步驟5)中,花生幼苗在培養(yǎng)成花生植株的過程中,進(jìn)行了煉苗、移栽及除草劑篩選的處理。

10.如權(quán)利要求1-9所述的利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法在制備轉(zhuǎn)基因花生中的應(yīng)用。

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