本發(fā)明涉及藥物制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤在最初發(fā)生時(shí)多為器官局限性疾病，但最終幾乎都會(huì)通過(guò)血流傳播到遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移，這種遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。而循環(huán)腫瘤細(xì)胞存在于患者外周血中，是造成腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的必要前提。循環(huán)腫瘤細(xì)胞主要是指自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，且主要通過(guò)以下步驟完成血行性轉(zhuǎn)移：從原發(fā)性腫瘤上分離；內(nèi)滲進(jìn)入血管系統(tǒng)；在體循環(huán)中存活；外滲進(jìn)入靶組織進(jìn)而形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。因此，殺傷循環(huán)腫瘤細(xì)胞能阻斷或延緩腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程。癌癥患者體內(nèi)每天大約有數(shù)百萬(wàn)個(gè)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)性的腫瘤部位脫落，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，但是大部分因缺乏變形能力不能順利通過(guò)血管、缺乏形成癌栓能力或受到機(jī)體的免疫系統(tǒng)攻擊而在短期內(nèi)死亡，只有很少一部分具有高活力及高轉(zhuǎn)移潛能的癌細(xì)胞能夠存活下來(lái)，進(jìn)而在遠(yuǎn)處臟器中定植。研究表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血液中紅細(xì)胞或白細(xì)胞的比例接近于1：109或1：106，相當(dāng)于“稻草堆中的針”。另外，循環(huán)腫瘤細(xì)胞所處的生物環(huán)境明顯不同于實(shí)體瘤。當(dāng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞循環(huán)在不同管路中(動(dòng)脈、靜脈或毛細(xì)血管)時(shí)，會(huì)受到一個(gè)較大范圍的流體剪切力，而實(shí)體瘤內(nèi)的癌細(xì)胞承受的是因僵硬的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的組織液靜壓。中國(guó)發(fā)明專利cn106377772a公開了一種用于清除循環(huán)腫瘤細(xì)胞的免疫吸附劑，該吸附劑以天然高分子為載體，以循環(huán)腫瘤細(xì)胞特異性抗原的單克隆或多克隆抗體為培基，能特異性地清除血液中的腫瘤細(xì)胞。但是，該吸附劑不含抗腫瘤癌或凋亡配體，無(wú)法使循環(huán)腫瘤細(xì)胞凋亡，只能用于體外全血灌流，而目前該方法還不成熟，在臨床使用方面仍面臨較多挑戰(zhàn)。中國(guó)發(fā)明專利cn105125510a公開了一種抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑，該制劑包含二氧化硅納米粒子、米非司酮和上皮細(xì)胞粘附分子抗體(anti-epcam)，能靶向識(shí)別并遏制循環(huán)腫瘤細(xì)胞的活性。但是，單克隆穩(wěn)定性差、價(jià)格昂貴而且難以大批量制備。中國(guó)發(fā)明專利cn104535772a公開了一種her2高表達(dá)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用，該發(fā)明提出了一種利用多肽對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行特異性識(shí)別ctcs的方法。但是該制劑進(jìn)入機(jī)體體循環(huán)后，易被機(jī)體的免疫系統(tǒng)，尤其是巨噬細(xì)胞所識(shí)別，而被快速清除出體外，難以與循環(huán)腫瘤細(xì)胞結(jié)接觸，不能有效發(fā)揮多肽特異性識(shí)別的效果。因此目前亟需一種新型手段，提高藥物載體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，并主動(dòng)靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞，以改善循環(huán)腫瘤細(xì)胞的治療效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒及其制備和應(yīng)用，本發(fā)明的靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒(slns)，能延長(zhǎng)載體血液循環(huán)時(shí)間，提高載體對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的靶向性，抑制巨噬細(xì)胞的吞噬，并通過(guò)化學(xué)藥物引起循環(huán)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而干擾腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程，顯著遏制腫瘤轉(zhuǎn)移。在一方面，本發(fā)明提供了一種靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒，納米粒的內(nèi)核包括化學(xué)藥物、固體脂質(zhì)材料和乳化劑，納米粒的表面修飾有抗巨噬細(xì)胞吞噬多肽(pepcd47)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞靶向多肽(pep10)。進(jìn)一步地，化學(xué)藥物為多西他賽、阿霉素和紫杉醇中的一種或幾種。進(jìn)一步地，固體脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯和甘油棕櫚酸硬脂酸酯中的一種或幾種。進(jìn)一步地，乳化劑為泊洛沙姆、吐溫-80、聚乙烯醇和十二烷基磺酸鈉中的一種或幾種。進(jìn)一步地，抗巨噬細(xì)胞吞噬多肽(pepcd47)的氨基酸序列如seqidno.1所示。進(jìn)一步地，循環(huán)腫瘤細(xì)胞靶向多肽(pep10)的氨基酸序列如seqidno.2所示。在另一方面，本發(fā)明還提供了一種上述靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒的制備方法，包括以下步驟：(1)將抗巨噬細(xì)胞吞噬多肽和循環(huán)腫瘤細(xì)胞靶向多肽溶于第一有機(jī)溶劑，然后與溶有化學(xué)藥物的第二有機(jī)溶劑混合，再與熔融的固體脂質(zhì)材料混合，得到油相；(2)將乳化劑在水中分散均勻，得到水相；(3)將步驟(1)得到的油相與步驟(2)得到的水相中混勻后，將第一有機(jī)溶劑和第二有機(jī)溶劑除盡，得到靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒。進(jìn)一步地，在步驟(1)中，第一有機(jī)溶劑為二甲亞砜、乙腈和三氯甲烷的一種或幾種，第二有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇和二氯甲烷的一種或幾種。進(jìn)一步地，在步驟(1)中，第二有機(jī)溶劑中還溶有大豆磷脂。大豆磷脂起到表面活性劑的作用，能夠使化學(xué)藥物在第二有機(jī)溶劑中分散的更加均勻。進(jìn)一步地，在步驟(1)中，抗巨噬細(xì)胞吞噬多肽和循環(huán)腫瘤細(xì)胞靶向多肽中均含有硬脂酸。硬脂酸的作用是增加多肽的親脂性。進(jìn)一步地，在步驟(1)中，固體脂質(zhì)材料在60～80℃下的水浴條件下熔融。進(jìn)一步地，在步驟(1)中，抗巨噬細(xì)胞吞噬多肽(pepcd47)的氨基酸序列如seqidno.1所示。進(jìn)一步地，在步驟(1)中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞靶向多肽(pep10)的氨基酸序列如seqidno.2所示。進(jìn)一步地，在步驟(1)中，化學(xué)藥物為多西他賽、阿霉素和紫杉醇中的一種或幾種。進(jìn)一步地，在步驟(1)中，固體脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯和甘油棕櫚酸硬脂酸酯中的一種或幾種。進(jìn)一步地，在步驟(2)中，在60～80℃的水浴條件下分散。進(jìn)一步地，在步驟(1)中，乳化劑為泊洛沙姆、吐溫-80、聚乙烯醇和十二烷基磺酸鈉中的一種或幾種。在又一方面，本發(fā)明還提供了上述靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒在制備治療循環(huán)腫瘤細(xì)胞制劑中的應(yīng)用。借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)利用cd47-sirpɑ通路在逃避巨噬細(xì)胞吞噬中的作用，選取cd47中有效氨基酸序列通過(guò)化學(xué)合成得到功能性多肽pepcd47，并將其修飾于靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒(slns)表面，克服傳統(tǒng)納米載體peg化后多次注射時(shí)易引起免疫排斥的難點(diǎn)，同時(shí)slns載體可延長(zhǎng)體循環(huán)時(shí)間，提高藥物療效。(2)將pep10修飾于slns表面后，借助于pep10與循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面的上皮細(xì)胞粘附分子(epcam)的特異性結(jié)合，將載體靶向集中于循環(huán)腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向治療，同時(shí)解決單克隆抗體穩(wěn)定性和重現(xiàn)性差，價(jià)格昂貴，難以大量制備等缺點(diǎn)。(3)將抗癌藥物即化學(xué)藥物包裹于slns內(nèi)核中，遞送至循環(huán)腫瘤細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮殺傷循環(huán)腫瘤細(xì)胞，防止癌癥轉(zhuǎn)移的效果。同時(shí)本發(fā)明的slns穩(wěn)定性高、生理相容性好，可增加化學(xué)藥物穩(wěn)定性，可使藥物穩(wěn)定緩慢釋放，且提高藥物生物利用度，降低機(jī)體毒副作用。(4)制備工藝簡(jiǎn)單，包封率高，便于工業(yè)化生產(chǎn)；所制得的靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒的物理性質(zhì)等方面符合循環(huán)腫瘤細(xì)胞治療的需要。上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說(shuō)明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。附圖說(shuō)明圖1圖示了流式定量分析巨噬細(xì)胞raw264.7對(duì)slns的攝取情況；圖2圖示了流式定量分析乳腺癌細(xì)胞mcf-7對(duì)slns的攝取情況；圖3圖示了slns在裸鼠血液中對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的靶向性的熒光測(cè)試結(jié)果；圖4為slns在裸鼠體內(nèi)血藥-濃度曲線測(cè)試結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。除非另外指明，以下實(shí)施例中所涉及到的“dtx”均表示“多西他賽”；“dox”均表示“阿霉素”；“taxol”均代表“紫杉醇”；“sa”均表示“硬脂酸”(上海泰坦科技股份有限公司)；“c6”均表示“香豆素6”；“peg”均表示“聚乙二醇”。實(shí)施例1dtx-slns-pepcd47的制備本實(shí)施例提供了作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的slns的制備方法，具體如下：稱取3mgdtx及20mg大豆磷脂置于西林瓶中，加入2ml甲醇溶解。稱取1mgsa-pepcd47溶于微量二甲亞砜中，隨后與上述甲醇溶液混合，得到混合溶液。同時(shí)，稱取60mg單硬脂酸甘油酯于70℃的水浴下熔融，得到熔融液，將上述混合溶液與熔融液混合得到均一的油相，隨后將含有乳化劑的水相(提前預(yù)熱至70℃)快速加至油相中，經(jīng)分散后，置于超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲，攪拌5h揮盡有機(jī)溶劑，即得dtx-slns-pepcd47。其中，乳化劑為吐溫-80。本實(shí)施例所制備的slns的粒徑、電位、載藥量和包封率如表1所示。實(shí)施例2dtx-slns-pep10的制備本實(shí)施例提供了作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的slns的制備方法，具體如下：稱取3mgdtx及20mg大豆磷脂置于西林瓶中，加入2ml甲醇溶解。稱取3mgsa-pep10溶于微量二甲亞砜中，隨后與上述甲醇溶液混合，得到混合溶液。同時(shí)，稱取60mg單硬脂酸甘油酯于70℃的水浴下熔融，得到熔融液，將上述混合溶液與熔融液混合得到均一的油相，隨后將含有乳化劑的水相(提前預(yù)熱至70℃)快速加至油相中，經(jīng)分散后，置于超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲，攪拌5h揮盡有機(jī)溶劑，即得dtx-slns-pep10。其中，乳化劑為吐溫-80。本實(shí)施例所制備的slns的粒徑、電位、載藥量和包封率如表1所示。實(shí)施例3dtx-slns-pepcd47-pep10的制備本發(fā)明的靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒的制備方法，具體如下：稱取3mgdtx及20mg大豆磷脂置于西林瓶中，加入2ml甲醇溶解。稱取1mgsa-pepcd47與3mgsa-pep10溶于微量二甲亞砜中，隨后與上述甲醇溶液混合，得到混合溶液。同時(shí)，稱取60mg單硬脂酸甘油酯于70℃的水浴下熔融，得到熔融液。將上述混合溶液與熔融液混合，得到均一的油相。將乳化劑在水浴70℃條件下，分散于純化水中，制成水相，其中，乳化劑為吐溫-80。隨后將含有水相(提前預(yù)熱至70℃)快速加至油相中，經(jīng)分散后，置于超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲，攪拌5h揮盡有機(jī)溶劑，即得dtx-slns-pepcd47-pep10。本實(shí)施例所制備的slns的粒徑、電位、載藥量和包封率如表1所示。實(shí)施例4dtx-slns-pepcd47-pep10的制備本發(fā)明的靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒的制備方法，具體如下：稱取3mgdtx及20mg大豆磷脂置于西林瓶中，加入2ml甲醇溶解。稱取1mgsa-pepcd47與3mgsa-pep10溶于微量二甲亞砜中，隨后與上述甲醇溶液混合，得到混合溶液。同時(shí)，稱取60mg單硬脂酸甘油酯于70℃的水浴下熔融，得到熔融液。將上述混合溶液與熔融液混合，得到均一的油相。將乳化劑在水浴70℃條件下，分散于純化水中，制成水相，其中，乳化劑為泊洛沙姆。隨后將含有水相(提前預(yù)熱至70℃)快速加至油相中，經(jīng)分散后，置于超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲，攪拌5h揮盡有機(jī)溶劑，即得dtx-slns-pepcd47-pep10。實(shí)施例5dtx-slns-pepcd47-pep10的制備本發(fā)明的靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒的制備方法，具體如下：稱取3mgdtx及20mg大豆磷脂置于西林瓶中，加入2ml甲醇溶解。稱取1mgsa-pepcd47與3mgsa-pep10溶于微量二甲亞砜中，隨后與上述甲醇溶液混合，得到混合溶液。同時(shí)，稱取60mg單硬脂酸甘油酯于70℃的水浴下熔融，得到熔融液。將上述混合溶液與熔融液混合，得到均一的油相。將乳化劑在水浴70℃條件下，分散于純化水中，制成水相，其中，乳化劑為聚乙烯醇。隨后將含有水相(提前預(yù)熱至70℃)快速加至油相中，經(jīng)分散后，置于超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲，攪拌5h揮盡有機(jī)溶劑，即得dtx-slns-pepcd47-pep10。實(shí)施例6dox-slns-pepcd47-pep10的制備本發(fā)明的靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒的制備方法，具體如下：稱取3mgdox及20mg大豆磷脂置于西林瓶中，加入2ml甲醇溶解。稱取1mgsa-pepcd47與3mgsa-pep10溶于微量二甲亞砜中，隨后與上述甲醇溶液混合，得到混合溶液。同時(shí)，稱取60mg單硬脂酸甘油酯于70℃的水浴下熔融，得到熔融液。將上述混合溶液與熔融液混合，得到均一的油相。將乳化劑在水浴70℃條件下，分散于純化水中，制成水相，其中，乳化劑為吐溫-80。隨后將含有水相(提前預(yù)熱至70℃)快速加至油相中，經(jīng)分散后，置于超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲，攪拌5h揮盡有機(jī)溶劑，即得dox-slns-pepcd47-pep10。。實(shí)施例7taxol-slns-pepcd47-pep10的制備本發(fā)明的靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒的制備方法，具體如下：稱取3mgtaxol及20mg大豆磷脂置于西林瓶中，加入2ml甲醇溶解。稱取1mgsa-pepcd47與3mgsa-pep10溶于微量二甲亞砜中，隨后與上述甲醇溶液混合，得到混合溶液。同時(shí)，稱取60mg單硬脂酸甘油酯于70℃的水浴下熔融，得到熔融液。將上述混合溶液與熔融液混合，得到均一的油相。將乳化劑在水浴70℃條件下，分散于純化水中，制成水相，其中，乳化劑為吐溫-80。隨后將含有水相(提前預(yù)熱至70℃)快速加至油相中，經(jīng)分散后，置于超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲，攪拌5h揮盡有機(jī)溶劑，即得taxol-slns-pepcd47-pep10。實(shí)施例8dtx-slns的制備本實(shí)施例提供了作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的對(duì)比例1的slns的制備方法，具體如下：稱取3mgdtx及20mg大豆磷脂置于西林瓶中，加入2ml甲醇溶解。同時(shí)，稱取60mg單硬脂酸甘油酯于70℃的水浴下熔融，將甲醇溶液與熔融液混合得到均一的油相，隨后將含有乳化劑的水相(提前預(yù)熱至70℃)快速加至油相中，經(jīng)分散后，置于超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲，攪拌5h揮盡有機(jī)溶劑，即得dtx-slns。其中，乳化劑為吐溫-80。本實(shí)施例所制備的slns的粒徑、電位、載藥量和包封率如表1所示。實(shí)施例9dtx-slns-peg2000的制備本實(shí)施例提供了作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的對(duì)比例2的slns的制備方法，具體如下：稱取3mgdtx、1mgsa-peg2000及20mg大豆磷脂s-100置于西林瓶中，加入2ml甲醇溶解，同時(shí)，稱取60mg單硬脂酸甘油酯于70℃的水浴下熔融，將甲醇溶液與熔融液混合得到均一的油相，隨后將含有乳化劑的水相(提前預(yù)熱至70℃)快速加至油相中，經(jīng)分散后，置于超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲，超聲條件為500w，超聲時(shí)間為120s，最后，攪拌5h揮盡有機(jī)溶劑，即得dtx-slns-peg2000。其中，乳化劑為吐溫-80。本實(shí)施例所制備的slns的粒徑、電位、載藥量和包封率如表1所示。實(shí)施例10dtx-slns-peg6000的制備本實(shí)施例提供了作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的對(duì)比例3的slns的制備方法，具體如下：稱取3mgdtx、1mgsa-peg6000及20mg大豆磷脂s-100置于西林瓶中，加入2ml甲醇溶解，同時(shí)，稱取60mg單硬脂酸甘油酯于70℃的水浴下熔融，將甲醇溶液與熔融液混合得到均一的油相，隨后將含有乳化劑的水相(提前預(yù)熱至70℃)快速加至油相中，經(jīng)分散后，置于超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲，超聲條件為500w，超聲時(shí)間為120s，最后，攪拌5h揮盡有機(jī)溶劑，即得dtx-slns-peg6000。其中，乳化劑為吐溫-80。本實(shí)施例所制備的slns的粒徑、電位、載藥量和包封率如表1所示。表1本發(fā)明涉及的slns的物理參數(shù)slns來(lái)源粒徑(nm)電位(mv)包封率(％)載藥量(％)實(shí)施例1163.9-12.8589.893.37實(shí)施例2176.6-11.9090.483.39實(shí)施例3198.4-10.2181.763.07對(duì)比例181.7-6.0086.293.24對(duì)比例2134.2-20.1789.353.29對(duì)比例3166.3-25.5487.853.25實(shí)施例11slns體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(1)抗吞噬實(shí)驗(yàn)以下實(shí)驗(yàn)中所使用的slns分別為實(shí)施例1-3以及8-10中所制備的產(chǎn)物。將小鼠單核巨噬細(xì)胞株raw264.7細(xì)胞進(jìn)行消化后，計(jì)數(shù)后按1×105個(gè)/ml濃度分別鋪于6孔板，待細(xì)胞融合至80-90％后，棄去舊培養(yǎng)基，加入負(fù)載c6的slns。培養(yǎng)1h后，舍棄培養(yǎng)基，加入0.25％胰酶消化，1500rpm離心5min，倒去上清，加入pbs離心洗滌3次，最后細(xì)胞分散于適量的pbs中形成單細(xì)胞混懸液，用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)slns的攝取情況。結(jié)果如圖1所示，圖1表明，實(shí)施例1和實(shí)施例3所制slns表面的pepcd47可與巨噬細(xì)胞的sirpɑ結(jié)合，傳遞抑制吞噬信號(hào)，因此兩者攝取率均在20％左右；實(shí)施例2所制slns無(wú)pepcd47修飾，其攝取率接近85％；對(duì)比例1為空白slns，1h內(nèi)巨噬細(xì)胞raw264.7對(duì)其的攝取率接近100％；對(duì)比例2為peg2000修飾的slns，peg2000能增加slns的親水性，抑制巨噬細(xì)胞的吞噬，因此攝取率約為45％；peg6000親水鏈長(zhǎng)于peg2000，因此經(jīng)peg6000修飾后，巨噬細(xì)胞raw264.7對(duì)對(duì)比例3的攝取率為14％左右。綜上所述，pepcd47與sirpα結(jié)合后抑制巨噬細(xì)胞吞噬的效果強(qiáng)于peg2000，稍弱于peg6000。(2)靶向性實(shí)驗(yàn)以下實(shí)驗(yàn)中所使用的slns分別為實(shí)施例1-3以及實(shí)施例8中所制備的產(chǎn)物。將人乳腺癌細(xì)胞株mcf-7細(xì)胞進(jìn)行消化后，計(jì)數(shù)后按1×105個(gè)/ml濃度分別鋪于6孔板，待細(xì)胞融合至80-90％后，棄去舊培養(yǎng)基，加入負(fù)載c6的slns。培養(yǎng)2h后，舍棄培養(yǎng)基，加入0.25％胰酶消化，1500rpm離心5min，倒去上清，加入pbs離心洗滌3次，最后細(xì)胞分散于適量的pbs中形成單細(xì)胞混懸液，用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)slns的攝取情況。結(jié)果如圖2所示，從圖2中可看出，mcf-7細(xì)胞對(duì)實(shí)施例2和實(shí)施例3所制slns攝取率均在85％左右，明顯高于未經(jīng)pep10修飾的實(shí)施例1(攝取率約40％)及對(duì)比例1(攝取率約42％)，表明pep10可與mcf-7細(xì)胞表面的epcam特異性結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)slns的攝取。實(shí)施例12slns體內(nèi)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例所使用的slns分別為實(shí)施例3和實(shí)施例8中所制備的產(chǎn)物。(1)動(dòng)物模型建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康雌性balb/c裸鼠，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mcf-7細(xì)胞，用生理鹽水將細(xì)胞重懸，密度為5×105個(gè)/ml，用一次性無(wú)菌注射器給裸鼠尾靜脈注射約200μl細(xì)胞懸液，使腫瘤細(xì)胞在裸鼠血液中循環(huán)10min后，即建立起循環(huán)腫瘤細(xì)胞動(dòng)物模型。(2)體內(nèi)靶向性實(shí)驗(yàn)選取成功構(gòu)建動(dòng)物模型的裸鼠9只，隨機(jī)分為三組：生理鹽水組、c6-slns組和c6-slns-pepcd47-pep10組。其中，c6-slns組使用的slns為實(shí)施例8中所制備的產(chǎn)物，c6-slns-pepcd47-pep10組使用的slns為實(shí)施例3中所制備的產(chǎn)物。按dtx給藥量為8mg/kg進(jìn)行尾靜脈注射。在給藥后2h后，將裸鼠從尾巴處側(cè)切，收集血液；將10倍血液體積的紅細(xì)胞裂解液加入血液樣品中，室溫裂解5min后，500g離心5min，離心棄去上清。加入5倍細(xì)胞沉淀體積的pbs，重懸沉淀，500g離心5min，棄去上清，重復(fù)兩次該步驟。用pbs充分重懸后，置于6孔板內(nèi)，用激光共聚焦顯微鏡觀察slns在血液中對(duì)ctcs的靶向性。使用激光共聚焦顯微鏡觀察slns在裸鼠血液中對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的靶向性，結(jié)果如圖3所示，圖3a和3d中，經(jīng)細(xì)胞膜染料did染色的mcf-7細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，圖3b和3e中，c6發(fā)出綠色熒光，圖3c和3f為merge結(jié)果，是對(duì)前兩圖的疊加結(jié)果，在疊加后，細(xì)胞發(fā)出黃色熒光。從結(jié)果看出，對(duì)比例1中c6的綠色熒光零星分布在mcf-7細(xì)胞周圍，強(qiáng)度微弱，而實(shí)施例3的綠色熒光較為集中，且綠色熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)比例1，表明slns經(jīng)pep10修飾后，能在血液中特異性地靶向mcf-7細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)slns的攝取。(3)體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)實(shí)驗(yàn)選取成功構(gòu)建動(dòng)物模型的裸鼠48只，平均分為兩組：c6-slns組和c6-slns-pepcd47-pep10組。其中，c6-slns組使用的slns為實(shí)施例8中所制備的產(chǎn)物，c6-slns-pepcd47-pep10組使用的slns為實(shí)施例3中所制備的產(chǎn)物。按dtx的給藥量為8mg/kg進(jìn)行尾靜脈注射。在給藥后0.08、0.5、1、2、4、8、12、24h的時(shí)間點(diǎn)，眼眶取血0.5ml于肝素鈉化的ep中，經(jīng)一系列處理后，采用液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定血液中dtx含量。使用液質(zhì)聯(lián)用儀分析slns在裸鼠體內(nèi)血藥-濃度曲線，結(jié)果如圖4所示，從中可看出，在給藥后的0.08～8h內(nèi)，實(shí)施例3的血藥濃度均高于對(duì)比例1。另外，從血藥-濃度曲線計(jì)算得出的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可知，實(shí)施例3的血漿清除率約為1.70l/hr/kg，低于對(duì)比例1的3.22l/hr/kg，兩者具有顯著性差異。以上結(jié)果表明，slns經(jīng)pep10修飾后能降低機(jī)體的清除速率，顯著延長(zhǎng)載體循環(huán)時(shí)間。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表<110>蘇州大學(xué)<120>靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)循環(huán)納米粒及其制備和應(yīng)用<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>23<212>prt<213>氨基酸序列<400>1valargargaspalaproargphesermetglnglyleuaspala51015cysglyglyasnasncysasnasn20<210>2<211>12<212>prt<213>氨基酸序列<400>2cysgluargvalileglythrglytrpvalargcys510當(dāng)前第1頁(yè)12