本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種魚腥草素鈉制備殺滅耐藥煙曲霉的組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著人口老齡化進程加速，惡性腫瘤、艾滋病、器官移植等患者增加，介入診療技術(shù)廣泛開展以及廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素大量使用，當(dāng)前臨床獲得性深部真菌感染呈現(xiàn)快速發(fā)展的趨勢，并已成為免疫低下患者主要死因之一。其中，煙曲霉感染率僅次于白色念珠菌，其所引起的侵襲性曲霉?。╥nvasiveaspergillosis，ia）死亡率高達80%。全球微生物耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，將近28.6%的煙曲霉對amb（amphotericinb，amb）耐藥，并已出現(xiàn)多重耐藥菌株，耐藥問題使臨床ia的治療面臨嚴峻挑戰(zhàn)。研究表明，三白草科中草藥魚腥草主要活性成分之一的魚腥草素鈉（化學(xué)結(jié)構(gòu)：癸酰乙醛亞硫酸氫鈉）具有較顯著的抗真菌作用，且毒副作用少、來源廣、價格低廉、不易誘導(dǎo)耐藥，但其對amb耐藥煙曲霉是否同樣具有抑制作用及與amb聯(lián)用的效果尚未見報道。本研究主要探討魚腥草素鈉聯(lián)合amb對臨床分離耐藥煙曲霉的抗菌活性，旨在尋找能有效治療耐藥煙曲霉相關(guān)感染的新途徑。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決日益嚴峻的曲霉病，抑制煙曲霉引起的真菌感染，提供一種魚腥草素鈉制備殺滅耐藥煙曲霉的組合物及應(yīng)用。為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的技術(shù)方案為：一種魚腥草素鈉制備殺滅耐藥煙曲霉的組合物，所述的組合物為魚腥草素鈉和抗真菌藥物，所述魚腥草素鈉濃度為1/32×mic~4×mic，所述抗真菌藥物濃度為1/32×mic~4×mic。優(yōu)選的，所述的抗真菌藥物包括amb、伏立康唑和伊曲康唑。優(yōu)選的，所述的組合物為魚腥草素鈉和amb；所述魚腥草素鈉濃度為1/32×mic~4×mic，所述amb的濃度為1/32×mic~4×mic。優(yōu)選的，所述的魚腥草素鈉需先預(yù)處理，將其溶解于100%無菌二甲基亞砜中，并經(jīng)0.22μm濾膜濾過除菌后，儲存于-80℃待用。優(yōu)選的，所述組合物預(yù)先制備成儲存液，所述魚腥草素鈉配制成濃度為20-50mg/ml的儲存液，amb配制成濃度為3-7mg/ml的儲存液。優(yōu)選的，所述組合物使用時作用時間為24-48h，35℃恒溫孵育。優(yōu)選的，所述魚腥草素鈉：抗真菌藥物體積比為1：1。優(yōu)選的，所述的amb為脫氧膽酸鹽及其脂質(zhì)體。優(yōu)選的，所述耐藥曲霉菌為侵襲性耐藥曲霉菌；所述侵襲性耐藥曲霉菌為煙曲霉菌、黃曲霉菌、土曲霉菌和黑曲霉菌。一種組合物在預(yù)防或殺滅煙曲霉的藥物中的應(yīng)用。amb及其脂質(zhì)體曾作為傳統(tǒng)治療ia的首選藥物，因在臨床上被廣泛、長期使用，使煙曲霉對amb耐藥現(xiàn)象日益嚴重，且該藥大劑量應(yīng)用會對機體產(chǎn)生明顯的腎毒性。研究表明，抗真菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用在治療由耐藥菌株導(dǎo)致的難治性曲霉病時可表現(xiàn)為協(xié)同作用，因此可作為控制和減少耐藥菌株產(chǎn)生的有效手段之一。尋找毒性較低的中藥單體活性成分作為抗真菌藥物的增效劑，增加菌體對藥物的敏感性的同時，可減少大劑量用藥給機體帶來的毒副作用，亦為當(dāng)今抗感染領(lǐng)域研究熱點。本研究結(jié)果顯示，魚腥草素鈉與amb聯(lián)用的fici值及相應(yīng)等效曲線均體現(xiàn)協(xié)同作用，并使所有受試菌株amb的mic均降至≤1μg/ml的敏感范圍，表明魚腥草素鈉在體外能增強amb的抗煙曲霉活性，逆轉(zhuǎn)耐藥菌株的耐藥性。兩藥micg聯(lián)用較micg單用顯著降低，且濃度-累積抑菌百分率曲線明顯左移，證實同一藥物在同一濃度下，聯(lián)用比單用抑菌能力更強。利用聯(lián)合用藥產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)，既能提高藥物抗菌效果，又能減少使用劑量，降低的毒副作用。因此，魚腥草素鈉與amb聯(lián)用是治療amb耐藥煙曲霉感染一種較為理想的藥物組合，本課題組后期擬通過進一步的動物體內(nèi)試驗深入挖掘其實用價值。amb的抗菌作用靶點主要是煙曲霉菌體細胞壁上的麥角固醇，而當(dāng)煙曲霉麥角固醇合成基因發(fā)生突變，導(dǎo)致麥角固醇缺失或在細胞壁上的位置發(fā)生改變，可造成煙曲霉菌株對amb耐藥。魚腥草素鈉已被證實可抑制真菌細胞內(nèi)毒力因子磷脂酶相關(guān)合成調(diào)控基因plb1、plb2和plc1的轉(zhuǎn)錄水平，進而導(dǎo)致菌絲無法形成以及細胞膜的破裂。因此兩藥聯(lián)用，可使藥物作用靶點增加從而體現(xiàn)協(xié)同抗菌作用。此外，煙曲霉可在體外形成生物被膜結(jié)構(gòu)，在胞外基質(zhì)包被狀態(tài)下，菌體的耐藥性相對其浮游狀態(tài)而言會明顯升高，同時mdr4等外排泵基因的表達明顯上調(diào)，可增強菌體對藥物的外排作用。體外已研究表明，魚腥草素鈉可以抑制和破壞真菌生物被膜結(jié)構(gòu)，使之變得疏松多孔，進而削除其屏障作用，可使抗菌藥物易于滲入菌體內(nèi)部并達到有效的蓄積量，增強殺菌作用。本發(fā)明突出的實質(zhì)性進步和顯著的特點是：魚腥草素鈉具有單體成分具有毒副作用少，來源廣，價格低廉，不易誘導(dǎo)耐藥等優(yōu)點，魚腥草素鈉在體外能增強抗真菌藥物的抗煙曲霉活性，逆轉(zhuǎn)耐藥菌株的耐藥性。兩種藥物的micg聯(lián)用較micg單用顯著降低，且聯(lián)用的濃度-累積抑菌百分率曲線相對單用時明顯左移，即同一藥物在同一濃度下，聯(lián)合應(yīng)用比單用抑菌能力更強，僅需低于4~8倍mic的兩種藥物聯(lián)用即可達到與單藥mic相同的抑菌效果?？梢娪婶~腥草素鈉與抗真菌藥物聯(lián)合產(chǎn)生的協(xié)同作用，既提高了藥物對耐藥菌株的抗菌效果，又降低了抗真菌藥物的毒副作用，是治療抗真菌藥物耐藥煙曲霉感染的一種較為理想的藥物組合物。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例2魚腥草素鈉與amb聯(lián)用對7株煙曲霉的mic等效曲線。圖2是本發(fā)明實施例2魚腥草素鈉和amb單用與聯(lián)用的濃度-累積抑菌百分率曲線。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明方案做進一步詳細描述，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。實施例1耐藥煙曲霉藥物組合物試驗1.1菌株來源實驗菌株為2012年9月至2014年8月從本院臨床送檢標本中分離的7株煙曲霉（編號為af5，af14，af15，af17，af18，af26，af32；其中痰標本5株，肺泡灌洗液1株，傷口分泌物1株），經(jīng)乳酸酚棉蘭染色形態(tài)學(xué)及48℃溫度試驗鑒定為經(jīng)典煙曲霉，本院臨床微生物檢驗中心進行藥物敏感性試驗后證實為amb耐藥菌株。質(zhì)控菌株選用clsim38-a2指南指定的近平滑念珠菌atcc22019。1.2主要試劑與儀器魚腥草素鈉（中國食品藥品檢定研究院，批號100247-199601）；amb（amresco公司，批號1397893）；rpmi-1640粉（gibco公司）；3-（n-嗎啉基）丙磺酸-4-嗎啉丙磺酸（mops，sigma公司）；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（pda，北京陸橋公司）；二甲基亞砜（dmso，sigma公司）；96孔板（corning公司）。1.3方法1.3.1孢子懸液的制備將7株amb耐藥煙曲霉復(fù)蘇并轉(zhuǎn)種于pda斜面，37℃孵育3~4d，用含0.025%tween20的pbs液沖洗斜面表面收集孢子，經(jīng)mops緩沖后ph為7.0的rpmi-1640重懸孢子，血細胞計數(shù)板調(diào)節(jié)使懸液中孢子終濃度為2×104cfu/ml。1.3.2配制藥物魚腥草素鈉和amb均用二甲基亞砜（dmso）溶解，分別配制成濃度為25.6mg/ml和3.2mg/ml的儲存液，經(jīng)0.22μm針頭濾器濾過除菌后，儲存于-80℃待用。1.3.3測定單藥mic參照clsim38-a2指南的微量液基稀釋法進行，魚腥草素鈉的工作濃度范圍為2~256μg/ml，amb為0.03125~16μg/ml。終點判讀：與生長對照孔相比，肉眼觀察到無真菌生長孔所對應(yīng)的最低藥物濃度為該藥的mic。計算mic幾何均數(shù)，以micg單用表示。1.3.4棋盤法聯(lián)合藥敏試驗參照文獻，將1/32×mic~4×mic的魚腥草素鈉和amb兩兩組合加入96孔板，每孔50μl，再加入100μl制備好的孢子懸液，于35℃恒溫孵育48h后判讀結(jié)果，并計算micg聯(lián)合，上述實驗獨立重復(fù)3次。1.3.5聯(lián)合作用效果的評價以兩藥聯(lián)用產(chǎn)生最佳抑菌效應(yīng)時的mic值作為各自的mic聯(lián)合，計算分級抑菌濃度指數(shù)（fractionalinhibitoryconcentrationindex，fici）：fici=甲藥mic聯(lián)合/甲藥mic單用+乙藥mic聯(lián)合/乙藥mic單用。fici＞2.0表示有拮抗作用，1.0＜fici≤2.0表示無關(guān)作用，0.5＜fici≤1.0表示相加作用，fici≤0.5表示協(xié)同作用，fici越小，協(xié)同作用越強。將本法測得mic結(jié)果繪制成等效線圖，根據(jù)等效曲線的形狀可以判斷協(xié)同（凹形）、拮抗（凸形）、無關(guān)（直線）。分別統(tǒng)計兩藥單用和聯(lián)用時各個濃度點的抑菌率，以濃度作為橫坐標，以抑菌率作為縱坐標，繪制濃度-累積抑菌百分率曲線。1.3.6統(tǒng)計學(xué)分析用spss16.0統(tǒng)計軟件，通過wilcoxon符號秩檢驗方法比較藥物的micg單用與micg聯(lián)合，以p＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實施例2藥物組合物試驗結(jié)果2.1質(zhì)控標準每次獨立實驗測得質(zhì)控菌株atcc22019對amb的mic值為1μg/ml，在clsim38-a2指南規(guī)定的參考范圍之內(nèi)，且生長對照孔菌株生長良好，藥敏試驗結(jié)果可靠。2.2魚腥草素鈉與amb單用及聯(lián)用的mic按照clsi推薦的ecvs標準判斷受試煙曲霉對amb的敏感性，以amb的mic≤1μg/ml為敏感，＞1μg/ml為耐藥。兩藥單用及聯(lián)用的mic具體見表1。表1魚腥草素鈉與amb單用或聯(lián)用的mic注：r表示菌株對amb耐藥2.3魚腥草素鈉與amb聯(lián)合作用評價魚腥草素鈉與amb聯(lián)用，對7株受試煙曲霉的fici值為0.25～0.5，均體現(xiàn)協(xié)同作用，具體見表2。其相應(yīng)等效曲線曲線均呈凹形，證實為協(xié)同作用，見圖1。表2魚腥草素鈉與amb聯(lián)用效果的評價菌株編號fici評價菌株編號fici評價af50.375協(xié)同af180.5協(xié)同af140.3125協(xié)同af260.25協(xié)同af150.5協(xié)同af320.375協(xié)同af170.5協(xié)同2.4兩藥單用與聯(lián)用效果比較魚腥草素鈉與amb聯(lián)用后的mic均較單用時下降4~16倍，尤其amb對各菌株的mic均由耐藥水平降至敏感范圍。amb的micg聯(lián)合＜micg單用（z=-3.228，p＜0.05），魚腥草素鈉的micg聯(lián)合＜micg單用（z=-3.235，p＜0.05）。當(dāng)魚腥草素鈉濃度為2μg/ml時，amb濃度僅需≥1μg/ml，即可抑制全部7株煙曲霉生長。兩藥聯(lián)用后相應(yīng)濃度-累積抑菌百分率曲線均較單用時明顯左移，見圖2。實施例3細胞毒性實驗取健康成人的肝素抗凝血1-3ml，用ph=7.0的pbs緩沖洗滌3次，并在溫度20-25℃、轉(zhuǎn)速2500rpm離心10min，去掉離心上清液后，加入pbs緩沖液，配成10%的紅細胞-pbs懸液，再用pbs將該懸液按1：10稀釋，取500μl置于ep管中，加入500μl經(jīng)pbs二倍連續(xù)稀釋的魚腥草素鈉或陽性對照amb。將ep管于37℃孵育1h，溫度20-25℃、轉(zhuǎn)速2500rpm離心10min，取150μl上清轉(zhuǎn)移至96孔板中，用酶標儀在540nm波長處測吸光度a540。tritonx-100孔中以0.1%tritonx-100處理后的紅細胞作為100%完全溶血，陰性對照孔以含1%dmso的紅細胞-pbs懸液作為0%溶血，具體見表3。溶血百分率（%）=(魚腥草素鈉或amb孔a540－陰性對照孔a540)/(tritonx-100孔a540－陰性對照孔a540)×100%。表3不同濃度藥物的溶血百分率(meanvalues%±sd，n=3)細胞毒性實驗解釋：以＜10%為未發(fā)生溶血，10%-25%為部分溶血，＞25%為發(fā)生明顯溶血。實驗結(jié)果表明，兩種藥物在上述各受試濃度下分別組合使用，均未觀察到溶血效應(yīng)。兩種藥物聯(lián)用產(chǎn)生最佳協(xié)同抑菌效應(yīng)時的最小藥物濃度均不會造成溶血。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的包含范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12