本發(fā)明涉及材料科學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種納米復(fù)合材料的合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康，是死亡率較大的疾病之一。臨床上，腫瘤治療的手段主要是手術(shù)治療、藥物治療及放射治療。但是，感染、機(jī)體的耐藥性及對(duì)正常組織的殺傷力等問(wèn)題限制了其發(fā)展。光線治療，是腫瘤治療的一種新發(fā)現(xiàn)，包括光線治療和光動(dòng)治療，它是利用特定波長(zhǎng)的光照將能量傳遞給敏化劑而使周圍環(huán)境溫度上升或者觸動(dòng)產(chǎn)生大量的單基態(tài)的氧，消融腫瘤細(xì)胞使其迅速死亡。光線療法可以對(duì)腫瘤部位選擇性治療，可避免對(duì)正常組織的傷害作用，幾乎對(duì)所有的腫瘤細(xì)胞都有殺傷，可治療復(fù)雜地非特異性腫瘤。協(xié)同光熱與光動(dòng)治療效應(yīng)可以達(dá)到更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷力。因此，開(kāi)發(fā)新穎高效的光熱/光動(dòng)材料對(duì)腫瘤治療有深遠(yuǎn)的意義。

金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米粒子(nanoscalemetal-organicframeworks，nmofs)是金屬離子或者其金屬氧化物為中心與有機(jī)物為配體絡(luò)合作用而形成的一種新穎的材料，由于其金屬和有機(jī)配體的可變化性，可以將納米材料功能化而擴(kuò)展其應(yīng)用。本研究利用對(duì)生物體毒性作用較少的三價(jià)鐵離子為金屬中心，卟啉類分子為有機(jī)配體制備出的新穎nmofs，可以作為潛在的光動(dòng)/光熱材料治療腫瘤。

同時(shí)，光動(dòng)治療需要大量的氧氣參與，但是惡性腫瘤生命力旺盛，消耗了大量的氧氣，使得光動(dòng)治療效應(yīng)不是很好。有研究報(bào)道，磺胺類分子可以抑制腫瘤部位的缺氧誘導(dǎo)因子產(chǎn)生，從而可改善腫瘤部位缺氧的狀態(tài)，可以提高光動(dòng)治療作用,并且磺胺類衍生物可以對(duì)腫瘤組織選擇性富集，有主動(dòng)靶向的功能。同時(shí)，為了達(dá)到納米材料更好的生物相容性，蛋白質(zhì)是充當(dāng)修飾作用的最佳選擇，牛血清蛋白制備簡(jiǎn)單易的，價(jià)格低廉而被廣泛地應(yīng)用。基于此，利用牛血清蛋白與磺胺相互作用制備出復(fù)合物，并通過(guò)共價(jià)鍵作用將牛血清蛋白/磺胺修飾在上述nmofs上，制備出蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單而高效的具有光動(dòng)/光熱效應(yīng)的蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料及制備方法，該復(fù)合材料可作為高效的光熱/光動(dòng)材料對(duì)腫瘤進(jìn)行治療，對(duì)腫瘤部位有良好的靶向性，針對(duì)腫瘤部位的常氧、厭氧區(qū)都有很好的抑制作用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)研究和不懈探索，最終獲得了如下技術(shù)方案：

一種納米復(fù)合材料的合成方法，該方法包括如下步驟：

(1)nmofs納米粒子的制備：分別取三價(jià)鐵鹽溶液、卟啉衍生物于三口燒瓶中，加入有機(jī)溶劑及醋酸，室溫?cái)嚢?-4h；隨后，將體系升溫至80-120℃，反應(yīng)20-24h，待反應(yīng)溫度冷卻至室溫，分別用有機(jī)溶劑，乙醇，去離子水離心洗滌數(shù)次，將產(chǎn)品放在50-60℃的真空干燥箱干燥20-24h，即制備出nmofs納米粒子；

所述的三價(jià)鐵鹽為六水和氯化鐵、硫酸鐵或九水合硝酸鐵中的一種；

所述的卟啉衍生物為原卟啉、內(nèi)消旋-四(4-羧基苯基)卟吩中的一種；

所述的三價(jià)鐵鹽與卟啉衍生物的摩爾比為1.0-1.5:1；

有機(jī)溶劑、醋酸的體積比為20-25:1；

所述的反應(yīng)溶劑有機(jī)溶劑為n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，n,n-二甲基乙酰胺(dmac)，甲醇中的一種或幾種；

(2)蛋白質(zhì)/磺胺復(fù)合物的制備：蛋白質(zhì)溶液與磺胺溶液共混，磁力攪拌10-12h，備用；

所述的蛋白質(zhì)與磺胺復(fù)合物的摩爾比為1:1-10；

(3)蛋白質(zhì)/磺胺-nmofs納米復(fù)合材料的制備：

a、稱取步驟(1)中所制備好的nmofs納米粒子，分散于去離子水中，用400-500w超聲儀反復(fù)超聲2-4h，至納米粒子均勻的分散在水溶液中；隨后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽((edc)于室溫下磁力攪拌15-30min，最后加入n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)于室溫下磁力攪拌2-3h，反應(yīng)完成后，用去離子水離心洗滌兩次后備用；

nmofs納米粒子在去離子水的濃度比5-10mg/ml；

nmofs納米粒與edc、nhs的質(zhì)量比為1:5-4:3；

b、將步驟(2)中所制備的蛋白質(zhì)/磺胺復(fù)合物溶液緩慢地滴加到步驟a已活化處理的nmofs溶液中，在室溫下反復(fù)超聲10-12h，反應(yīng)完成后，用去離子水離心洗滌數(shù)次，棄其上清液，最后的產(chǎn)品分散在水溶液中備用，即得蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料溶液；

所述及蛋白/磺胺與nmofs質(zhì)量比為55-60:1:285-290。

優(yōu)選地，如上所述的一種納米復(fù)合材料的合成方法，所述的蛋白為牛血清蛋白。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種納米復(fù)合材料的應(yīng)用，該復(fù)合材料可應(yīng)用于腫瘤治療。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果如下：

(1)本發(fā)明以三價(jià)鐵離子為金屬中心，卟啉類分子為有機(jī)配體，采用自組裝的方式制備出金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)的納米粒子，其納米粒子粒徑均勻，為一種單分散性的納米粒子。

(2)本發(fā)明利用蛋白質(zhì)/磺胺修飾金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)的納米粒子，制備出蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料，該制備方法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、成本低廉、便于推廣的特點(diǎn)。

(3)本發(fā)明所述蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料粒徑均一，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，合成條件簡(jiǎn)單，生物相容性良好，毒性較低，具有較好的光熱/光動(dòng)效應(yīng)，屬于材料和生物醫(yī)藥的交叉領(lǐng)域，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

(4)本發(fā)明制備的蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料可通過(guò)主動(dòng)/被動(dòng)靶向而在腫瘤部位富集，從而可以減少治療試劑的劑量，降低對(duì)正常組織的毒副作用，也能更好的發(fā)揮其治療作用。

(5)本發(fā)明制備的蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料，具有光動(dòng)/光熱效應(yīng)，可以對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷力，可以作為一種潛在的腫瘤治療試劑。

(6)本發(fā)明中的磺胺類分子可以抑制腫瘤部位的缺氧誘導(dǎo)因子產(chǎn)生，從而可改善腫瘤部位缺氧的狀態(tài)，可以提高光動(dòng)治療作用,并且磺胺類衍生物可以對(duì)腫瘤組織選擇性富集，有主動(dòng)靶向的功能。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的蛋白質(zhì)與磺胺相互作用的熒光淬滅研究譜圖。

圖2是本發(fā)明的蛋白質(zhì)與磺胺相互作用，在不同溫度下的熒光淬滅常數(shù)圖。

圖3是本發(fā)明的紅外譜圖。

圖4是本發(fā)明蛋白質(zhì)/磺胺金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料光熱轉(zhuǎn)換溫度上升圖。

圖5是本發(fā)明蛋白質(zhì)/磺胺金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料的細(xì)胞毒性研究。

圖6是本發(fā)明蛋白質(zhì)/磺胺金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料光動(dòng)效應(yīng)圖。

圖7是本發(fā)明蛋白質(zhì)/磺胺金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料體外研究光動(dòng)/光熱治療腫瘤細(xì)胞圖。

具體實(shí)施方式

以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步作描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

(1)nmofs納米粒子的制備，具體步驟如下：

配制三價(jià)鐵離子溶液，稱取2.7mgfecl3·6h2o溶于10ml的n,n-二甲基甲酰胺(1mmol/l)，備用；配制卟啉溶液，稱取7.90mg內(nèi)消旋-四(4-羧基苯基)卟吩(tcpp,相對(duì)分子質(zhì)量＝790g/mol)溶于10ml的n,n-二甲基甲酰胺(1mmol/l)，備用。

分別取上述所配制好的1mlfecl3·6h2o，tcpp溶液于25ml的三口燒瓶中，加入10ml的n,n-二甲基甲酰胺，并加入0.4ml的醋酸，室溫?cái)嚢?h；隨后，將體系升溫至80℃，反應(yīng)24h，等反應(yīng)溫度冷卻至室溫后，分別用n,n-二甲基甲酰胺溶劑,乙醇，去離子水離心洗滌數(shù)次，將產(chǎn)品放在60℃的真空干燥箱干燥24h，即制備出nmofs納米粒子。

(2)蛋白質(zhì)/磺胺復(fù)合物的制備，具體步驟如下：

配制牛血清蛋白溶液(1×10^-5mol/l),稱取66.43mg(相對(duì)分子質(zhì)量＝66.430kda)的牛血清蛋白，溶于100ml去離子水，備用；配制磺胺溶液(2×10^-4mol/l)，稱取3.444mg(相對(duì)分子質(zhì)量＝172.2g/mol)，溶于100ml去離子水，備用。

取3ml已配制好的牛血清蛋白溶液于1.5ml磺胺溶液共混，磁力攪拌12h備用。

(3)牛血清蛋白/磺胺-nmofs納米復(fù)合材料的制備，具體步驟如下：

稱取步驟(1)中所制備好的10mgnmofs納米粒子，分散于10ml去離子水中,用400w超聲儀反復(fù)超聲2h，至納米粒子均勻的分散在水溶液中，隨后加入(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/n-羥基琥珀酰亞胺)edc/nhs對(duì)nmofs溶液進(jìn)行活化處理，具體為在上述溶液中加入1ml的4mg/mledc溶液，室溫下磁力攪拌15min后，加入1ml的3mg/mlnhs溶液,室溫下磁力攪拌2h，反應(yīng)完成后，用去離子水離心洗滌兩次后備用。

將步驟(2)中所制備的4.5ml蛋白質(zhì)/磺胺復(fù)合物溶液緩慢地滴加到上述已活化處理的nmofs溶液中，在室溫下反復(fù)超聲12h，反應(yīng)完成后，用去離子水離心洗滌數(shù)次，棄其上清液，最后的產(chǎn)品分散在水溶液中備用，即得蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料溶液。

實(shí)施例2

(1)nmofs納米粒子的制備，具體步驟如下：

配制三價(jià)鐵離子溶液，稱取4.04mgfe(no3)3·9h2o溶于10ml的n,n-二甲基乙酰胺(1mmol/l)，備用；配制卟啉溶液，稱取7.90mg內(nèi)消旋-四(4-羧基苯基)卟吩(tcpp,相對(duì)分子質(zhì)量＝790g/mol)溶于10ml的n,n-二甲基乙酰胺(1mmol/l)，備用。

分別取上述所配制好的1mlfe(no3)3·9h2o，tcpp溶液于25ml的三口燒瓶中，加入10ml的n,n-二甲基乙酰胺，并加入0.4ml的醋酸，室溫?cái)嚢?h；隨后，將體系升溫至100℃，反應(yīng)20h，等反應(yīng)溫度冷卻至室溫后，分別用n,n-二甲基乙酰胺,乙醇，去離子水離心洗滌數(shù)次，將產(chǎn)品放在60℃的真空干燥箱干燥24h，即制備出nmofs納米粒子。

(2)蛋白質(zhì)/磺胺復(fù)合物的制備，具體步驟如下：

配制牛血清蛋白溶液(1×10^-5mol/l),稱取66.43mg(相對(duì)分子質(zhì)量＝66.430kda)的牛血清蛋白，溶于100ml去離子水，備用；配制磺胺溶液(2×10^-4mol/l)，稱取3.444mg(相對(duì)分子質(zhì)量＝172.2g/mol)，溶于100ml去離子水，備用。

取3ml已配制好的牛血清蛋白溶液于1.5ml磺胺溶液共混，磁力攪拌12h備用。

(3)牛血清蛋白/磺胺-nmofs納米復(fù)合材料的制備，具體步驟如下：

稱取步驟(1)中所制備好的10mgnmofs納米粒子，分散于10ml去離子水中,用500w超聲儀反復(fù)超聲2h，至納米粒子均勻的分散在水溶液中，隨后加入(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/n-羥基琥珀酰亞胺)edc/nhs對(duì)nmofs溶液進(jìn)行活化處理，具體為在上述溶液中加入1ml的4mg/mledc溶液，室溫下磁力攪拌15min后，加入1ml的3mg/mlnhs溶液,室溫下磁力攪拌2h，反應(yīng)完成后，用去離子水離心洗滌兩次后備用。

將步驟(2)中所制備的4.5ml蛋白質(zhì)/磺胺復(fù)合物溶液緩慢地滴加到上述已活化處理的nmofs溶液中，在室溫下反復(fù)超聲12h，反應(yīng)完成后，用去離子水離心洗滌數(shù)次，棄其上清液，最后的產(chǎn)品分散在水溶液中備用，即得蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料溶液。

實(shí)施例3

(1)nmofs納米粒子的制備，具體步驟如下：

配制三價(jià)鐵離子溶液，稱取5.62mgfe2(so4)3·9h2o溶于10ml的甲醇(1mmol/l)，備用；配制卟啉溶液，稱取7.90mg內(nèi)消旋-四(4-羧基苯基)卟吩(tcpp,相對(duì)分子質(zhì)量＝790g/mol)溶于10ml的甲醇(1mmol/l)，備用。

分別取上述所配制好的1mlfecl3·6h2o，tcpp溶液于25ml的三口燒瓶中，加入10ml的有機(jī)溶劑，并加入0.4ml的醋酸，室溫?cái)嚢?h；隨后，將體系升溫至80℃，反應(yīng)20h，等反應(yīng)溫度冷卻至室溫后，分別用甲醇,乙醇，去離子水離心洗滌數(shù)次，將產(chǎn)品放在60℃的真空干燥箱干燥24h，即制備出nmofs納米粒子。

(2)蛋白質(zhì)/磺胺復(fù)合物的制備，具體步驟如下：

配制牛血清蛋白溶液(1×10^-5mol/l),稱取66.43mg(相對(duì)分子質(zhì)量＝66.430kda)的牛血清蛋白，溶于100ml去離子水，備用；配制磺胺溶液(2×10^-4mol/l)，稱取3.444mg(相對(duì)分子質(zhì)量＝172.2g/mol)，溶于100ml去離子水，備用。

取3ml已配制好的牛血清蛋白溶液于1.5ml磺胺溶液共混，磁力攪拌12h備用。

(3)牛血清蛋白/磺胺-nmofs納米復(fù)合材料的制備，具體步驟如下：

稱取步驟(1)中所制備好的5mgnmofs納米粒子，分散于10ml去離子水中,用400w超聲儀反復(fù)超聲2h，至納米粒子均勻的分散在水溶液中，隨后加入(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/n-羥基琥珀酰亞胺)edc/nhs對(duì)nmofs溶液進(jìn)行活化處理，具體為在上述溶液中加入1ml的4mg/mledc溶液，室溫下磁力攪拌15min后，加入1ml的3mg/mlnhs溶液,室溫下磁力攪拌2h，反應(yīng)完成后，用去離子水離心洗滌兩次后備用。

將步驟(2)中所制備的4.5ml蛋白質(zhì)/磺胺復(fù)合物溶液緩慢地滴加到上述已活化處理的nmofs溶液中，在室溫下反復(fù)超聲12h，反應(yīng)完成后，用去離子水離心洗滌數(shù)次，棄其上清液，最后的產(chǎn)品分散在水溶液中備用，即得蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料溶液。

我們研究了蛋白質(zhì)與磺胺相互作用的熒光淬滅譜圖，從圖1可知，蛋白質(zhì)與磺胺分子可以很好的相互作用。

我們也研究了蛋白質(zhì)與磺胺相互作用，在不同溫度下的熒光淬滅常數(shù)，從圖2可知，牛血清蛋白與磺胺是發(fā)生的靜態(tài)淬滅，即有化學(xué)鍵的生成，形成了牛血清蛋白/磺胺復(fù)合物。

對(duì)實(shí)施例1制備的樣品進(jìn)行了紅外掃描，由圖3可知，nmofs的譜線1000cm^-1出現(xiàn)fe-n峰，蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料在1600-1700cm^-1明顯出現(xiàn)蛋白質(zhì)酰胺i與酰胺ii的特殊伸縮振動(dòng)峰，證明已成功合成蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料。

對(duì)實(shí)施例1制備的蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料的性能測(cè)試：

(1)光熱效應(yīng)測(cè)試

用1.5ml離心管裝入蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料的水溶液，并按一定的復(fù)合材料的濃度配制樣品，以清水作為對(duì)照組。分別用1.2w/cm的660nm激光照射10min，用紅外溫度顯示照相機(jī)每隔30s記錄溶液上升的溫度。

由圖4可以發(fā)現(xiàn)，激光照射后，離心管內(nèi)的溫度明顯上升，證明蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料是很好的光熱轉(zhuǎn)換材料，可用于光熱治療于腫瘤。

(2)細(xì)胞毒性測(cè)試

將蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料與4t1細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，用mtt法檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)存活率。

由圖5可知，復(fù)合材料有很好的生物相容性，在實(shí)驗(yàn)的最大濃度下(400μg/ml),細(xì)胞的相對(duì)存活率依然能達(dá)到80％以上。

(3)光動(dòng)效應(yīng)測(cè)試

光動(dòng)效應(yīng)主要是產(chǎn)生大量的單基態(tài)氧，因此我們用單基態(tài)的氧指示劑(cm-h2dcfda)檢測(cè)，單基態(tài)的氧可以使cm-h2dcfda變成不可逆轉(zhuǎn)的dcf，dcf可以顯示出綠色熒光，從而我們根據(jù)綠色熒光來(lái)證明其光動(dòng)效應(yīng)。將蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料與4t1細(xì)胞共培育8h，用60mw/cm²的660nm激光照射10min后，加入2μl的cm-h2dcfda溶液，通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡可以直觀的觀察光動(dòng)效應(yīng)。

由圖6可知，光照過(guò)后的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)大面積的綠色熒光，證明蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料受激光激發(fā)可以產(chǎn)生大量的單基態(tài)氧，從而為殺死腫瘤細(xì)胞提供條件。

(4)抗腫瘤性質(zhì)測(cè)試

蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料的抗腫瘤性質(zhì)，我們依然用mtt檢測(cè)法驗(yàn)證。將同等濃度的蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料與腫瘤細(xì)胞4t1細(xì)胞共培養(yǎng)8h，模擬蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料對(duì)腫瘤細(xì)胞的光動(dòng)、光熱治療，分別對(duì)上述已培養(yǎng)好的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行不同需要的光照實(shí)驗(yàn)，用mtt測(cè)定細(xì)胞的相對(duì)存活率。

由圖7可知，蛋白質(zhì)/磺胺-金屬有機(jī)框架結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料是一種很好的光動(dòng)/光熱協(xié)同材料，可以利用其光動(dòng)/光熱效應(yīng)很好的殺死腫瘤細(xì)胞。