本發(fā)明涉及醫(yī)學、免疫學、細胞生物學和分子生物學領域，具體涉及一種自體CAR-T細胞制備方法及其應用。
背景技術：
免疫細胞療法作為一種新的癌癥治療方法，其治療效果在臨床上得到越來越多的證實，CAR-T細胞(嵌合抗原受體T細胞)技術是利用病人自身的免疫細胞來清除癌細胞免疫細胞療法，在多種血液癌癥治療中展現(xiàn)了極高的優(yōu)勢，攻破實體瘤也指日可待，由于腫瘤免疫療法在治愈腫瘤的同時又沒有傳統(tǒng)放療、化療的治療毒性，所以免疫細胞療法在腫瘤的治療中具有廣闊的前景。
過繼細胞治療(ACT)因其在短時間內擴增和活化具有抗瘤活性的效應細胞，在臨床研究中備受關注。TIL、CIK、NK、NKT和γδT這些用于ACT的細胞在臨床應用研究中取得一定的療效，但腫瘤抗原特異性、親和力好的免疫細胞來源困難、數(shù)量較少，殺瘤活性和體內持續(xù)時間不足，制約了ACT的發(fā)展。
T細胞可攜帶外源基因安全的進入人體內(Kerkar SP."Model T"cells:a time-tested vehicle for gene therapy Fronti Immunol,2012；4:304-304)。T細胞容易獲得，在體外可被有效地誘導，并能大量增殖，可根據(jù)T細胞的這些特點，采用現(xiàn)代基因轉導技術，賦予T細胞新的特性，經過修飾的T細胞可在其表面穩(wěn)定的表達抗原結合域，識別靶抗原的同時，無MHC限制性(Ito F,Chang AE(2013).Cancer immunotherapy:current status and future Directions.Surg Onco Clin N Am,22(4):765-783.)。
于是，研究者嘗試使用基因修飾T細胞來解決制約ACT發(fā)展的問題，用來修飾T細胞的基因有TCR、CAR、促進免疫細胞增殖的細胞因子(如IL-2、IL-15)等。其中嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)是以能編碼單鏈抗體-共刺激分子-免疫受體酪氨酸活化基因序列的嵌合分子的融合基因修飾T細胞。因其具有腫瘤抗原識別特異性強、親和力高、非MHC限制性及可在體內外大量擴增的優(yōu)點而受到較多關注。
最新研究表明，采用初始T細胞(TN)或者中心記憶T細胞(TCM)，這些細胞比分化的T細胞具有更強大的體內殺傷活性。具體操作：可通過類T細胞干細胞標記物CD62L進行T細胞分選。例如，將來自癌癥患者的PBMC與自體腫瘤細胞和磁珠共同培養(yǎng)，所述磁珠能通過CD3與CD28、CD40或CD28加CD40的組合來活化T細胞。
CAR是人工構建的融合基因編碼的跨膜分子，有胞外區(qū)、胞內區(qū)和跨膜區(qū)構成。胞外區(qū)的單鏈可變區(qū)(scFv)，負責特異性抗原的識別；胞內區(qū)負責信號的轉導，當胞外區(qū)和抗原特異性結合后，胞內區(qū)啟動細胞活化所需的信號，從而促進T細胞增殖、釋放細胞因子、抗細胞凋亡等；跨膜區(qū)鏈接胞外區(qū)和胞內區(qū)，對每一個區(qū)域的不同設計直接影響CAR-T細胞功能的發(fā)揮。
B淋巴細胞白血病和惡性淋巴瘤是原發(fā)于骨髓造血系統(tǒng)和淋巴結并彌漫全身的惡性腫瘤。傳統(tǒng)的放化療雖然有一定療效，但沒有選擇性，對正常組織損傷很大。近年來，生物治療方法廣泛應用于腫瘤治療，尤其是單克隆抗體，如rituximab并因其特異靶向性、高親和性而收到了良好效果。單抗通過Fc段與效應細胞表面激活性受體FcγRⅠ/FcγRⅢ結合，從而介導殺傷作用，但具有免疫殺傷作用的T細胞因為表面缺乏上述受體而不能被有效介導，從而削弱了機體對腫瘤的免疫效應。用抗CD19修飾的CAR-T細胞能同時識別多種不同抗原，可以介導T細胞高效特異殺傷B淋巴細胞來源的腫瘤細胞，為解決腫瘤的免疫逃逸帶來了曙光。
CD19是較為理想的腫瘤相關抗原，它表達于除干細胞以外的B淋巴細胞發(fā)育的各個階段，因此B細胞來源的惡性細胞均有CD19表達。有關研究表明CD19抗體scFv構建的CAR-T細胞具有高度親和力和裂解原代B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)瘤細胞的作用(Cooper LJ,Topp MS,Serrano LM,et al.T-cell clones can be rendered specific for CD19:toward the selective augmentation of the graft-versus-B-lineage leukemia effect.Blood,2003；101(4):1637-1644.)。Kalos等人在用抗CD19修飾的第二代CAR-T細胞進行治療進展性CLL時發(fā)現(xiàn)，CAR-T細胞在體內擴增速度快甚至可達1000倍以上，持續(xù)時間超過6個月。不但消除了腫瘤細胞，一部分細胞還以記憶性CAR-T在體內持續(xù)存在(Kalos M,Levine BL,Porter DL,et al.T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.Sci Transl Med,2011；3(95):95ra73-95ra73)。B細胞成熟抗原表達于成熟B細胞和漿細胞表面，能促進兩者的存活，B細胞成熟抗原是腫瘤壞死因子超家族成員，可結合B細胞活化因子和增殖誘導配體，在治療多發(fā)性骨髓瘤上是一個有前景的靶目標。
CD3是T淋巴細胞表面特異分子，功能是把TCR與外來結合的抗原信息傳遞到細胞內，啟動細胞內的活化過程，在T細胞接受抗原刺激后發(fā)生激活的早期過程起重要作用。
4-1BB又稱CD137，是T細胞表面活化分子，在活化的T細胞上表達，4-1BB的參與可以放大已經被誘導的免疫應答。4-1BB與抗4-1BB的單克隆抗體相接觸后可以刺激被抗原激活的、有腫瘤特異性殺傷活性的CD8+T淋巴細胞增殖，刺激干擾素-γ(IFN-γ)和其他Th1型細胞因子(IL-2)，腫瘤壞死因子(TNF-α)的生成、釋放，并刺激對抗細胞凋亡的T細胞的保護。另外4-1BB有免疫調節(jié)效應。4-1BB配體(4-1BBL)可顯著放大CD8+T淋巴細胞的應答。研究顯示，在CAR中間加入共刺激分子4-1BB后得到的CAR-T細胞具有分泌跟過細胞因子和更強的增殖活性(Carpenito C,Milone MC,Hassan R,et al.Control of large,established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137domains.Proc Natl Acad Sci USA,2009；106(9):3360-3365)。有關研究表明，CD28的跨膜區(qū)表達CAR的能力最強。CD28+4/1BB組合提供共刺激信號，當抗原刺激第一信號通路后，可以上調抗細胞凋亡基因的表達、促進IL2分泌。
有關研究表明，CAR引入共刺激分子信號(如CD28、CD137、CD27、CD244等)，可提高T細胞的細胞毒性、增殖活性、存活時間，增加抗原誘導的細胞因子釋放，上調抗細胞凋亡蛋白。這些作用可增強T細胞對目標腫瘤的殺傷作用(Song DG,Ye Q,Poussin M,et al.CD27costimulation augments the survival and antitumor activity of redirected human T cells in vivo.Blood,2012；119(3):696-706)
因此可通過基因修飾，定向構建scFv–CD28-CD137-CD19-CD3基因，然后將其導入到T細胞制作成CAR-T細胞，從而可以實現(xiàn)介導T細胞特異性殺傷B淋巴細胞來源的腫瘤細胞，而且共刺激分子信號還可以提高CAR-T細胞的細胞毒性、增殖活性，增強T細胞對目標腫瘤細胞的殺傷作用。
CAR-T細胞的制備過程中，需要將抗體序列及T細胞受體信號途徑的編碼分子相關的序列導入至T細胞中，外源基因導入進行治療，大多數(shù)研究結果顯示，這是一種比較安全的方式。目前美國用于臨床試驗導入外源基因的方式大致有逆轉錄病毒、慢病毒、轉座子mRNA、電轉入等方式。早在1990年，Rosenberg小組提出利用逆轉錄病毒將外源基因導入T細胞進行腫瘤是安全可行的，同年美國FDA批準了基因治療。逆轉錄病毒感染的主要是分裂期細胞，對于非分裂細胞感染能力極弱。在此基礎上發(fā)展出的慢病毒，則對分裂和非分裂細胞均具有較好的感染能力。采用傳統(tǒng)直接轉染的方式難以將外源基因導入至T淋巴細胞中，因此絕大部分CAR-T細胞制備時，采用的慢病毒系統(tǒng)，因為病毒類載體涉及較多專利上的爭議，因此研究者們又嘗試采用轉座子結合電轉導入外源基因來制備CAR-T細胞，臨床前研究也證實該方法是可行的，盡管逆轉錄病毒和慢病毒導入外源基因進行治療被認為是安全的，但是由于外源基因卻是隨機整合至宿主基因組并在細胞內長期存在且穩(wěn)定表達，存在不合適的插入位點突變，可能會引起細胞發(fā)生轉化的潛在風險，轉座子電轉的方式也存在著類似的風險。因此，有研究探索將編碼質粒直接通過電轉導入細胞內，但是因為質粒導入的方式大多數(shù)為瞬時表達，能否達到治療效果還有待進一步實驗驗證。利用RNA作為目標導向的CRISPR/Cas9基因編輯技術被認為是基因編輯技術最新的成果，研究發(fā)現(xiàn)Cas9可以解旋DNA，解旋之后gRNA和靶向DNA配對，并利用配對結合所釋放的能量進行切割DNA。
表達CAR的T細胞可以直接識別并結合腫瘤細胞表面的TAA，CAR將信號傳入T細胞內，激活T細胞分泌細胞因子包括穿孔素、顆粒酶、INF-γ、TNF-α等，從而發(fā)揮殺傷腫瘤細胞作用。因此，CAR-T細胞是MHC非限制性的。CAR-T細胞將抗體-抗原特異性結合能力以及細胞介導的殺傷功能結合于一體，制作簡單，應用廣泛，是免疫抗腫瘤治療的重要方法。
CAR將抗體對腫瘤抗原的高親和性和T細胞的殺傷機制結合，通過基因轉染T淋巴細胞，使其能特異性的殺傷腫瘤細胞。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是在腫瘤患者體外生產轉基因T淋巴細胞，然后擴增后輸入患者體內用于治療腫瘤疾病。具體做法是用慢病毒做載體將構建的CD28-CD137-CD19-CD3全長基因，轉染T細胞制作成CAR-T細胞，然后經過體外擴增后，回輸?shù)交颊唧w內進行腫瘤治療。
一種自體CAR-T細胞制備方法，包括步驟如下：
(a)從腫瘤患者體內獲得細胞樣本并分離和激活，所述樣本為T細胞或T細胞的祖細胞；
(b)構建scFv–CD28-CD137-CD19-CD3；
(c)制作pCAG-T7-CD28-CD137-CD19-CD3-gRNA重組質粒
(d)轉染T細胞；
(e)體外培養(yǎng)擴增CAR-T細胞群體；
(f)CAR-T細胞回輸患者體內，進行抗腫瘤治療；
所述步驟(a)的具體操作流程為：1)抗凝血管抽取骨髓瘤患者外周血；2)向管中加入紅細胞裂解液和等體積PBS，輕輕吹打成細胞懸液；3)另取兩支離心管，加入LTS1077淋巴細胞分層液；用吸管吸取細胞懸液，在距離淋巴細胞分層液上方0.5-3cm處將細胞懸液小心而緩慢的加入，使細胞懸液重疊與淋巴細胞分層液上，2000r/min離心5-50min；4)取出離心管，移液管吸去最上層的血漿，移液槍吸取血裝層下的單個核細胞置入離心管中，加入PBS，輕輕吹打均勻后再次離心，1500r/min，10min，去掉上清液，共洗滌2-5次；5)向去掉上清后的離心管內加入含滅活胎牛血清、青鏈霉素和RPMI-1640的培養(yǎng)基放置于37℃細胞培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)；6)離心，收取外周血單核細胞，置于液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>
所述細胞裂解液和PBS等體積，細胞裂解液和PBS的總體積與抽取的外周血體積比為2:1-1:2。
淋巴細胞分層液和細胞懸液的體積比為2:1-1:2；步驟4)中加入PBS的體積為淋巴細胞分層液的1/2-3倍；
步驟5)中加入的濃度分別是10％滅活胎牛血清、100U/ml青鏈霉素、100U/mlIL-2的RPMI-1640。
所述步驟(c)為根據(jù)CRISPR/Cas9靶點設計原則，應用crispr在線工具設計、合成靶向scFv–CD28-CD137-CD19-CD3全長基因的gRNA和引物，并將其插入到CRISPR/Cas9質粒骨架載體中，制作成pCAG-T7-CD28-CD137-CD19-CD3-gRNA重組質粒。
所述步驟(d)為將步驟(c)制得的質粒CAG-T7-CD28-CD137-CD19-CD3-gRNA與步驟(a)制得的外周血單核細胞混合進行轉染。
所述步驟(e)的詳細步驟為：用OKM-100細胞培養(yǎng)液調整接種密度為(1-2)×106/ml后加入到含有刺激因子細胞培養(yǎng)瓶內，然后再加入自體滅活血漿，至細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，培養(yǎng)4～5d待細胞鋪滿瓶底后，將細胞轉入大的細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3d后，將大的細胞培養(yǎng)瓶中的細胞轉至含有更大的OKM-200細胞培養(yǎng)液的CO2透氣培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)6-7d后，收獲細胞。
本發(fā)明的優(yōu)點在于：
1、與傳統(tǒng)腫瘤治療方法相比，該方法副作用小。
2、經過基因修飾的T細胞可在其表面穩(wěn)定的表達抗原結合域，識別靶抗原的同時，無MHC限制性。
3、CAR-T細胞在體內擴增速度快，持續(xù)時間長。不但可消除腫瘤細胞，一部分細胞還以記憶性CAR-T在體內持續(xù)存在。
4、CAR引入共刺激分子信號(如CD28、CD137、CD3、CD19等)，可提高T細胞的細胞毒性、增殖活性、存活時間，增加抗原誘導的細胞因子釋放，上調抗細胞凋亡蛋白，這些作用可增強T細胞對目標腫瘤的殺傷作用。
5本發(fā)明用CD19抗體scFv基因構建的CAR-T細胞具有高度親和力和裂解原代B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)瘤細胞的作用，B細胞成熟抗原是腫瘤壞死因子超家族成員，可結合B細胞活化因子和增殖誘導配體，在治療多發(fā)性骨髓瘤上是一個有前景的靶目標。
6、CAR-T細胞體外擴增培養(yǎng)方法操作簡單，培養(yǎng)時間較短，(2-3周)。
7、以癌癥患者自體淋巴細胞進行構建CAR-T細胞，不存在違反醫(yī)學倫理的風險。
8、使用CRISPR/Cas9基因編輯技術插入目標基因，操作便捷，準確率高。
具體實施方式
為了更詳細地說明本發(fā)明，給出下述制備實例。但本發(fā)明的范圍并不局限于此。
實施例1
本發(fā)明提供了一種自體CAR-T淋巴細胞的制備方法，具體方案包括：
(a)從腫瘤患者獲得細胞樣本，所述樣本包括T細胞或T細胞的祖細胞；
(b)構建scFv–CD28-CD137-CD19-CD3，
(c)制作pCAG-T7-CD28-CD137-CD19-CD3-gRNA重組質粒
(d)轉染T細胞
(e)體外培養(yǎng)擴增CAR-T細胞群體；
(f)CAR-T細胞回輸患者體內，進行抗腫瘤治療
(a)、外周血單核細胞的分離與激活
選取肝腎功能正常；PBMC對CD3/CD28刺激有良好應答的骨髓瘤癌癥患者。
1、抗凝血管抽取骨髓瘤患者外周血10ml；
2、向管中加入紅細胞裂解液和等體積PBS，輕輕吹打成細胞懸液20ml；
3、另取兩支50ml離心管，加入10mlLTS1077淋巴細胞分層液。用吸管吸取10ml細胞懸液，在距離淋巴細胞分層液上方1cm處將細胞懸液小心而緩慢的加入，使細胞懸液重疊與淋巴細胞分層液上，2000r/min離心20min；
4、取出離心管，移液管吸去最上層的血漿，移液槍吸取血裝層下的單個核細胞置入離心管中，加入10mlPBS，輕輕吹打均勻后再次離心，1500r/min，10min，去掉上清液，共洗滌3次。
5、向去掉上清后的離心管內加入含10％滅活胎牛血清、100U/ml青鏈霉素、100U/mlIL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基放置于37℃，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)。
6、離心，收取外周血單核細胞，置于液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>
(b)Hinge－TM－CD28－CD137－CD19-CD3ξ的設計
CAR的較鏈區(qū)(Hinge)和跨膜區(qū)(TM)來自CD8a(aa135-205,GenBank：BC025715.1)、CD28功能區(qū)(aa180-220,GenBank：BC025715.1)、CD137(aa214-255,GenBank:U03397.1)、CD19(aa422-433,深圳欣博盛生物科技)及CD3ξ(aa52-163,Genbank：J04132.1)，Hinge－TM－CD28－CD137－CD19-CD3ξ表達框通過基因合成儀(Dr.Oligo192合成儀)完成。
Hinge－TM－CD28－CD137－CD19-CD3ξ擴增
Hinge-TM-CD28-CD137-CD19-CD3ξ擴增引物：
F2:5-TGGCACCAAGCTGGAAATCAAAACCACGACGCCAGCGCCGCGA-3
R2:5-CGGGATCCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3，引物由上海生工生物有限公司合成。
獲得的目的基因片段Hinge-TM-CD28-CD137-CD19-CD3ξ，分裝凍存于-20℃冰箱中保存。
(c)制作pCAG-T7-CD28-CD137-CD19-CD3-gRNA重組質粒
根據(jù)CRISPR/Cas9靶點設計原則，設計出符合要求的gRNA，對其進行篩選及脫靶效應評估，挑選出特性強的gRNA。然后利用生物信息軟件進行全基因組比對，避免選擇脫靶風險大的靶點序列，進行體外以增加成功率。
將上述步驟獲得的Hinge-TM-CD28-CD137-CD19-CD3ξ與載體質粒進行連接，用連接酶將大小為2436bp的目的片段Hinge-TM-CD28-CD137-CD19-CD3ξ連接入載體基因中。反應體系為Solution I酶連接體系
Solution I酶連接體系
PCR反應條件：95℃反應3分鐘，95℃緩慢自然冷卻至25℃，16℃反應5分鐘，然后將退貨產物連接到載體中：pCAG-T7 1μl，PCR反應產物2μl，用水稀釋至10μl，充分混合后，室溫(25℃)靜置5分鐘。取連接產物5μl加入到解凍的50μl DH5α感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，冰浴30分鐘后，42℃熱激90秒，冰上靜置2分鐘，直接涂于平板，第二天，挑出生長良好的菌落于LB培養(yǎng)液中，37℃200rpm搖床培養(yǎng)過夜。取5ml菌液進行測序。
2、pCAG-T7-CD28-CD137-CD19-CD3-gRNA對T細胞的轉染
將構建好的重組質粒用TE buffer稀釋至等濃度后等體積混合，將步驟(a)獲得的生長良好的單核細胞分別消化后接種至12孔板，融合達到60％-80％時進行pCAG-T7-CD28-CD137-CD19-CD3-gRNA轉染。取2μl重組質粒加入2μl Easyfect，輕輕吹打，搖晃混勻，室溫孵育20分鐘。用篩選培養(yǎng)基篩選出基因插入的混合克隆細胞株，測序分析檢測基因轉染效果。
(e)CAR-T細胞體外擴增培養(yǎng)
根據(jù)CAR-T細胞計數(shù)結果，用OKM-100細胞培養(yǎng)液調整接種密度為(1-2)×106/ml后加入到含有刺激因子的75cm2細胞培養(yǎng)瓶內，然后再加入10％的自體滅活血漿，至37℃CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，培養(yǎng)4-5d待細胞鋪滿瓶底后，將細胞轉入225cm2細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3d后，將225cm2細胞培養(yǎng)瓶中的細胞轉至含有1000ml OKM-200細胞培養(yǎng)液的CO2透氣培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)6-7d后，收獲細胞,計數(shù)。
(f)CAR-T細胞回輸患者體內，進行抗腫瘤治療
培養(yǎng)好的CAR-T細胞進行細菌、真菌、支原體、外來病毒及內毒素檢測無陽性后，混懸于100ml生理鹽水中，用帶有濾膜的輸液器緩慢靜滴越1h，回輸前可肌注苯海拉明20-40mg?；剌斶^程檢測生命體征及毒副反應。每次回輸前抽靜脈血做外周血淋巴細胞亞群檢測。外周血淋巴細胞表型應用流式細胞儀測定，分別測定CD3+、CD28+、CD19+、CD137+、CD3+CD28+CD19+CD137+、CD3+CD28+、CD19+CD137+、CD3+CD28+CD19+、CD28+CD19+CD137+，細胞在淋巴細胞中所占百分比情況，以獲得CAR-T細胞在體內更加詳細的數(shù)據(jù)。同時用MTT法檢測培養(yǎng)擴增后CAR-T細胞的殺傷腫瘤細胞的活性。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本領域的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。因此，本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求的保護范圍為準。