利用自體腫瘤與正常配對(duì)原代細(xì)胞篩選腫瘤藥物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種利用自體腫瘤與正常配對(duì)原代細(xì) 胞篩選腫瘤藥物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近幾年來(lái)，腫瘤的發(fā)生率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，目前常規(guī)的治療方法主要有手術(shù)、放 化療、生物治療等，而其中化療所面對(duì)的群體又占主要部分，化療是利用化學(xué)藥物阻止癌細(xì) 胞的增殖、侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移直至最終殺滅癌細(xì)胞的一種治療方法，它是一種全身性的治療手段。 但是由于化療藥物的選擇性不強(qiáng)，在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)不可避免地?fù)p傷人體正常的 細(xì)胞，從而出現(xiàn)藥物的不良反應(yīng);如何使病人接受化療藥物后，達(dá)到最佳的抗腫瘤作用，同 時(shí)又能最大限度地降低化療藥物對(duì)人體的損傷，成為目前腫瘤治療過(guò)程中亟需解決的問 題。
[0003] 越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是腫瘤細(xì)胞與其生長(zhǎng)的環(huán)境相互作用 的結(jié)果。即使在腫瘤發(fā)生的最早期，腫瘤細(xì)胞的失控型存活與生長(zhǎng)也需要其環(huán)境相應(yīng)的改 變才能維持，由于體內(nèi)腫瘤組織多具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，包括增殖旺盛的細(xì)胞、靜止細(xì)胞和壞死 組織等，具有明顯的異質(zhì)性，在同一腫瘤組織內(nèi)部，不同部位細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性不 同；在不同病人，同一腫瘤組織對(duì)于同種化療藥物的敏感性也不同。所以無(wú)論是使用腫瘤細(xì) 胞模擬人體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行藥物篩選，還是其他的一些藥物篩選方法（如原代細(xì)胞藥物篩選 等），都不能真正解決目前腫瘤治療中藥物的選擇問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一。
[0005] 為此，本發(fā)明提出一種利用自體腫瘤與正常配對(duì)原代細(xì)胞篩選腫瘤藥物的方法， 該方法簡(jiǎn)單可行，可以篩選出藥效好的腫瘤藥物。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的利用自體腫瘤與正常配對(duì)原代細(xì)胞篩選腫瘤藥物的方法，包 括以下步驟:S1、提供組織源相同的腫瘤細(xì)胞和正常配對(duì)的正常原代細(xì)胞，并分別對(duì)其進(jìn)行 培養(yǎng);S2、將所述腫瘤細(xì)胞和所述正常原代細(xì)胞分別接種，并將所述腫瘤細(xì)胞和所述正常原 代細(xì)胞分別分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組;S3、提供多個(gè)針對(duì)該腫瘤的備選藥物，并將多個(gè)所述備選 藥物分別對(duì)所述腫瘤細(xì)胞和所述正常原代細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行加藥處理;S4、通過(guò)ATP生物熒 光藥效檢測(cè)方法檢測(cè)并分析各備選藥物對(duì)所述腫瘤細(xì)胞和所述正常原代細(xì)胞的抑制率，初 篩得到候選藥物;S5、將候選藥物組作用的所述腫瘤細(xì)胞組和所述正常原代細(xì)胞進(jìn)行流式 凋亡檢測(cè)，篩選出所述候選藥物中對(duì)所述腫瘤細(xì)胞的抑制率最高且同時(shí)對(duì)所述正常細(xì)胞的 抑制率最低的藥物，作為臨床推薦藥物。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的利用自體腫瘤與正常配對(duì)原代細(xì)胞篩選腫瘤藥物的方法，可 以針對(duì)不同病人建立不同的藥物篩選體系，判定不同腫瘤候選藥物的藥效，并提供相應(yīng)濃 度的最佳腫瘤藥物，保證在有效殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，最大限度地降低藥物對(duì)于病人的副 作用。
[0008] 另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的利用自體腫瘤與正常配對(duì)原代細(xì)胞篩選腫瘤藥物 的方法，還可以具有如下附加的技術(shù)特征：
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述步驟S1包括:S11、提供組織源相同的腫瘤細(xì)胞和 正常配對(duì)的正常原代細(xì)胞，并將所述腫瘤細(xì)胞和所述正常原代細(xì)胞分別吹散成單個(gè)細(xì)胞； S12、將所述腫瘤細(xì)胞和所述正常原代細(xì)胞分別加入培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng);S13、定期對(duì)所述腫瘤細(xì) 胞和所述正常原代細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間后，收集所述腫 瘤細(xì)胞和所述正常原代細(xì)胞。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在所述步驟S12中，所述腫瘤細(xì)胞和所述正常原代細(xì)胞 的培養(yǎng)溫度為36.5°C_37.5°C，二氧化碳濃度為4%-6%。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在所述步驟S13中，所述預(yù)定時(shí)間為5-7天。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述步驟S1還包括:S14、將收集的所述腫瘤細(xì)胞和所 述正常原代細(xì)胞部分凍存。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述步驟S2包括:S21、對(duì)所述腫瘤細(xì)胞進(jìn)行精密度檢 測(cè)和敏感度測(cè)試，篩選出滿足藥物篩選要求的所述腫瘤細(xì)胞，并確定所述腫瘤細(xì)胞的正式 接種數(shù);S22、將所述腫瘤細(xì)胞和所述正常原代細(xì)胞分別按照正式接種數(shù)接種在96孔板上， 并將所述腫瘤細(xì)胞和所述正常原代細(xì)胞分別分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述步驟S21包括:S211、將所述腫瘤細(xì)胞分為低數(shù)目 組、中數(shù)目組和高數(shù)目組并分別接種，其中，所述低數(shù)目組的腫瘤細(xì)胞數(shù)為400-600，所述中 數(shù)目組的腫瘤細(xì)胞數(shù)為9000-11000，所述高數(shù)目組的腫瘤細(xì)胞數(shù)大于40000; S212、培養(yǎng)預(yù) 定時(shí)間后，分別測(cè)定所述低數(shù)目組、中數(shù)目組和高數(shù)目組的RLU值，選擇RLU平均值>400000 的最低腫瘤細(xì)胞數(shù)作為正式接種數(shù)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述步驟S3包括:S31、提供多個(gè)備選藥物，并將每個(gè)所 述備選藥物分別調(diào)配成多個(gè)濃度;S32、將多個(gè)濃度的多個(gè)所述備選藥物分別對(duì)所述腫瘤細(xì) 胞和所述正常原代細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行加藥處理。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述步驟S4包括：S41、提取每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的ATP，利用生 物熒光原理測(cè)定ATP含量，結(jié)果傳輸計(jì)算機(jī);S42、通過(guò)軟件分析不同濃度的不同備選藥物對(duì) 所述腫瘤細(xì)胞和所述正常原代細(xì)胞的抑制率，繪制曲線；S43、挑選出對(duì)所述腫瘤細(xì)胞的抑 制率超過(guò)60%，同時(shí)對(duì)所述正常原代細(xì)胞的抑制率低于50%的備選藥物，初篩得到候選藥 物及候選藥物的濃度。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述步驟S5包括:S51、收集候選藥物組作用的所述腫 瘤細(xì)胞組和所述正常原代細(xì)胞，每個(gè)樣本的細(xì)胞數(shù)為IX l〇6;S52、將每個(gè)所述樣本分別用 孵育緩沖液洗滌1次，500-1000r/min離心5min;S53、用100ul的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下 避光孵育10-1511^11 ;354、500-100(^/1^11離心51^11沉淀細(xì)胞，并用孵育緩沖液洗1次;355、將 細(xì)胞加入熒光溶液，在4°C下孵育20min，避光并保持振動(dòng)；S56、流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用 488nm，用一波長(zhǎng)為515nm的通帶濾器檢測(cè)FITC焚光，另一波長(zhǎng)大于560nm的濾器檢測(cè)PI; S57、篩選出所述候選藥物中對(duì)所述腫瘤細(xì)胞的抑制率最高且同時(shí)對(duì)所述正常細(xì)胞的抑制 率最低的藥物，作為推薦藥物。
[0018] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得 明顯和容易理解，其中：
[0020] 圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的利用自體腫瘤與正常配對(duì)原代細(xì)胞篩選腫瘤藥物的方 法的流程圖；
[0021] 圖2是備選藥物對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率曲線圖；
[0022] 圖3是備選藥物對(duì)正常原代細(xì)胞的抑制率曲線圖；
[0023] 圖4是雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同