專利名稱：使人的體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生自體生殖干細(xì)胞的方法、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及領(lǐng)域?qū)儆谏镝t(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種使人的體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生自體生殖干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在哺乳動物中，生殖腺里的生殖干細(xì)胞來源于一種從胚胎傳留下來的數(shù)量稀少的原始生殖干細(xì)胞。胚胎形成及卵巢或睪丸形成的過程中，原始生殖干細(xì)胞就只定居卵巢或睪丸。在卵巢或睪丸分化、發(fā)育和形成成熟的卵泡及卵子或精子是一個消耗過程。女性一生中，經(jīng)過400至500次卵泡發(fā)育成熟、排卵和月經(jīng)形成后，卵巢的生殖干細(xì)胞原卵細(xì)胞就會枯竭，卵巢中就不再有原卵細(xì)胞和卵泡細(xì)胞，雌激素的主要來源也同時發(fā)生枯竭；卵巢萎縮變小，卵巢就衰老了。多數(shù)情況下，男性65歲開始睪丸的原始生殖干細(xì)胞也會逐漸枯竭。衰老枯竭的卵巢或睪丸使男女性不可避免地走向機(jī)體整體衰老的階段，并且，影響男女性的壽命。自然的生殖干細(xì)胞不僅能分化形成包括精子和卵子在內(nèi)的配子，具有生殖功能， 還是一種能夠分化形成多種細(xì)胞和組織的多能干細(xì)胞，具有再生性修復(fù)功能；而且，生殖干細(xì)胞還具有一定程度的增殖和傳代能力，是唯一的能夠復(fù)制和傳遞遺傳信息的干細(xì)胞。所以，自體生殖干細(xì)胞在生殖系統(tǒng)的疾病和損傷的治療領(lǐng)域，在男女性不孕不育的修復(fù)治療應(yīng)用領(lǐng)域，在抗衰老保健和延長壽命的應(yīng)用領(lǐng)域以及建立自體生殖干細(xì)胞庫的領(lǐng)域都有著十分重要的價值和意義?，F(xiàn)在國際上主要采用兩種方法制備生殖干細(xì)胞。一種方法是通過自然的胚胎干細(xì)胞體外分化形成異體生殖細(xì)胞，應(yīng)用于研究領(lǐng)域；第二種方法是從睪丸或卵巢分離培養(yǎng)制備自體生殖干細(xì)胞，應(yīng)用不孕不育的治療領(lǐng)域，分離培養(yǎng)耗時困難，生殖細(xì)胞來源困難，獲取數(shù)量極其稀少。體細(xì)胞是干細(xì)胞順向分化產(chǎn)生的，具有某些具體功能的子代細(xì)胞。體細(xì)胞的染色體DNA和干細(xì)胞的染色體DNA在基因結(jié)構(gòu)和基因的數(shù)量上并不存在差異。體細(xì)胞和干細(xì)胞之間的最主要的差別可能只是某些功能基因處于不同的活性表達(dá)狀態(tài)。功能基因表達(dá)的差異決定了細(xì)胞的具體功能和形態(tài)的差異。我們推測，干細(xì)胞向體細(xì)胞順向分化的程序啟動后，干細(xì)胞本身的干細(xì)胞特性決定基因的開關(guān)就被關(guān)閉，隨后，干細(xì)胞就分化形成了具有某種特定功能的體細(xì)胞；換句話說，在體細(xì)胞染色體DNA序列中仍然存在生殖干細(xì)胞特性決定基因，例如0ct4、Nanog, C_kit、Dazl和Mvh基因等，這些基因只是處于關(guān)閉或靜止?fàn)顟B(tài)。利用某些物質(zhì)打開體細(xì)胞DNA序列中的生殖干細(xì)胞特性決定基因0ct4、NanOg、C-kit、 Dazl和Mvh等基因開關(guān)，這些體細(xì)胞就可能重新逆向分化而形成新的自體生殖干細(xì)胞。在本項發(fā)明中，從血液單個核細(xì)胞等人的體細(xì)胞逆向分化，迅速產(chǎn)生百億數(shù)量級別的自體生殖干細(xì)胞，不僅為疾病的潛在治療和抗衰老保健提供了一種新的獨(dú)特的多能干細(xì)胞，而且也為每一個不同年齡的人提供了建立自體生殖干細(xì)胞庫，永久保存具有獨(dú)特遺傳信息的自體生殖細(xì)胞的潛在可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解的技術(shù)問題是研發(fā)一種新的人的體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生自體生殖干細(xì)胞的干細(xì)胞生產(chǎn)調(diào)控技術(shù)，在不改變?nèi)说捏w細(xì)胞染色體DNA序列，不插入任何外來基因或DNA片段的情況下，應(yīng)用含有某些植物提取物和蛋白的一系列配方，在體外重新激活體細(xì)胞DNA序列中的生殖干細(xì)胞特性決定基因開關(guān)，使這些體細(xì)胞重新逆向分化而形成新的生殖干細(xì)胞；另外，經(jīng)冰凍長期保存植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體生殖干細(xì)胞，建立個人的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞庫。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一個目的是提供使人的體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生自體生殖干細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供采用該方法產(chǎn)生的自體生殖干細(xì)胞以及其在制備治療多種疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個目的是提供在上述方法中所采用的含有植物提取物和蛋白的多種細(xì)胞培養(yǎng)液以及該培養(yǎng)液的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還提供相應(yīng)的用于制備自體生殖干細(xì)胞的試劑盒。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一方面，本發(fā)明提供一種使人的體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生自體生殖干細(xì)胞的方法，其中，所述方法包括將人的體細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)液Bl中培養(yǎng)2-3天，所述細(xì)胞培養(yǎng)液Bl為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、鹿茸提取物5_100mg/ml、Υ-276321-25 μ Μ、干細(xì)胞因子(Stem cell factor) 1-lOOng/ml、白細(xì)胞介素 3 (IL-3) 1-lOOng/ml、白細(xì)胞介素 6(IL-6) 1-lOOng/ml ；然后換用細(xì)胞培養(yǎng)液B2培養(yǎng)6_9天，所述細(xì)胞培養(yǎng)液B2為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5_100mg/ ml、促紅細(xì)胞生成素(EPO) Ι-lOOng/ml、干細(xì)胞因子Ι-lOOng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (bFGF) l-100ng/ml、Υ-276321-25 μ Μ、白細(xì)胞介素 3 l-100ng/ml、白細(xì)胞介素 61-100ng/ ml、白細(xì)胞介素11 (IL-11) l-100ng/ml，從而獲得植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞。優(yōu)選地，在5% CO2和37°C條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。在上述方法中，所述人的體細(xì)胞包括但不限于人的皮膚細(xì)胞、血液有核細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、胎盤細(xì)胞。優(yōu)選地，在將人的體細(xì)胞以細(xì)胞培養(yǎng)液Bl培養(yǎng)之前，先以2-5X IO6的密度，在5% CO2和37°C條件下培養(yǎng)M-48小時。優(yōu)選地，先將細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)液Bl中培養(yǎng)3天，所述細(xì)胞培養(yǎng)液Bl為含有淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ、干細(xì)胞因子10ng/ml、白細(xì)胞介素3 10ng/ml、白細(xì)胞介素6 10ng/ml的RPMI1640 ；然后換用細(xì)胞培養(yǎng)液B2培養(yǎng)6-8天，所述細(xì)胞培養(yǎng)液B2為含有淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、促紅細(xì)胞生成素10ng/ml、干細(xì)胞因子10ng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子10ng/ml、Y-27632 10 μ Μ、白細(xì)胞介素3 10ng/ml、白細(xì)胞介素6 10ng/ml、白細(xì)胞介素11 10ng/ml的RPMI 1640，從而獲得植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞。上述方法還包括采用細(xì)胞培養(yǎng)液B3對獲得的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和傳代，所述細(xì)胞培養(yǎng)液B3為RPMI 1640，并含有鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5-100mg/ml、激活素A(Activin A) l-lOOng/ml、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (⑶NF) l-100ng/ml、促紅細(xì)胞生成素(EPO) l-100ng/ml、干細(xì)胞因子l-100ng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子Ι-lOOng/ml、白細(xì)胞介素3 l-lOOng/ml、白細(xì)胞介素61-lOOng/ml、白細(xì)胞介素 lll-100ng/ml、胰島素 l-100ng/ml ；優(yōu)選地，當(dāng)培養(yǎng)植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞至100%密度后，1 3稀釋傳代，繼續(xù)用細(xì)胞培養(yǎng)液B3培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述細(xì)胞的擴(kuò)增傳代在5% CO2和37°C條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，采用細(xì)胞培養(yǎng)液B3為含有鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、激活素A lOng/ml、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子lOng/ml、促紅細(xì)胞生成素lOng/ml、干細(xì)胞因子lOng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子lOng/ml、白細(xì)胞介素3 lOng/ml、白細(xì)胞介素6 10ng/ml、白細(xì)胞介素 11 10ng/ml、胰島素 10ng/ml 的 RPMI 1640。所述方法還包括冷凍保存使體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生的自體生殖干細(xì)胞的步驟；優(yōu)選地，所述冷凍保存方法為將產(chǎn)生的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞以IxIOltVml的細(xì)胞密度與10%二甲基亞砜和10%低分子右旋糖酐濃度混合，降溫至-80°C，然后轉(zhuǎn)移到_186°C液氮中深低溫保存。另一方面，本發(fā)明提供由上述方法制備的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞。本發(fā)明還提供所述的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞的應(yīng)用，優(yōu)選地，本發(fā)明提供該自體生殖干細(xì)胞在制備用于治療男女性不孕不育的藥物和用于治療涉及器官再生再造和修復(fù)的疾病藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述疾病為卵巢衰竭；優(yōu)選地，本發(fā)明提供該自體生殖干細(xì)胞在建立自體生殖干細(xì)胞庫中的應(yīng)用。又一方面，本發(fā)明提供用于使人的體細(xì)胞逆向分化的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液選自細(xì)胞培養(yǎng)液Bi、B2和B3，所述細(xì)胞培養(yǎng)液Bl為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物 5-100mg/ml、鹿茸提取物 5-100mg/ml、Υ-276321-25μΜ、干細(xì)胞因子 Ι-lOOng/ml、白細(xì)胞介素3 l-100ng/ml、白細(xì)胞介素6 Ι-lOOng/ml ；所述細(xì)胞培養(yǎng)液B2為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5-100mg/ml、促紅細(xì)胞生成素l-lOOng/ml、干細(xì)胞因子l-lOOng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子I-IOOng/ ml、Υ-276321-25μΜ、白細(xì)胞介素31-100ng/ml、白細(xì)胞介素61-100ng/ml、白細(xì)胞介素 lll-100ng/ml ；所述細(xì)胞培養(yǎng)液B3為RPMI 1640，并含有鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5-100mg/ml、激活素A l-lOOng/ml、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子l-lOOng/ml、促紅細(xì)胞生成素l-lOOng/ml、干細(xì)胞因子l-lOOng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子l-lOOng/ml、白細(xì)胞介素31-100ng/ml、白細(xì)胞介素6 Ι-lOOng/ml、白細(xì)胞介素11 Ι-lOOng/ml、胰島素 l-100ng/ml。此外，本發(fā)明提供所述細(xì)胞培養(yǎng)液Bl和B2在培養(yǎng)人的體細(xì)胞使之逆向分化產(chǎn)生自體生殖干細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述細(xì)胞培養(yǎng)液B3在自體生殖干細(xì)胞擴(kuò)增和傳代中的應(yīng)用。再一方面，本發(fā)明提供一種用于制備自體生殖干細(xì)胞的試劑盒，其中所述試劑盒包括細(xì)胞培養(yǎng)液Bl和B2 ；優(yōu)選地，所述試劑盒進(jìn)一步包括人的體細(xì)胞；所述體細(xì)胞包括但不限于人的皮膚細(xì)胞、血液有核細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、胎盤細(xì)胞。
優(yōu)選地，所述試劑盒進(jìn)一步包括細(xì)胞培養(yǎng)液B3。本發(fā)明還提供所述試劑盒在制備自體生殖干細(xì)胞和用于治療男女性不孕不育的藥物和用于治療涉及器官再生再造和修復(fù)的疾病藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述疾病為卵巢衰竭。本發(fā)明還提供所述試劑盒在建立植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞庫的應(yīng)用。以下是本發(fā)明的詳細(xì)描述為完成本發(fā)明涉及到以下技術(shù)問題(1)選用什么樣的人的體細(xì)胞作為逆向分化生產(chǎn)植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞的原料細(xì)胞；(2)怎樣處理和培養(yǎng)各種原料細(xì)胞；(3)怎樣使原料細(xì)胞逆向分化生產(chǎn)植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞；(4)怎樣擴(kuò)增傳代植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞；(5)怎樣檢測生產(chǎn)的人自體生殖干細(xì)胞；(6)怎樣冰凍長期保存植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體生殖干細(xì)胞；(7)怎樣建立植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體生殖干細(xì)胞庫的系統(tǒng)過程以及方法。因此，本發(fā)明的發(fā)明目的可以通過下述方法得以實現(xiàn)選用的人的原料體細(xì)胞可以是A.臍帶血，B.胎盤，C.細(xì)胞專業(yè)公司商品化提供的非永生化人的各種體細(xì)胞株，D.細(xì)胞專業(yè)公司商品化提供的永生化人的各種體細(xì)胞株， E.常規(guī)血庫保存的血液和白細(xì)胞懸液，F(xiàn).新鮮分離制備的人的皮膚細(xì)胞、血液有核細(xì)胞、 脂肪細(xì)胞等等；G.因手術(shù)切除而廢棄的部分健康組織器官，如腦、肌肉、肝、脾、腎、骨、和脂肪組織等。選用的人的原料體細(xì)胞可以是人的皮膚細(xì)胞、血液有核細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、胎盤細(xì)胞。選用的原料體細(xì)胞的培養(yǎng)包括以2-5 X IO6的密度，用DMEM等相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液在5% (X)2和37°C條件下培養(yǎng)M-48小時。使原料細(xì)胞逆向分化生產(chǎn)人自體生殖干細(xì)胞包括將相應(yīng)的原料體細(xì)胞用DMEM 等相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液在5%0)2和371條件下培養(yǎng)M-48小時后，換用細(xì)胞培養(yǎng)液B1(RPMI 1640、淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、Y_2763210 μ Μ、干細(xì)胞因子10ng/ml、白細(xì)胞介素310ng/ml、白細(xì)胞介素610ng/ml)繼續(xù)在5% CO2和37°C條件下培養(yǎng)2-3天，然后換用細(xì)胞培養(yǎng)液B2 (RPMI 1640、淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物 50mg/ml、促紅細(xì)胞生成素lOng/ml、干細(xì)胞因子lOng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子IOng/ ml、Y-27632 10 μ Μ、白細(xì)胞介素3 10ng/ml、白細(xì)胞介素6 10ng/ml、白細(xì)胞介素11 IOng/ ml)繼續(xù)在5% CO2和37°C條件下培養(yǎng)6_9天。產(chǎn)生的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞可以采用以下步驟擴(kuò)增和傳代用細(xì)胞培養(yǎng)液B3 (RPMI 1640、鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、激活素A 10ng/ml、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子lOng/ml、促紅細(xì)胞生成素lOng/ml、干細(xì)胞因子lOng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子10ng/ml、白細(xì)胞介素3 lOng/ml、白細(xì)胞介素6 lOng/ml、白細(xì)胞介素11 10ng/ml、胰島素lOng/ml)繼續(xù)在5% CO2和37°C條件下培養(yǎng)植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞至100%密度后，1 3稀釋傳代，繼續(xù)用細(xì)胞培養(yǎng)液B3培養(yǎng)；根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所獲得的人自體生殖干細(xì)胞可以通過以下方法進(jìn)行
7檢測利用生殖干細(xì)胞的特異細(xì)胞表型0ct4、Nanog, C_kit、Dazl和Mvh等作為檢測指標(biāo)， 分別采用流式細(xì)胞儀、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和Westernblot蛋白印跡技術(shù)檢測生殖干細(xì)胞的生成速度、生成率、生成數(shù)量和純度(0ct4、Nanog, C_kit、Dazl和Mvh等作為檢測指標(biāo)及檢測方法參考王毓斌、陳斌，胚胎干細(xì)胞體外分化為生殖細(xì)胞的研究進(jìn)展，生殖與避孕，第 28 卷第 9 期；Lacham-Kaplan 0，Chy H，Trounson A(2006)Testicular cell conditioned medium supports differentiation of embryonic stem cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells 24 :266-273 ； Jinlian Hua, Kuldip Sidhu (2008). Recent Advances in the Derivation of Germ Cells from the Embryonic Stem Cells. Stem cells and development 17:399-411)。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，所產(chǎn)生的植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體生殖干細(xì)胞經(jīng)冰凍長期保存吹打懸浮貼壁生長的植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞并收集到50ml毫升的離心管內(nèi)，在離心機(jī)內(nèi)以1500rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。制備的植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞以IXlOicVml和DMSO混合，以10%二甲基亞砜和10%低分子右旋糖酐濃度混合，降溫至_80°C，然后轉(zhuǎn)移到-186°C液氮中深低溫保存。本發(fā)明的技術(shù)方法可應(yīng)用于男女性不孕不育癥的治療，并適用于自體干細(xì)胞的抗衰老保健，利用巨額數(shù)量的自體生殖干細(xì)胞再生性修復(fù)全身各組織器官的衰老變性，尤其是衰竭卵巢的再造，可以恢復(fù)組織器官的年青結(jié)構(gòu)及生理功能，抗衰老及延年益壽。所產(chǎn)生的自體生殖干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化在避孕藥開發(fā)、人口調(diào)控、瀕危物種的保存、動物育種和轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)方面都有重大作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下幾個優(yōu)點(diǎn)一、本發(fā)明不同于已有的利用基因重組技術(shù)誘導(dǎo)體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生干細(xì)胞(iP 干細(xì)胞)，提供了一種新的體細(xì)胞逆向分化，產(chǎn)生人自體生殖干細(xì)胞的生產(chǎn)調(diào)控技術(shù)，利用植物提取物和蛋白配方技術(shù)誘導(dǎo)體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生的干細(xì)胞(Plants and Proteins induced pluripotent stem cell, PPiPS干細(xì)胞)，使得細(xì)胞結(jié)果接近于自然干細(xì)胞，安全性高。具體而言，本發(fā)明通過采用人的常規(guī)的體細(xì)胞，在不改變體細(xì)胞染色體DNA序列，不插入任何外來基因或DNA片段的情況下，應(yīng)用經(jīng)過篩選優(yōu)化設(shè)計的植物提取物和蛋白配方使體細(xì)胞重新逆向分化而形成自體生殖干細(xì)胞，為解決不孕不育治療領(lǐng)域目前所存在的困難提供了新的思路和途徑，克服了從睪丸或卵巢分離制備自體生殖干細(xì)胞中分離培養(yǎng)耗時困難、生殖細(xì)胞來源困難、獲取數(shù)量極其稀少的缺陷。二、本發(fā)明的方法可以直接采用來自患者的體細(xì)胞，使該體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生自體生殖干細(xì)胞，應(yīng)用此自體生殖干細(xì)胞避免了采用異體/異種干細(xì)胞移植帶來的免疫排斥，為臨床應(yīng)用提供了顯著的便利條件。三、采用本發(fā)明的方法制備的生殖干細(xì)胞具有正常2倍體的染色體核型；在兩組裸鼠移植試驗中，裸鼠皮下移植注射1 X IO8個植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞或1 X IO8個人自然胚胎干細(xì)胞，觀察接種部位有否腫瘤形成，連續(xù)觀察90天后，發(fā)現(xiàn)采用植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞的試驗組10只裸鼠無一例產(chǎn)生腫瘤，人胚胎干細(xì)胞試驗組10只裸鼠全部產(chǎn)生腫瘤，因此本發(fā)明的植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞具有較高的安全性。本發(fā)明還是一種可以在任何年齡的人個體中生產(chǎn)生殖干細(xì)胞的新技術(shù)方法。四、已證明采用本發(fā)明的方法可以使200ml人周圍血液在2周內(nèi)產(chǎn)生幾百億數(shù)量級別的第1代自體/異體生殖干細(xì)胞，生產(chǎn)速度快，產(chǎn)量巨大，純度達(dá)到15-50%，可以在任何年齡階段的人個體中，短期內(nèi)迅速生產(chǎn)巨額數(shù)量的自體生殖干細(xì)胞。利用生殖干細(xì)胞的特異表型作為檢測指標(biāo)，各種植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體干細(xì)胞的生產(chǎn)工藝流程可以被嚴(yán)格地、多次地、系統(tǒng)地進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測，因此，作為自體種子細(xì)胞和再生修復(fù)細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)、自體組織器官工程和自體生殖干細(xì)胞生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域， 植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體生殖干細(xì)胞可能具有良好的潛在應(yīng)用前景，還具有大規(guī)模工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)自體生殖干細(xì)胞的可能性。五、本發(fā)明的方法還適用于建立自體生殖干細(xì)胞庫，長期永久保存自體生殖干細(xì)胞及個人獨(dú)特的遺傳信息，是一種可以在任何年齡的人個體中建立自體生殖干細(xì)胞庫的新技術(shù)方法。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施例，其中圖1中，I-A為血液單個核細(xì)胞PBMC(周圍血單個核細(xì)胞，即原料細(xì)胞)；1_B為植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞 PPiPGC(Plants and Proteins induced primordial germ cell)0圖2為應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞的Nanog、 oct4、Klf4和S0X2特異表型。圖3為應(yīng)用Western blot蛋白印跡技術(shù)檢測植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞的 Nanog、oct4、Klf4和S0X2特異表型，PBMC為周圍血單個核細(xì)胞(原料細(xì)胞)。圖4為應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞的c-kit、 Daz 1、Mvh和Fragi 1 i s特異表型。PPiPGC_P2為第2代植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞 PPiPGC(Plants and Proteins induced primordial germ cell)。圖5中，圖5-A為第3代植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞；5_B為第6代植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞。
具體實施例方式通過下面的詳述，將對本發(fā)明的操作方法及特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)作進(jìn)一步說明，當(dāng)然，應(yīng)該指出的是盡管本文描述的以下幾種實施例，人們也可以根據(jù)本發(fā)明的基礎(chǔ)，提出各種變化和個性的形式也是可能的。實施例中采用的培養(yǎng)液為細(xì)胞培養(yǎng)液Bl=RPMI 1640，含淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、 Y-27632 1(^] 、干細(xì)胞因子101^/1111、白細(xì)胞介素3 10ng/ml、白細(xì)胞介素6 10ng/ml ；細(xì)胞培養(yǎng)液B2 =RPMI 1640,含淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、促紅細(xì)胞生成素lOng/ml、干細(xì)胞因子lOng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子 10ng/ml、Y-27632 10 μ Μ、白細(xì)胞介素3 10ng/ml、白細(xì)胞介素6 10ng/ml、白細(xì)胞介素11 10ng/ml ；細(xì)胞培養(yǎng)液B3 =RPMI 1640，含鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、激活素 A lOng/ml、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子lOng/ml、促紅細(xì)胞生成素lOng/ml、干細(xì)胞因子10ng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子lOng/ml、白細(xì)胞介素3 lOng/ml、白細(xì)胞介素6 IOng/ ml、白細(xì)胞介素11 10ng/ml、胰島素10ng/ml。實施例中采用的試劑及其來源淫羊藿提取物、鹿茸提取物和水蛭提取物購自河南天然植物原料廠和鄭州荔諾生物科技有限公司；Y-27632購自Sigma公司；干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素11、促紅細(xì)胞生成素、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、激活素A、膠質(zhì)細(xì)胞源性營養(yǎng)因子、 胰島素購自R&D公司。實施例采用周圍靜脈血、臍帶血作為原料細(xì)胞，牛產(chǎn)和長期保存棺物和蛋白誘導(dǎo)件牛殖干細(xì)胞周圍靜脈血和臍帶血(北京五洲女子醫(yī)院、北京安定門醫(yī)院、科研人員捐獻(xiàn)等)的無菌采集。采集周圍靜脈血/臍帶血前應(yīng)征得供血本人或直系親屬的同意，并記錄供血本人及家庭的遺傳和傳染病史以及醫(yī)院所有相關(guān)的病毒檢查結(jié)果。周圍靜脈血/臍帶血常規(guī)抗凝，4°C保存。在M小時之內(nèi)送至干細(xì)胞制作生產(chǎn)中心。在中心需要再做相應(yīng)的病毒檢測后，進(jìn)入中心電腦登記程序，在記錄相應(yīng)的條形碼編號后，血液標(biāo)本進(jìn)入無菌干細(xì)胞生產(chǎn)車間。在干細(xì)胞生產(chǎn)車間，血液標(biāo)示應(yīng)用Ficoll標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)(《現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù)》 第十二章第288頁)分離單個核細(xì)胞后，進(jìn)行單個核細(xì)胞計數(shù)。應(yīng)用DMEM培養(yǎng)液以2_5 X IO6 的密度，在5% CO2和37°C條件下培養(yǎng)M-48小時；換用細(xì)胞培養(yǎng)液Bl繼續(xù)在5% CO2和 37°C條件下培養(yǎng)72小時，然后換用細(xì)胞培養(yǎng)液B2繼續(xù)在5% C02和37°C條件下培養(yǎng)9_15天。對生產(chǎn)的人自體生殖干細(xì)胞進(jìn)行了檢測利用生殖干細(xì)胞的特異細(xì)胞表型 Nanog、0ct4、Klf4、S0X2、c-kit、Dazl、Mvh和Fragilis等作為檢測指標(biāo)，在換用細(xì)胞培養(yǎng)液 B2繼續(xù)培養(yǎng)后的第6、第9和第12天，分別采用流式細(xì)胞儀、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和Western blot蛋白印跡技術(shù)(《現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù)》第六章、第七章、第十八章)檢測生殖干細(xì)胞的生成速度、生成率、生成數(shù)量和純度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，200ml周圍靜脈血/80ml臍帶血的單個核細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)液B2培養(yǎng)后的第6-9天，植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞的產(chǎn)量可達(dá) 1-2. 5X1011 (其它實驗結(jié)果請見附圖1-4)。顯微鏡顯示原料細(xì)胞和誘導(dǎo)原料細(xì)胞所產(chǎn)生的自體生殖干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，分別如圖IA和IB所示。圖2中示出了應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測生產(chǎn)的誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞的0ct4和Nanog特異表型。應(yīng)用flfestern blot蛋白印跡技術(shù)檢測植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞(PPiPGC)的0ct4、NanOg、Klf4和S0X2特異表型，并且以原料細(xì)胞(周圍血單個核細(xì)胞，PBMC)作為對照。由電泳結(jié)果可見，PPiPGC干細(xì)胞0ct4、Nanog、Klf4和S0X2特異表型陽性，而PBMC原料細(xì)胞0ct4、Nanog, Klf4和S0X2特異表型陰性。圖4為應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測生產(chǎn)的誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞的c-kit、Dazl、Mvh和Fragilis特異表型的結(jié)果。 如圖所示，用B2培養(yǎng)液培養(yǎng)第6天，c-kit、Dazl.Mvh和Fragilis特異表型的生成速度分別為 6. 87%,28. 14%,37. 13%和 16. 75%。對產(chǎn)生的植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體生殖干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增傳代。用細(xì)胞培養(yǎng)液 B3 (Medium)繼續(xù)在5% CO2和37°C條件下培養(yǎng)植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞至100% 密度后，1 3稀釋傳代，繼續(xù)用細(xì)胞培養(yǎng)液B3培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果請參考圖5，其中圖5-A為
10第3代植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞，圖5-B為第6代植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞。所產(chǎn)生的植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體生殖干細(xì)胞可以經(jīng)冰凍長期保存。吹打懸浮貼壁生長的植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞并收集到50ml毫升的離心管內(nèi)，在離心機(jī)內(nèi)以 1500rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。制備的植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞以IXlOicVml和 DMSO混合，以10%二甲基亞砜和10%低分子右旋糖酐濃度混合，降溫至-80°C，然后轉(zhuǎn)移到-186°C液氮中深低溫保存，建立植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞庫。實施例2本實施例對實施例1中制備的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞進(jìn)行裸鼠移植的安全性研究，具體如下。在兩組裸鼠移植試驗中，裸鼠皮下移植注射IX IO8個植物和蛋白誘導(dǎo)性的生殖干細(xì)胞或1 X IO8個人自然生殖干細(xì)胞(海南醫(yī)學(xué)院生殖中心贈送)，觀察接種部位有否腫瘤形成。連續(xù)觀察90天。結(jié)果顯示，植物和蛋白誘導(dǎo)性生殖干細(xì)胞試驗組10只裸鼠無一例產(chǎn)生腫瘤，具有較高的安全性；而人自然生殖干細(xì)胞試驗組10只裸鼠全部產(chǎn)生腫瘤。
權(quán)利要求
1.一種使人的體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生自體生殖干細(xì)胞的方法，其中，所述方法包括將人的體細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)液Bl中培養(yǎng)2-3天，所述細(xì)胞培養(yǎng)液Bl為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、鹿茸提取物5-100mg mg/ml、Y-27632 1-25 μ Μ、干細(xì)胞因子1-lOOng/ml、白細(xì)胞介素3 l-lOOng/ml、白細(xì)胞介素6 l-100ng/ml ；然后換用細(xì)胞培養(yǎng)液B2培養(yǎng)6-9天，所述細(xì)胞培養(yǎng)液B2為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、 鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5-100mg/ml、促紅細(xì)胞生成素1-lOOng/ml、干細(xì)胞因子l-100ng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子l-100ng/ml、Υ-27632 1_25μΜ、白細(xì)胞介素3 1-lOOng/ml、白細(xì)胞介素6 l-lOOng/ml、白細(xì)胞介素lll-lOOng/ml，從而獲得植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞；優(yōu)選地，在5% CO2和37°C條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述人的體細(xì)胞包括但不限于人的臍帶血細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、血液有核細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等；優(yōu)選地，在人的體細(xì)胞以細(xì)胞培養(yǎng)液Bl培養(yǎng)之前，先以2-5X106的密度，在5% CO2和 37 °C條件下培養(yǎng)M-48小時；優(yōu)選地，先將細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)液Bl中培養(yǎng)3天，所述細(xì)胞培養(yǎng)液Bl為含有淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ、干細(xì)胞因子10ng/ml、白細(xì)胞介素3 10ng/ml、白細(xì)胞介素6 10ng/ml的RPMI1640 ；然后換用細(xì)胞培養(yǎng)液B2培養(yǎng)6-8天，所述細(xì)胞培養(yǎng)液B2為含有淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、促紅細(xì)胞生成素10ng/ml、干細(xì)胞因子10ng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子10ng/ml、Y-27632 10 μ Μ、白細(xì)胞介素3 10ng/ml、白細(xì)胞介素6 10ng/ml、白細(xì)胞介素11 10ng/ml的RPMI 1640，從而獲得植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述方法還包括采用細(xì)胞培養(yǎng)液B3對獲得的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和傳代，所述細(xì)胞培養(yǎng)液B3為RPMI 1640，并含有鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5_100mg/ml、激活素A l-lOOng/ml、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子1-lOOng/ml、促紅細(xì)胞生成素1-lOOng/ml、干細(xì)胞因子1-lOOng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子1-lOOng/ml、白細(xì)胞介素3 l-lOOng/ml、白細(xì)胞介素6 1-lOOng/ml、白細(xì)胞介素 11 l-100ng/ml、胰島素 l-100ng/ml ；優(yōu)選地，當(dāng)培養(yǎng)植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞至100%密度后，1 3稀釋傳代，繼續(xù)用細(xì)胞培養(yǎng)液B3培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述細(xì)胞的擴(kuò)增傳代在5% CO2和37°C條件下進(jìn)行；優(yōu)選地，所述細(xì)胞培養(yǎng)液B3為含有鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、激活素A lOng/ml、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子lOng/ml、促紅細(xì)胞生成素lOng/ml、干細(xì)胞因子 10ng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子lOng/ml、白細(xì)胞介素3 lOng/ml、白細(xì)胞介素6 IOng/ ml、白細(xì)胞介素 11 10ng/ml、胰島素 10ng/ml 的 RPMI 1640。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中，所述方法還包括冷凍保存使體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生的自體生殖干細(xì)胞的步驟；優(yōu)選地，所述冷凍保存步驟包括將產(chǎn)生的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞以 IXlO1Vml的細(xì)胞密度與10%二甲基亞砜和低分子右旋糖酐濃度混合，降溫至_80°C，然后轉(zhuǎn)移到-186°C液氮中深低溫保存。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法制備的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞在制備用于治療男女性不孕不育的藥物和用于治療涉及器官再生再造和修復(fù)的疾病藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述疾病為卵巢衰竭；優(yōu)選地，所述自體生殖干細(xì)胞用于建立自體生殖干細(xì)胞庫。
7.用于使人的體細(xì)胞逆向分化的細(xì)胞培養(yǎng)液，其中，所述培養(yǎng)液選自細(xì)胞培養(yǎng)液Bi、 B2和B3，所述細(xì)胞培養(yǎng)液Bl為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、鹿茸提取物 5-100mg/ml、Υ-276321-25 μ Μ、干細(xì)胞因子 1-lOOng/ml、白細(xì)胞介素 3 Ι-lOOng/ml、白細(xì)胞介素6 l-100ng/ml ；所述細(xì)胞培養(yǎng)液B2為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5_100mg/ ml、鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5_100mg/ml、促紅細(xì)胞生成素l-100ng/ml、干細(xì)胞因子l-100ng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子l-100ng/ml、Υ-276321-25 μ Μ、白細(xì)胞介素 3 1-lOOng/ml、白細(xì)胞介素6 l-lOOng/ml、白細(xì)胞介素11 l-lOOng/ml ；所述細(xì)胞培養(yǎng)液B3 為RPMI 1640，并含有鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5-100mg/ml、激活素A I-IOOng/ ml、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子1-lOOng/ml、促紅細(xì)胞生成素1-lOOng/ml、干細(xì)胞因子 1-lOOng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子1-lOOng/ml、白細(xì)胞介素31-lOOng/ml、白細(xì)胞介素 6 l-100ng/ml、白細(xì)胞介素 11 l-100ng/ml、胰島素 l-100ng/ml。
8.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)液Bl和B2在培養(yǎng)人的體細(xì)胞使之逆向分化產(chǎn)生自體生殖干細(xì)胞中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)液B3在自體生殖干細(xì)胞擴(kuò)增和傳代中的應(yīng)用。
10.一種用于制備自體生殖干細(xì)胞的試劑盒，其中，所述試劑盒包括如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)液Bl和B2 ；優(yōu)選地，所述試劑盒進(jìn)一步包括人的體細(xì)胞；所述體細(xì)胞包括但不限于人的臍帶血細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、血液有核細(xì)胞、脂肪細(xì)胞；優(yōu)選地，所述試劑盒進(jìn)一步包括細(xì)胞培養(yǎng)液B3。
11.如權(quán)利要求10所述的試劑盒在制備自體生殖干細(xì)胞和用于治療男女性不孕不育的藥物以及用于治療涉及器官再生再造和修復(fù)的疾病藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述疾病為卵巢衰竭。
12.如權(quán)利要求10所述的試劑盒在建立植物和蛋白誘導(dǎo)性自體生殖干細(xì)胞庫的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種使人的體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生自體生殖干細(xì)胞的方法，所述方法包括采用含有不同植物提取物和蛋白成分的培養(yǎng)液分步驟培養(yǎng)人的體細(xì)胞，從而使所述體細(xì)胞逆向分化產(chǎn)生自體生殖干細(xì)胞。本發(fā)明的方法在2周內(nèi)產(chǎn)生幾百億數(shù)量級別的第1代自體生殖干細(xì)胞。這種植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體生殖干細(xì)胞具有與人自然生殖干細(xì)胞類似的細(xì)胞特異表型，并保持有相當(dāng)強(qiáng)的擴(kuò)增傳代能力。本發(fā)明適用于建立新型的自體生殖干細(xì)胞庫，長期永久保存自體生殖干細(xì)胞及個體遺傳信息，并在再生醫(yī)學(xué)的疾病治療和抗衰老保健、自體組織器官工程和自體生殖干細(xì)胞生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域，本發(fā)明的植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體生殖干細(xì)胞具有良好的潛在應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/074GK102399739SQ201010288959
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者林雄斌 申請人:林雄斌