一種抗黑色素瘤的干細胞貼劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術和再生醫(yī)學領域，具體涉及一種抗黑色素瘤的干細胞貼劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]惡性黑色素瘤是一種高度惡性的腫瘤，其發(fā)病率占到皮膚科腫瘤的第三位，且呈逐年上升的態(tài)勢。惡性黑色素瘤的惡性程度較高，且多發(fā)生轉移，預后比較嚴重?；颊叩乃劳雎室矔S著腫瘤侵襲的深度而增加。目前除了及早發(fā)現并行手術切除外，并無其他有效治療手段。但目前許多腫瘤在發(fā)現時已發(fā)生轉移，所以單純的手術切除很難達到根治的目的。而以放、化療為輔助手段對惡性黑色素瘤的治療收效甚微。所以尋求一種高效、安全的輔助治療手段正成為人類迫切的需求。
[0003]隨著近些年對間充質干細胞研宄的深入，人們發(fā)現干細胞具有自我更新、不斷增殖和高分化潛能，為腫瘤的治療提供了新的思路，即利用干細胞的增殖、定向分化、選擇性歸巢和分泌免疫細胞、NK細胞、細胞因子和組織因子的特性對腫瘤細胞進行殺傷，并對異常細胞進行快速修復。特別是間充質干細胞具有如下特點:(1)間充質干細胞的組織來源豐富，目前人們已成功的從骨髓、廢棄胚胎、臍血、羊膜、脂肪等組織中成功提取到間充質干細胞。(2)間充質干細胞易于進行體外擴增。(3)間充質干細胞體外基因轉染率高，且能穩(wěn)定表達轉染基因。(4)間充質干細胞的免疫源性較低，異體移植不易發(fā)生排異反應。(5)間充質干細胞具有向損傷以及腫瘤組織迀移的能力。已有研宄發(fā)現間充質干細胞參與腫瘤的多項病理過程，包括腫瘤的細胞增殖、凋亡和侵襲轉移，但在不同的腫瘤組織類型中其作用表現出很大的差異性，如乳腺癌、肺癌、結腸癌中，間充質干細胞促進腫瘤生長和轉移，而在卡波氏肉瘤、肝細胞癌、黑色素瘤中，間充質干細胞卻表現出抑制腫瘤細胞的生長作用?；谝陨戏N種優(yōu)點，間充質干細胞將可能成為一種理想的治療手段和載體，攜帶抗腫瘤藥物或者抗癌基因到達腫瘤組織，發(fā)揮抗腫瘤的作用。
[0004]黑色素瘤早期臨床表現為痣或色素斑迅速增大，隆起，破潰不愈，邊緣不整或有切跡、鋸齒，顏色改變、局部形成水泡、瘙癢、刺痛等。進而可出現衛(wèi)星灶、局部淋巴結腫大，移行轉移(原發(fā)病灶與區(qū)域引流淋巴結之間的皮下結節(jié)，通過淋巴管轉移)和遠處轉移。利用惡性黑色素瘤由于其特殊的解剖部位，易發(fā)生在皮膚層面，與內臟和四肢腫瘤不同的特性，使我們開發(fā)出一種針對惡性黑色素瘤并可用于皮膚層的干細胞貼劑，治療方式直接且見效快，增強腫瘤治療的預后。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種抗黑色素瘤的干細胞貼劑，本發(fā)明的干細胞貼劑具有間充質干細胞分子標志和生物學特性、免疫原性低，不發(fā)生免疫排斥，并添加針對黑色素瘤的有效因子等，可以有效治療和修復黑色素瘤。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述干細胞貼劑的制備方法，該方法采用來源廣泛的的干細胞產品，制備過程簡單、可靠、重現性好。
[0007]為實現上述目的，達到以上技術效果，本發(fā)明通過以下技術方案實現:
一種抗黑色素瘤的干細胞貼劑，由下述主要原料和基質部分制備而成，主要原料包括I X 16個來源于骨髓的間充質干細胞，1000U白細胞介素I1、100mg維生素C和20 μ I富血小板血漿，基質部分包括生物膜和醫(yī)用級粘貼層，其中所述的來源于骨髓的間充質干細胞優(yōu)選來自于胚胎骨髓組織的間充質干細胞。
[0008]本發(fā)明的一種抗黑色素瘤的干細胞貼劑中，至少包括IX 15個來源于骨髓的間充質干細胞，包括IX16個來源于骨髓的間充質干細胞。
[0009]上述的一種抗黑色素瘤的干細胞貼劑的制備方法，其特征是由下述步驟組成:來源于骨髓的間充質干細胞的制備，生物膜的制備和預處理，間充質干細胞生物膜的構建、間充質干細胞生物膜的誘導和抗黑色素瘤的干細胞貼劑形成。
[0010]所述的來源于骨髓的間充質干細胞的制備步驟具體是:分離提取來源于骨髓的間充質干細胞，混勻成單細胞懸液備用。
[0011]所述的生物膜的制備和預處理步驟具體是:制備高分子聚乙內酯多元醇-膠原復合生物膜作為基礎基質，在細胞接種前進行生物膜的預處理:將生物膜置入適宜大小的培養(yǎng)皿中，用3Μ的NaOH于37°C浸泡2小時，PBS緩沖液浸泡10次，每次15分鐘。
[0012]所述的間充質干細胞生物膜的構建步驟具體是:將上述步驟制備的生物膜置于培養(yǎng)皿底部，然后接種來源于骨髓的間充質干細胞單細胞懸液，所用的培養(yǎng)基為90%DMEM培養(yǎng)基，和10%胎牛血清替代品，連續(xù)培養(yǎng)48小時。
[0013]所述的抗黑色素瘤的干細胞貼劑的誘導步驟具體是:對上述步驟培養(yǎng)皿更換培養(yǎng)液，仍用90%DMEM培養(yǎng)基，和10%胎牛血清替代品，并添加TNF α ( α腫瘤壞死因子)誘導培養(yǎng)4-5小時，其中TNF α的誘導濃度為50_100ng/ml，然后將制備的生物膜用PBS清洗兩遍并置于37°C、5%C02細胞培養(yǎng)箱30分鐘后備用。
[0014]所述的抗黑色素瘤的干細胞貼劑的形成步驟具體是:將上述步驟制備的生物膜從培養(yǎng)箱中取出，添加1000U白細胞介素I1、100mg維生素C和20 μ I富血小板血漿，然后將生物膜置于由防粘層和粘貼層組成的醫(yī)用級粘膠層上，即制備完成抗黑色素瘤的干細胞貼劑。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
(O由于惡性黑色素瘤特殊的解剖部位，本發(fā)明干細胞貼劑不僅可以將間充質干細胞及特效因子直接作用于黑色素瘤病灶處，有效促進間充質干細胞的粘附、增殖，抑制腫瘤生長，同時發(fā)揮特效因子療效，直接作用于黑色素瘤病灶部位，增強對黑色素瘤的殺傷作用；直接作用于修復皮膚患處，也可提高治療后修復效果。
[0016](2)本發(fā)明的干細胞貼劑利用間充質干細胞構建，并添加了針對惡性黑色素瘤的特效因子。其中:a、骨髓源間充質干細胞不但可以增殖、定向分化、選擇性歸巢和分泌多種有效因子對黑色素瘤細胞進行殺傷，并對異常細胞進行快速修復，抑制黑色素瘤的生長和轉移的同時，可以攜帶抗腫瘤藥物到達腫瘤組織，發(fā)揮抗腫瘤的作用。b、白細胞介素II是淋巴細胞產生的一種糖蛋白，具有調節(jié)T淋巴細胞生長與分化、刺激機體免疫系統中天然殺傷細胞(LAK)的增殖等作用，能使黑色素瘤患者體內的淋巴細胞集中于腫瘤結節(jié)，刺激病人產生強力的免疫反應，以達治療腫瘤的作用。C、維生素C影響腫瘤凋亡基因表達，抑制DNA復合物合成，通過誘導分化，干擾細胞周期，來限制腫瘤細胞生長，促進凋亡；也可誘導T細胞產生，增加干擾素合成，促進免疫球蛋白形成、淋巴細胞增殖和分化，提高機體免疫力；可以參與體內的氧化還原反應、羥化反應，促進膠原蛋白合成，增加黑色素瘤創(chuàng)面愈合率。d、富血小板血漿是血漿成分，含豐富的血小板成分，有機體各種生長因子及細胞因子，能夠促進軟組織及硬組織的愈合；能有效促進干細胞的增殖，及成骨，成脂，成軟骨分化能力，并且無免疫源性，不會引起機體的免疫排斥反應等；富血小板血漿含各種純天然的生長因子，不需要病毒轉染，也不像人工合成的生長因子那樣單一，缺乏穩(wěn)定性，其中的生長因子在很多研宄中已經證明具有促進血管形成，促進成纖維細胞生長，促進骨組織形成等功能，因此，富血小板血漿結合間充質干細胞在創(chuàng)面尤其是難治性創(chuàng)面如惡性黑色素瘤創(chuàng)面的的修復中起到不可或缺的作用，在組織工程及再生醫(yī)學領域的應用前景十分廣闊。
【附圖說明】
[0017]此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構成本申請中的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中:
圖1為本發(fā)明一種抗黑色素瘤的干細胞貼劑的制備步驟流程圖；
圖2為本發(fā)明具體實施例中黑色素瘤小鼠動物模型實驗結果:實驗小鼠瘤體體積變化對比圖；
圖3為本發(fā)明具體實施例中黑色素瘤小鼠動物模型實驗結果:實驗小鼠腫瘤瘤體抑瘤率;
圖4為本發(fā)明具體實施例中黑色素瘤小鼠動物模型實驗結果:實驗小鼠生存率曲線圖。
【具體實施方式】
[0018]下面將參考附圖并結合實施例，來詳細說明本發(fā)明。
[0019]具體實施例1:如圖1所示的本發(fā)明一種抗黑色素瘤的干細胞貼劑的制備步驟流程圖，所述的方法包括以下步驟:
步驟1:來源于骨髓的間充質干細胞的制備
無菌條件下取自然流產胎兒股骨骨髓(實驗用人胚胎骨髓來源間充質干細胞均為自然流產胎兒，流產胎兒母親知情并簽署同意書同意流產胎兒用于干細胞實驗研宄)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100U/mL，含鏈霉素100 μ g/mL, pH7.4)的培養(yǎng)液沖洗股骨骨髓入平皿，用注射器適當抽吸吹打，使骨髓組織細胞基本均勻分散，然后計數，以IXlO4 /cm2密度接種于培養(yǎng)皿。置入37°C