專利名稱：：干細(xì)胞、非去極化肌松藥和透明質(zhì)酸復(fù)合抗衰老作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于消除或預(yù)防面部皺紋的組合物，特別涉及胚胎干細(xì)胞提取物、非去極化肌松藥和透明質(zhì)酸，以及含有胚胎干細(xì)胞提取物和透明質(zhì)酸以及其它通常應(yīng)用的具有護(hù)膚功能的物質(zhì)的組合物。
背景技術(shù)：
：從醫(yī)學(xué)組織學(xué)的觀點(diǎn)說，皺紋是皮膚中真皮組織里的彈力纖維、結(jié)締組織和肌膚纖維隨著年齡的增長而退化萎縮，以及表皮和真皮內(nèi)的水分、脂肪和皮下脂肪的減少而產(chǎn)生的。1.面部肌肉運(yùn)動(dòng)頻發(fā)，如經(jīng)常抬頭、大笑、皺眉、皺鼻等也容易促進(jìn)皺紋的形成。2.隨著人們年齡的增長，肌力降低，面部肌肉收縮無力，皮膚的張力也隨之降低，因而產(chǎn)生皺紋。3.表皮組織水分的流失。在青春期，表皮組織內(nèi)的細(xì)胞不斷地生長，新陳代謝旺盛，在真皮組織中有一種“透明質(zhì)酸”的物質(zhì)，通過這種物質(zhì)，可使體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)、微量元素及豐富的水分通透皮膚表面。隨著年齡增長，表皮組織內(nèi)的皮膚干細(xì)胞分裂、增殖減緩，其他的表皮細(xì)胞生長緩慢，使體內(nèi)的“透明質(zhì)酸”也逐漸減少，這時(shí)皮膚也變得粗糙、形成皺紋。4.不良的環(huán)境因素。如紫外線、干燥的氣候等。5.精神因素，比如情緒不穩(wěn)定，波動(dòng)較大，精神過度緊張等。6.其他因素，如脾胃功能不和，內(nèi)分泌失調(diào)，體重過速減輕，化妝等。據(jù)研究，早期皺紋的形成基本都是與面部肌肉運(yùn)動(dòng)頻發(fā)有關(guān)。面部肌肉的運(yùn)動(dòng)是由神經(jīng)-肌肉興奮傳遞引起的。而神經(jīng)-肌肉興奮傳遞是通過軸突末端釋放乙酰膽堿、作用于肌膜上的乙酰膽堿受體改變其離子通道，引起膜的電位變化使肌膜去極化，進(jìn)而觸發(fā)了興奮-收縮耦聯(lián)，引起肌肉纖維收縮。目前市面上所用的肉毒素注射就主要是針對上述的面部肌肉運(yùn)動(dòng)頻發(fā)造成的皺紋。它的作用機(jī)理是，它能抑制周圍運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢突觸前膜乙酰膽堿釋放，阻斷神經(jīng)和肌肉之間的信息傳導(dǎo)，從而引起肌肉的松弛性麻痹。也可以說，肉毒素是由于麻痹了肌肉使得肌肉失去收縮能力而消除了皺紋。但是，肉毒素從來就被規(guī)定為劇毒藥品，超過一定劑量即可致人于死地。當(dāng)然，它用作除皺時(shí)劑量很小，理論上講是安全的，但其毒性和副作用畢竟是客觀存在的(高致命毒素除皺危險(xiǎn)大年輕半年換來三角眼世界科技報(bào)道日期2004-11-181009)。據(jù)資料記載，將肉毒素注射在魚尾紋或鼻紋處，由于離眼睛很近，眼瞼肌肉往往被麻痹，不少人的眼睛也會隨之變小(但可恢復(fù))。此外，由于肉毒素的毒副作用，注射后出現(xiàn)發(fā)燒、乏力、食欲欠佳的例子也不少。嚴(yán)重者還會出現(xiàn)復(fù)視、吞咽及呼吸困難等。國外還有注射肉毒素后發(fā)生心跳驟停的報(bào)道。因此，如何在有效地抑制面部肌肉收縮的同時(shí)確保其安全性是目前亟待解決的問題。應(yīng)用非去極化肌松藥可能是解決這一問題的有效方法。非去極化肌松藥(nondepolarizedmusclerelaxitant)，也能使肌肉失去收縮能力，但是其機(jī)理卻與肉毒素不同。它能與肌肉上面的受體結(jié)合，從而阻滯了乙酰膽堿與受體結(jié)合，防止了去極化發(fā)生，肌肉纖維也就無法收縮。非去極化肌松藥目前主要用作臨床麻醉的輔助用藥，具有安全，副作用小的特點(diǎn)。根據(jù)它的特性以及面部皺紋的形成原因，本發(fā)明人創(chuàng)造性地將它用于消除和預(yù)防面部皺紋，在此之前，還未見相關(guān)的報(bào)道。誘明質(zhì)酸(Hyaluronicacid，HA)，又名透明酸或玻璃酸，是一種大分子粘多糖，廣泛存在于生物體的結(jié)締組織中。在不同組織中HA的生理作用有所不同，如在皮膚中主要表現(xiàn)為保水作用。水解明膠，是膠原蛋白經(jīng)酶(酸或堿)水解的產(chǎn)物，水解明膠能使水份固定在皮膚和組織上，不僅可以抗老化、防皺紋、美容養(yǎng)顏，還能增加皮膚細(xì)胞再生，恢復(fù)肌膚彈性。胚胎干細(xì)胞,來源于囊胚受精卵經(jīng)過3-5天的發(fā)育，經(jīng)由桑葚胚而發(fā)育成囊胚，囊胚內(nèi)有一個(gè)由幾十個(gè)細(xì)胞所形成的細(xì)胞團(tuán)塊，在醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)稱之為內(nèi)細(xì)胞島。島內(nèi)的細(xì)胞稱為胚胎干細(xì)胞。隨著胚胎的發(fā)育，一部分干細(xì)胞不斷地增生，分化為身體組織的各種具有特異功能的細(xì)胞，而部分胚胎干細(xì)胞則保持干細(xì)胞的特點(diǎn)，維持其不斷自我更新的能力，在組織細(xì)胞受損時(shí)進(jìn)行修復(fù)。皮膚是人體的保護(hù)屏障，由于它位于人體的表面，所以受到外部環(huán)境的影響也大，其細(xì)胞的新陳代謝也比其他的組織細(xì)胞高，因而易于老化，其典型的特點(diǎn)是皮膚松弛、彈性減弱、皺紋的出現(xiàn)。如上所述，胚胎干細(xì)胞是一種最年輕的原始細(xì)胞，表皮細(xì)胞的損傷可刺激皮膚干細(xì)胞分裂、增生，它們也可合成和分泌多種細(xì)胞生長因子，刺激本身和其他細(xì)胞的增生、修復(fù)。美國科學(xué)家JamesThomson在1998年成功地分離了人體的胚胎干細(xì)胞，并在體外建立了人體胚胎干細(xì)胞系(Science，1998；282:1145)。這是人胚胎干細(xì)胞研究的一個(gè)重要的里程碑，隨作科學(xué)研究的深入，胚胎干細(xì)胞的研究成果不斷涌現(xiàn)，現(xiàn)在我們已可在培養(yǎng)皿中把胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)成不同的具有特殊功能的細(xì)胞，如皮膚的各種細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。胚胎干細(xì)胞也可用來進(jìn)行細(xì)胞替代治療，修復(fù)遭到損傷細(xì)胞和組織。由于胚胎干細(xì)胞是一種人體中最年輕、最具活力的細(xì)胞，它們的胞漿和培養(yǎng)液中含有豐富的多種促細(xì)胞生長因子，我們在本發(fā)明中用胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)夜和/或胚胎干細(xì)胞的提取物，結(jié)合非去極化肌松藥和透明質(zhì)酸等物質(zhì)，制成復(fù)方抗表皮衰老劑，具有明顯的面部和眼角的抗皺紋作用。本發(fā)明人通過創(chuàng)造性的勞動(dòng)，選擇出能夠與胚胎干細(xì)胞和非去極化肌松藥聯(lián)合應(yīng)用的其它具有皮膚養(yǎng)護(hù)作用的物質(zhì)，并利用適當(dāng)?shù)慕M合使其能夠充分發(fā)揮協(xié)同的消除或預(yù)防面部皺紋的作用。
發(fā)明內(nèi)容為了更有效地預(yù)防或消除面部皺紋，克服現(xiàn)有的A型肉毒毒素美容產(chǎn)品中的毒性缺陷，本發(fā)明通過發(fā)明者的創(chuàng)造性研究，提供了一種不僅能夠抑制、消除表情肌過度收縮所致的皺紋。而且，，而且能夠強(qiáng)力保持面部皮膚水分的組合物本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種預(yù)防或消除面部皺紋的組合物，其包含胚胎干細(xì)胞的提取物和非去極化肌松藥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物可以含任意的胚胎干細(xì)胞提取物和/或非去極化肌肉松弛劑；不過如同時(shí)含有這兩種成分，其抗皺作用則明顯加強(qiáng)。在本發(fā)明中，利用胚胎干細(xì)胞和/或非去極化肌松藥聯(lián)合應(yīng)用的其它具有皮膚養(yǎng)護(hù)作用的物質(zhì)，并利用適當(dāng)?shù)慕M合使其能夠充分發(fā)揮協(xié)同的消除或預(yù)防面部皺紋的作用。與現(xiàn)有的A型肉毒毒素相比較，能避免其造成的面部表情肌癱瘓的毒副作用。本發(fā)明所述術(shù)語“預(yù)防或消除皺紋”指所用的組合物可以預(yù)防面部皺紋，尤其是表情肌過度收縮所導(dǎo)致的皺紋；減輕、緩解、控制、改善或完全消除面部皺紋，尤其是表情肌過度收縮所導(dǎo)致的眼部皺紋。本發(fā)明所述術(shù)語“對照組”指由市場可購得的三種眼霜以及蘭州生物制品研究所的A型肉毒毒素。1.胚胎干細(xì)胞提取物如上所述，由于胚胎干細(xì)胞是一種人體中最年輕、最具活力的細(xì)胞，能夠不斷地分裂、增生，從而分化成身體組織的各種成熟的具有特異功能的組織細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)能夠合成、分泌多種促細(xì)胞生長因子，因此，在它們的胞漿和培養(yǎng)液中含有大量的表皮和真皮組織營養(yǎng)因子，在保持皮膚細(xì)胞的年輕化，維持其彈性，抗皺方面都有重要的功用。我們在本發(fā)明中用胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)夜和/或胚胎干細(xì)胞的提取物，和其他的成分制成復(fù)合的抗皮膚衰老劑。2.非去極化肌松藥多種非去極化肌松藥，例如，維庫溴銨，羅庫溴銨，咪庫氯銨，哌庫溴銨，可用于本發(fā)明的構(gòu)建體中。本發(fā)明優(yōu)選的哌庫溴銨，即阿端，是不引起心血管副作用的長效神經(jīng)肌阻滯藥。起效時(shí)間約為57min，作用時(shí)間為120-180min。該化合物的分子式為C35H62Br2N404，其結(jié)構(gòu)式見附圖1。3.包括有效劑量的胚胎干細(xì)胞提取物、非去極化肌松藥以及有效劑量的透明質(zhì)酸的組合物，透明質(zhì)酸(HyaluronicAcid)是糖氨聚糖中結(jié)構(gòu)最簡單的，是一種獨(dú)特的線性大分子糖氨聚糖，由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的雙糖單位反復(fù)交替連接而成，分子式為(C14H21N011)n，依據(jù)組織來源不同，分子量變化于105107之間。透明質(zhì)酸與其它天然糖氨聚糖不同，其分子內(nèi)不含硫酸基團(tuán)，也不與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，能以自由鏈形式在體內(nèi)游離存在。透明質(zhì)酸廣泛分布于動(dòng)物和人體結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)中，在胚胎、眼玻璃體、臍帶、皮膚、軟骨和滑液中含量較高，血清中含量最低。透明質(zhì)酸具有許多天然糖氨聚糖共有的性質(zhì)呈白色，為無定形固體，無臭無味，有強(qiáng)吸濕性，溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。但較其它糖氨聚糖而言，透明質(zhì)酸有其獨(dú)特的性質(zhì)，兼具高分子量和大分子體積的特性。由于直鏈軸上基團(tuán)之間的氫鍵作用，透明質(zhì)酸分子在空間上呈剛性的雙螺旋柱型，其長可達(dá)20μm。在水溶液中透明質(zhì)酸分子鏈上相鄰-NH和-COO_殘余基之間的“水橋”作用，進(jìn)一步加強(qiáng)其剛性；同時(shí)，CH基團(tuán)的連續(xù)定向排列，又在分子鏈上形成高度憎水區(qū)，為分子鏈之間相互纏繞和鏈鏈之間相互作用提供接點(diǎn)，透明質(zhì)酸分子鏈的親水和憎水特性，使?jié)舛群艿?lyg/ml)的透明質(zhì)酸也能形成連續(xù)的三維蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，水分子則在網(wǎng)絡(luò)內(nèi)通過極性鍵和氫鍵與透明質(zhì)酸分子相互結(jié)合，使得透明質(zhì)酸象“分子海綿”一樣，可以吸收和保持其自身重量上千倍的水分。事實(shí)上，透明質(zhì)酸比其它任何天然或合成聚合物都具有更強(qiáng)的吸水力，以至2%的純透明質(zhì)酸溶液能將剩余98%的水緊緊吸住，使得能象膠狀物一樣被提起，但它實(shí)際上是溶液，能被稀釋。透明質(zhì)酸溶液具有獨(dú)特的粘彈性，剪切力對其粘度值影響很大，溶液受高剪切力作用時(shí)，粘度可為1/1000以下，溶液的粘彈性隨透明質(zhì)酸分子量和濃度的增加而增加，也被認(rèn)為是分子網(wǎng)絡(luò)形成的結(jié)果。所以一個(gè)透明質(zhì)酸分子在水中將占據(jù)100010000倍于自身體積的空間。當(dāng)透明質(zhì)酸處于封閉的間隙如細(xì)胞間基質(zhì)時(shí)，將產(chǎn)生膨壓，加上分子表面的-coo_因吸引了陽離子，更增加基質(zhì)的滲透壓。這是這些膨壓使軟骨、腱等結(jié)締組織具有抗壓和彈性。人體表皮和真皮中含有高濃度的透明質(zhì)酸，占人體中透明質(zhì)酸總量的一半以上，皮膚中的含水量和透明質(zhì)酸含量直接相關(guān)，隨著年齡增長，皮膚老化，被認(rèn)為是皮膚中透明質(zhì)酸含量下降和聚合度改變的結(jié)果。體外細(xì)胞培養(yǎng)表明，皮膚的纖維細(xì)胞質(zhì)膜處能生物合成透明質(zhì)酸，代謝過程很快，半衰期為12d。4.胚胎干細(xì)胞提取物、非去極化肌松藥和誘明質(zhì)酸以及其它可用于面部養(yǎng)護(hù)物質(zhì)的組合物所述的其它可用于面部養(yǎng)護(hù)物質(zhì)如水解明膠，維生素E等。美國安利公司推出的膠原蛋白其主要成份也是水解膠原蛋白，其功效為通過服用膠原蛋白，以內(nèi)養(yǎng)外，增加肌膚彈性，減少皺紋。實(shí)驗(yàn)證明，連續(xù)服用2個(gè)月后，皮膚彈性增加45%，水份增加30%，透明光澤增加50%，皺紋減少30%，水解明膠能使水份固定在皮膚和組織上，水解明膠攝入后能形成更多的膠原蛋白，膠原蛋白不足時(shí)，皮膚的水份會減少失去彈性和水份，肌膚就無法保持年輕。水解明膠易于被身體吸收，幫助身體中膠原蛋白、彈力蛋白及網(wǎng)狀蛋白的合成，從而滋養(yǎng)皮膚、毛發(fā)、指甲和全身的結(jié)締組織，不僅可以抗老化、防皺紋、美容養(yǎng)顏，還能增加皮膚細(xì)胞再生，恢復(fù)肌膚彈性，同時(shí)可以補(bǔ)充組織流失的膠原蛋白，幫助排除皮膚多余脂肪，抑制皮膚過分出油。水解明膠的攝入還能有效消除皮膚斑點(diǎn)，去除黑斑、老人斑。5.本發(fā)明組合物效用發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞提取物，非去極化肌松藥，透明質(zhì)酸和水解明膠均可以通過皮膚吸收，為此，發(fā)明人設(shè)計(jì)了胚胎干細(xì)胞提取物，非去極化肌松藥，透明質(zhì)酸和水解明膠的組合物，并且將所述的組合物施用于20至35歲人群的面部皮膚，共施行12例，取得了令人鼓舞的效果。所述的組合物的除皺效果顯著優(yōu)于所選的三種市售眼霜中任何一種的效果(實(shí)施例)。6.毒性研究本發(fā)明提供了檢測組成的組合物對于機(jī)體的毒性的評價(jià)。我們施用10倍于正常劑量(指組合物中的劑量)的所述的組合物于受試驗(yàn)者皮膚，然后觀察其皮膚情況，檢測其血清中反映肝功能的指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶以及總膽紅素，以及用心電圖檢測其心電活動(dòng)。7.從胚胎干細(xì)胞里抗皮膚衰老有效成分1)1%明膠(gelatin/PBS)coatingT75cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶30分鐘；2)吸干后等3-5分鐘；3)在37度水浴箱快速溶解一管人胚胎干細(xì)胞，加IOml無血清培養(yǎng)液洗一次；4)離心，1000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，去除上清液，用Iml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；5)加Hml無血清干細(xì)胞培養(yǎng)液到培養(yǎng)瓶，然后把干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶培養(yǎng)3天；6)吸出培養(yǎng)液；7)用PBS清洗胚胎干細(xì)胞2次；8)加2-3ml2.5mMEDTA,是細(xì)胞懸浮，收集到15ml離心管；9)加IOmlPBS清洗干細(xì)胞，離心，吸干；10)加2-3ml細(xì)胞溶解液(50mMTrisph8.2，150mMNacl,2mMEDTA,ImMNa3Vo4,2.5mMNaF,ImMPMSF,0.5%NP-40andproteinaseinhibitortabletfromRoche)，，溶解細(xì)胞，然后收集到離心管內(nèi)；11)在4度搖晃1小時(shí)，離心14000轉(zhuǎn)/分，30分；12)取其上清液，4度PBS透析8小時(shí)，2x；13)冰凍干燥，保存在-80度冰箱；14)然后和非去極化肌肉松弛幾，透明質(zhì)酸，水解明膠按一定的比例制作皮膚防皺霜；8.組合物的制備1)以去離子純凈水作為溶劑，其中首先加入透明質(zhì)酸，濃度為0.5_4g/L，優(yōu)選2g/L02)加入水解明膠，30-200g/L,優(yōu)選80g/L；將混合液置于60度溫水浴鍋，輕搖45分鐘，溶液完全澄清透明后取出。3)冷卻到37度，然后加入適量的胚胎干細(xì)胞提取物，冷卻至室溫。溶液冷卻后形成凝膠。4)上述凝膠中加入非去極化肌松藥，例如，維庫溴銨，羅庫溴銨，咪庫氯銨，哌庫溴銨，優(yōu)選哌庫溴銨，濃度為0.lg-1.Og/L，優(yōu)選0.4g/L。充分?jǐn)嚢杌靹??；米詈蠹尤霘⒕鷦浞謹(jǐn)嚢杌靹?。置于避光低溫保存?.使用方法首先，用清水洗凈面部，用食指挑少許本組合物輕柔均勻地涂抹在眼角及眼下，之后輕柔地由內(nèi)向外按摩8-10次即可。使用期間盡量避免大笑等表情肌的劇烈運(yùn)動(dòng)。圖1哌庫溴銨的分子式。圖2使用一周后拍照比較對照組和治療組，發(fā)現(xiàn)治療組中II例有效，其中有2例眼部皺紋消失。圖3使用一月后拍照比較對照組和治療組，發(fā)現(xiàn)治療組中12例均有效，有5例眼部皺紋消失。實(shí)施例一、隨機(jī)選取12名眼部有明顯皺紋，年齡在20-35歲青年，其中男女各六人。左眼使用作為對照的市面所售的三種不同眼霜產(chǎn)品；右眼使用本發(fā)明所述的組合物。對照分為三組，第一組以國內(nèi)產(chǎn)品A(李醫(yī)生)作為對照，第二組以國外產(chǎn)品B(BodyShop)作為對照，第三組以國外產(chǎn)品C(Simple)作為對照。使用方法均為洗凈眼部和雙手，用示指將米粒大小各種眼霜均勻輕柔地涂抹在眼角及眼下皮膚外表面。每日晚上睡前和起床后各使用一次。一周后拍照比較對照組和治療組，發(fā)現(xiàn)第二、第三對照組中各有1例有效。而治療組中11例有效，其中有2例眼部皺紋消失(見圖2)。一月后拍照比較對照組和治療組，發(fā)現(xiàn)第二對照組中有2例有效、第三對照組中有3例有效。而治療組中12例均有效，其中有5例眼部皺紋消失。(見圖3)。權(quán)利要求1.用于消除或預(yù)防面部皺紋的組合物，所述組合物包括有效劑量的第一組分，人和動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞及其他干細(xì)胞提取物；第二組分，非去極化肌松藥；第三組分，透明質(zhì)酸；第四組分水解明膠。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述胚胎干細(xì)胞(也包刮其他各種干細(xì)胞)提取物和干細(xì)胞生長因子。3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述非去極化肌松藥。4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述透明質(zhì)酸。5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述水解明膠。6.權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述組合物在制備用于消除或預(yù)防面部皺紋尤其是眼部皺紋中的用途。7.權(quán)利要求1-2中所述的干細(xì)胞提取物在制備用于消除或預(yù)防面部皺紋的護(hù)膚品中的用途。8.如權(quán)利要求1，其中還可包含ViteminC、ViteminE等可用于面部養(yǎng)護(hù)的營養(yǎng)素。9.如權(quán)利要求1所述的組合物在預(yù)防和消除面部皺紋，特別是眼部皺紋方面的作用。全文摘要干細(xì)胞、非去極化肌松藥和透明質(zhì)酸復(fù)合抗衰老作用，該發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)抗皮膚衰老的范疇，在世界上首次提出胚胎細(xì)胞的抗衰老理論，并在這一理論指導(dǎo)下，發(fā)明了胚胎干細(xì)胞抗皮膚衰老的復(fù)合劑。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題主要是肉毒堿在抗皮膚衰老中的毒性作用，提供了無肉毒堿的抗皮膚皺紋的無毒性、而且具有促進(jìn)皮膚再生的抗皮膚衰老的復(fù)合劑。人體胚胎干細(xì)胞提取的復(fù)合成分可以促進(jìn)皮膚細(xì)胞的再生，而非去極化肌松藥可以代替肉毒堿的作用，透明質(zhì)酸，維生素C和/或維生素E等成分在維護(hù)皮膚的健康都有一定的作用。本發(fā)明的主要用途是抗皮膚的衰老，減緩、消除面部尤其是眼部的皺紋。文檔編號A61K8/73GK102125514SQ20101002290公開日2011年7月20日申請日期2010年1月18日優(yōu)先權(quán)日2010年1月18日發(fā)明者沈士亮,沈贊申請人:上海眾申生物科技有限公司