專利名稱：胡蘿卜提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物提取物，尤其涉及一種胡蘿卜提取物及其制備方法和應用。
背景技術：
食用胡蘿卜為傘形科植物Daucus carota Var sativa DC的根，原產(chǎn)亞洲中部栽 培歷史約有3000年，目前我國已成為世界上胡蘿卜種植面積與總產(chǎn)量最高的國家。胡蘿卜 富含多種維生素、糖、鉀、磷、鐵等營養(yǎng)成分，其含有的胡蘿卜素在人體內(nèi)酶的作用下可 降解為維生素Α，對防治夜盲癥有很好的效果。近年來的研究表明胡蘿卜脂溶性部位的活性成分不能簡單地歸結為β _胡蘿卜 素，BrandtK.等的研究提示胡蘿卜的有益作用可能與低含量的炔醇有關，而現(xiàn)有專利中無 胡蘿卜炔醇類化合物的相關內(nèi)容。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種以人參炔醇(panaxynol)及苯丙素類化合 物laserined-epilaserine為活性成分的胡蘿卜提取物，該提取物具有很好的抗腫瘤活性。此外，還需要提供一種胡蘿卜提取物的制備方法，以及胡蘿卜提取物在制備治療 腫瘤的藥物中的應用。為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種胡蘿卜提取物，該胡蘿卜提取物通過將胡蘿卜 粉碎、去汁后，在胡蘿卜渣中加入石油醚或乙醇進行提取的方法制得。優(yōu)選的，所述胡蘿卜提取物通過將胡蘿卜粉碎、去汁后，在胡蘿卜渣中加入1 4 倍胡蘿卜渣重量的石油醚進行提取的方法制得，因為用乙醇提取的胡蘿卜提取物中，除了 含有活性成分人參炔醇外，還含有較多大極性雜質(zhì)。優(yōu)選的，所述制得胡蘿卜提取物的方法還進一步包括將胡蘿卜渣的石油醚提取 物用甲醇進行萃取，因為采用甲醇萃取后，甲醇層中人參炔醇的相對含量有顯著性提高。萃 取所用的甲醇與石油醚的體積比為1 1 1 3。更優(yōu)選的，所述制得胡蘿卜提取物的方法還包括將胡蘿卜提取物濃縮，待該胡蘿 卜提取物中有機提取溶劑蒸除完，加入乙腈溶解，可以去除蠟狀的留醇類雜質(zhì)，并且使胡蘿 卜提取物中l(wèi)aSerine、2-印ilaserine及人參炔醇的相對百分含量顯著增加，該乙腈的加 入量為胡蘿卜濃縮液體積的5 10倍。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種胡蘿卜提取物的制備方法，包括以下步驟將胡蘿卜粉碎、去汁后，在胡蘿卜渣中加入石油醚或乙醇進行提取。優(yōu)選的，將胡蘿卜粉碎、去汁后，在胡蘿卜渣中加入1 4倍胡蘿卜渣重量的石油 醚進行提取，因為用乙醇提取的胡蘿卜提取物中，除了含有活性成分人參炔醇外，還含有較 多大極性雜質(zhì)。
優(yōu)選的，還進一步包括步驟將石油醚提取物用甲醇進行萃取，因為采用甲醇萃 取后，甲醇層中人參炔醇的相對含量有顯著性提高。萃取所用的甲醇與石油醚的體積比為 1 1 1 3，較佳的，萃取所用的甲醇與石油醚的體積比為1 1，因為用等體積的甲醇 進行萃取效果最好。更優(yōu)選的，還包括步驟將胡蘿卜提取物濃縮，待該胡蘿卜提取物中有機提取溶劑 蒸除完，加入乙腈溶解，該乙腈的加入量為胡蘿卜濃縮液體積的5 10倍。乙腈溶解胡蘿
卜濃縮液，可以去除蠟狀的留醇類雜質(zhì)，并使胡蘿卜提取物中l(wèi)aSerine、2-印ilaserine及 人參炔醇的相對百分含量顯著增加。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述胡蘿卜提取物在制備治療腫瘤的藥物中 的應用。本發(fā)明胡蘿卜提取物，具有顯著的抗腫瘤活性。四氮唑鹽 (Methyl-Thiazol-Tetrozolium, MTT)還原法檢測本發(fā)明胡蘿卜提取物對HL-60 (人白血 病)細胞增殖的抑制情況，抑制率可達到85. 7%?；酋Ａ_丹明Bkulforhodamine B, SRB) 蛋白染色法檢測本發(fā)明胡蘿卜提取物對BEL-7402(人肝癌)細胞增殖的抑制情況，抑制率 可達到95. 0%o
下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明實施例1胡蘿卜提取物的薄層層析檢測圖；圖2是本發(fā)明實施例6的CP2006-12-29-AV胡蘿卜提取物的HPLC檢測譜圖；圖3是本發(fā)明實施例7的胡蘿卜提取物的HPLC檢測譜圖；圖4是本發(fā)明實施例8中經(jīng)胡蘿卜提取物處理的HL-60細胞生長曲線圖；圖5是本發(fā)明實施例8的不同濃度胡蘿卜提取物作用不同時間對HL-60細胞生長 抑制率及活率的柱狀圖；圖6是本發(fā)明實施例8的不同濃度胡蘿卜提取物作用24小時的HL-60細胞生長 抑制率及活率的柱狀圖；圖7是本發(fā)明實施例8的不同濃度胡蘿卜提取物作用24小時的HL-60細胞的PI 陽性率柱狀圖；圖8是本發(fā)明實施例8胡蘿卜提取物作用前后HL-60細胞形態(tài)學改變圖；圖9是本發(fā)明實施例8的HL-60細胞的Armexin V-FITC凋亡檢測圖。
具體實施例方式本發(fā)明胡蘿卜提取物以人參炔醇及苯丙素類化合物laserine、2-印ilaserine為 活性成分，通過將胡蘿卜粉碎、去汁后，在胡蘿卜渣中加入石油醚或乙醇進行提取的方法制 得。laSerine、2-印ilaserine及人參炔醇均為小分子、弱極性化合物，因此選擇石油醚和乙 醇作為提取溶劑進行比較。這三個化合物中人參炔醇的體外抗腫瘤活性最好，因此選擇人 參炔醇作為檢測指標比較不同提取方法的優(yōu)劣。實施例1胡蘿卜提取物的制備胡蘿卜(1)7. 5kg、胡蘿卜(11)1. 25kg。胡蘿卜(I)取2. 5kg榨汁，汁平分兩份，分別用石油醚⑵和乙醚⑴萃取。胡蘿卜(I)剩余5kg切碎，平分四份，分別用石油醚⑴ 超聲提取1小時(1500ml X 3)、石油醚(V)回流提取(2000ml X 3)、95 %乙醇(W)超聲提取 1小時(1500mlX3)、95%乙醇(T)回流提取(2000ml X 3)。胡蘿卜(II) 1. 25kg切碎，石油 醚(S)超聲提取1小時(1500mlX3)。以上各部分以人參炔醇為對照，薄層層析檢測，香草 醛-濃硫酸顯色(人參炔醇為黑色)。層析結果顯示榨汁后的汁(Z)中不含人參炔醇，而乙 醇提取部分除了含有人參炔醇外還含有較多大極性雜質(zhì)(圖1)，因此石油醚比乙醇更適于 用作制備胡蘿卜提取物的提取溶劑。
實施例2原料烘干程度自菜場采購胡蘿卜3kg，去汁后渣重1.284kg，平分三份(分別為A、B、C)，每份 0. 428kg。A分為五份，每份加400ml石油醚，超聲提取30分鐘，減壓抽濾后蒸除溶劑，用石 油醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。B在35°C烘箱中干燥11小時，減重至59. 6g，分為五份，每份加150ml石油醚，超聲 提取30分鐘，減壓抽濾后蒸除溶劑，用石油醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。C在70°C烘箱中干燥，減重至56. Ig,分為五份，每份加150ml石油醚，超聲提取30 分鐘，減壓抽濾后蒸除溶劑，用石油醚定容至5ml，0. 2μπι濾膜過濾后用HPLC檢測。實驗結果如表1。表1 Α、B、C人參炔醇峰面積值 由實驗數(shù)據(jù)可以看出，經(jīng)過干燥后，人參炔醇的含量下降近二分之一，但另一方 面，經(jīng)干燥后，胡蘿卜大量失水，使提取所用的石油醚也顯著減少。由方差分析可知，A與B 及A與C都有顯著性差異(P < 0. 01)，而B與C之間在統(tǒng)計上無差異(P > 0. 05)，即烘干 溫度對人參炔醇的含量沒有影響。實施例3提取時間及提取次數(shù)自菜場采購胡蘿卜4kg，去汁后渣重1. 804kg,平分四份(分別為D、E、G、H)，每份 0. 451kg。D分為五份，每份加400ml石油醚，超聲提取30分鐘，減壓抽濾后蒸除溶劑，用石 油醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。 E分為五份，每份加400ml石油醚，超聲提取15分鐘，減壓抽濾后蒸除溶劑，用石油 醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。殘渣(F)再加400ml石油醚，超聲提取30 分鐘，減壓抽濾后蒸除溶劑，用石油醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。G分為五份，每份加300ml水，水蒸汽蒸餾(有溶液流出后保持30min)，用分液漏 斗分去水部位，上層用石油醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。H分為五份，每份加400ml石油醚，超聲提取30分鐘后用300ml、200ml甲醇萃取兩 次，分別合并石油醚層(H)及甲醇層(J)，減壓蒸除溶劑，分別用石油醚和甲醇定容至5ml， 0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。表5
平均值(Average) 標準差(SD)
實驗結果如表2 (G未能檢出人參炔醇)表2 D、E、F、H人參炔醇峰面積值 從實驗結果和方差分析可知D、E沒有統(tǒng)計差異(P > 0. 05)，說明超聲時間的長短 對人參炔醇的提取無明顯影響；E、F也沒有統(tǒng)計差異(P>0. 05)，說明第二次提取時人參炔 醇并無明顯減少，應考慮增加提取次數(shù)；在經(jīng)過石油醚-甲醇分配后，甲醇部位的人參炔醇 相對含量明顯升高，且小極性組分含量降低，而水蒸氣蒸餾的方法沒能將人參炔醇提取出來。實施例4提取方式比較自菜場采購胡蘿卜3. 3kg，去汁干燥(70°C )后渣重0. 168kg，平分三份(分別為 K、L、M)，每份約0. 056kg。K分為五份，每份加150ml石油醚，超聲提取30+30分鐘，減壓抽 濾后蒸除溶劑，用石油醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。L分為五份，每份加150ml石油醚，回流60分鐘，減壓抽濾后蒸除溶劑，用石油醚定 容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。M分為五份，每份加150ml石油醚，超聲提取30+30分鐘，減壓抽濾后蒸除溶劑，用 IOml石油醚溶解，加10mlMe0H-H20(l 1)萃取，石油醚部分減壓蒸除溶劑，用石油醚定容 至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。實驗結果見表3。表3 K、L、M人參炔醇峰面積值 由實驗結果可以看出CP2006-03-15-K、L、M無顯著性差異，說明用石油醚超聲提 取和回流提取對人參炔醇的提取沒有影響。實施例5石油醚規(guī)格自菜場采購胡蘿卜3. 1kg，去汁干燥(70°C )后渣重0. 1368kg，平分三份(分別為 Ν、0、Ρ)，每份約0. 044kg。N分為五份，每份加150ml石油醚(30 60°C )，超聲提取30+30 分鐘，減壓抽濾后蒸除溶劑，用石油醚定容至5ml，0. 2μπι濾膜過濾后用HPLC檢測。0分為五份，每份加150ml石油醚(60 90°C )，超聲提取30+30分鐘，減壓抽濾后 蒸除溶劑，用石油醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。
P分為五份，每份加150ml石油醚(30 60°C )，超聲提取30+30分鐘，減壓抽濾后 蒸除溶劑，用30ml石油醚溶解，加IOml甲醇(MeOH)萃取，石油醚部分⑵及甲醇部分(Q) 分別減壓蒸除溶劑，用石油醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。實驗結果見表4。表4 N、0、P、Q人參炔醇峰面積值 由實驗結果分析可知，N與0之間無統(tǒng)計差異，即采用30 60°C還是60 90°C 的石油醚對人參炔醇的提取無影響。而N、0與P及Q間有顯著性差異，尤其是從人參炔醇 峰面積百分比的分析結果可以看出采用石油醚-甲醇(3 1)萃取后，甲醇層中人參炔醇 的相對含量有顯著性提高。實施例6萃取比例1.自菜場采購胡蘿卜3. 038kg，去汁干燥(70°C )后渣重0. 1348kg，大致平分五 份，每份加450ml石油醚，超聲提取30+30分鐘，減壓抽濾后蒸除溶劑，殘渣每份用400ml石 油醚浸泡。兩周后減壓抽濾后蒸除溶劑，將兩次提取物合并，加16ml石油醚，至于0 4°C 放置。兩日后濾除析晶，上清液分為15份，每份加29ml石油醚。第1 5份(R)每份加IOml甲醇(MeOH)萃取，MeOH層濃縮后用石油醚定容至 5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。第6 10份(S)每份加15mlMe0H萃取，MeOH層濃縮后用石油醚定容至5ml， 0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。第11 15份(T)每份加6mlMe0H萃取，MeOH層濃縮后用石油醚定容至5ml， 0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。實驗結果見表5。表5 R、S、T人參炔醇峰面積值 由實驗結果分析可知，R與S之間無統(tǒng)計差異，但R、S與T間均有顯著性差異，即 在萃取時MeOH的用量不能太少。2.自菜場采購胡蘿卜3kg，去汁干燥(70°C )后渣重0. 152kg，加2250ml石油醚冷 浸，濃縮后加17ml石油醚，0 4°C析晶，吸取上清液。上清液1 5份(AU)每份0. 8ml加29ml石油醚，再加IOmlMeOH萃取，MeOH層濃縮后用石油醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。上清液1 5份(AV)每份0. 8ml加29ml石油醚，再加30mlMe0H萃取，MeOH層濃 縮后用石油醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢測。上清液1 5份(AX)每份Iml加29ml石油醚，再加30mlMe0H萃取(加60mlMe0H 萃取時，石油醚與MeOH互溶)，MeOH層濃縮后用石油醚定容至5ml，0. 2 μ m濾膜過濾后用 HPLC檢測。實驗結果見表6。表6 AU、AV、AX人參炔醇峰面積值 由實驗結果分析可知，AU與AV間有顯著性差異，即采用石油醚甲醇(1 1)萃 取時效果較好。實施例7 乙腈溶解將胡蘿卜石油醚提取物或甲醇萃取物濃縮，待其中的有機提取溶劑石油醚和/或 甲醇蒸除完，加入胡蘿卜濃縮液5 10倍量的乙腈溶解，0. 2 μ m濾膜過濾后用HPLC檢 測，結果如圖3所示，與上述表6中AV的譜圖(見圖2)相比，圖3的峰型簡化，提取物中 Iaserine、2-epilaserine及人參炔醇的相對百分含量顯著增加，并有效去除了蠟狀的甾醇 類雜質(zhì)。實施例8胡蘿卜提取物抗腫瘤活性測試1.實驗方法1. 1細胞培養(yǎng)和處理人急性髓細胞性白血病細胞株 HL-60(human acute promyelocytic leukemia cell line,HL-60)購自于中國上海生命科學研究院細胞庫，在37°C、5% CO2 95%空氣濕 度條件下，含10%的熱滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，每2天換液以保證細 胞濃度維持在2 5X 105/ml的最佳生長狀態(tài)，根據(jù)實驗需要加入所需濃度的藥物一起進 行孵育。每次實驗均設陰性對照組(0. 1%DMS0)、處理組和陽性對照組(5 μ mol/1 VP-16)， 三平行復孔。1.2臺盼藍染色法取對數(shù)生長期細胞，接種于24孔平底培養(yǎng)板，加入處理因素后，用PBS清洗細胞兩 次并用新鮮的含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液重懸細胞，收集細胞懸液50 μ 1，加入等體積 0. 臺盼藍染料，混合均勻后將懸液加入計數(shù)板，分別計數(shù)未染色的細胞數(shù)活細胞及染色 的總細胞數(shù)。細胞計數(shù)200個以上。生長抑制率及細胞活率按如下公式計算生長抑制率=[(對照組細胞數(shù)_處理組細胞數(shù))/對照組細胞數(shù)]X 100%活率=[活細胞數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))]X 100%1. 3碘化丙碇(PI)單染法
取對數(shù)生長期細胞，接種于24孔平底培養(yǎng)板，加入處理因素，37°C孵育24小時后， 收集樣本。2000轉/分離心10分鐘，PBS洗三次后，用100 μ 1 PBS重懸，PI (終濃度為 5ug/ml)避光室溫孵育15分鐘分鐘后，使用流式細胞儀測PI可染細胞比例，即為死亡細胞 比例。其中選用激發(fā)波長為488nm，PI發(fā)射波長為565nm。1. 4細胞形態(tài)學觀察利用倒置顯微鏡對活細胞在接觸處理因素前后細胞形態(tài)學及生長狀況的變化進 行動態(tài)觀察。收集4X IO4細胞，經(jīng)細胞涂片儀離心(800rpm/min，5min)涂片、晾干，常規(guī) Wright-Gimsa染色，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并攝片。1. 5 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡根據(jù)BD Biosciences公司提供的說明書操作。分別收集IX IO6未處理及經(jīng)藥物處 理后 HL-60 細胞，經(jīng)PBS 漂洗一次后，加 100 μ 1 Binding Buffer (IOOmmo 1/L HEPES ρΗ7· 4， 1. 5mmol/l NaCl，50 mmol/1 KCl, 10mmol/l MgCl2,18mmol/l CaCl2)漂洗一次，棄去洗液， 再加入200 μ 1 Binding Buffer重懸細胞，加入5 μ 1 AnnexinV和10 μ 1 PI避光室溫孵育 15分鐘后，再加300 μ 1 Binding Buffer上機檢測，其中選用激發(fā)波長為488nn，AnnexinV 發(fā)射波長為525rm，PI發(fā)射波長為565nm。結果圖中四個象限分別為，左上AV-PI+，右上 AV+PI+，左下AV-PI-，右下AV+PI-，AV單陽性表示早期凋亡，PI陽性表示壞死。所得結果經(jīng) IysisI軟件分析，實驗重復3次。2.實驗結果2. 1胡蘿卜提取物(CPM)對HL-60細胞增殖功能的影響根據(jù)預實驗結果，以20 μ g/ml、50 μ g/ml的胡蘿卜提取物(CPM)處理HL-60細胞 72小時，采用臺盼藍染色法進行活細胞計數(shù)，繪制生長曲線(見圖4)，發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)分別比未 經(jīng)處理的細胞顯著下降，兩個作用濃度的CPM都有明顯的抑制增殖效應，且隨著時間的延 長，細胞抑制作用逐漸增強(圖1)。20 μ g/ml的CPM作用48小時，HL-60細胞增殖停止， 50 μ g/ml的CPM作用72小時，幾乎導致所有細胞死亡。細胞生長曲線結果顯示，在一定作 用濃度下胡蘿卜提取物CPM對HL-60細胞有明顯的增殖抑制作用，并且呈時間劑量依賴性。計算生長抑制率及細胞活率，結果顯示胡蘿卜提取物CPM可以時間及劑量依賴的 方式抑制HL-60細胞的生長(見圖5)，同時伴隨有細胞活率的降低。HL-60細胞經(jīng)不同濃度胡蘿卜提取物CPM處理24小時之后，其生長抑制與作用劑 量成正比，即隨著藥物濃度增加，生長抑制率增加，同時活率降低(見圖6)。用不同濃度CPM處理HL-60細胞24小時，流式細胞儀PI單染檢測細胞死亡率，與 空白組(4. 74 % )對照，20 μ g/ml (14. 44 % )、30 μ g/ml (27. 14 % ),40μ g/ml (41. 56 % ), 50 μ g/ml (57. 20% )的CPM作用后細胞死亡率與濃度呈明顯的量效關系(見圖7)。2. 2胡蘿卜提取物(CPM)對HL-60細胞形態(tài)學的影響倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨作用時間的延長，未處理的HL-60細胞 大而圓，核漿比例大，胞漿較少，染色質(zhì)分散呈團塊狀，部分細胞可見一到多個核仁。40 μ g/ ml CPM和5 μ mol/1陽性對照藥物VP16處理過的HL-60細胞則呈現(xiàn)出明顯的細胞形態(tài)變 化，濃度為40 μ g/ml的CPM作用于HL-60細胞后6小時，即可觀察到HL-60細胞出現(xiàn)細胞 核濃縮，細胞體積變小，染色質(zhì)邊聚，核濃縮，部分碎裂的細胞核包裹于細胞膜內(nèi)，凋亡小體 出現(xiàn)，12小時后觀察可見大量的HL-60細胞呈凋亡細胞形態(tài)學改變(見圖8)。
2. 3 Annexin V/P1雙染法檢測細胞凋亡流式細胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染檢測，當用40 μ g/ml濃度的CPM處理HL-60 細胞，5ymol/L的VP-16陽性對照，不同時間觀察發(fā)現(xiàn)，作用6小時，AV+/PI-象限(早期凋 亡)細胞已出現(xiàn)，12小時后表現(xiàn)為AV+/PI+(晚期凋亡)細胞增加和壞死樣細胞出現(xiàn)，此時 早期凋亡細胞比例已有所下降(見圖9)，進一步證實胡蘿卜提取物CPM能誘導HL-60細胞 凋亡，且效應出現(xiàn)得比5 μ mol/L的VP-16早。3.結論本發(fā)明胡蘿卜提取物CPM在體外對白血病細胞株HL-60細胞具有明顯的增殖抑 制作用，并呈時間濃度依賴性，其抑制作用是通過誘導細胞凋亡實現(xiàn)的。CPM與人參炔醇對 HL-60細胞促凋亡的活性測試平行試驗結果顯示40 μ g胡蘿卜提取物對HL-60細胞的增殖 抑制效應與1.22 μ g人參炔醇的效應相當。實施例9 用四氮唑鹽(Methyl-Thiazol-Tetrozolium，MTT)還原法檢測本發(fā)明 胡蘿卜提取物對HL-60(人白血病)細胞增殖的抑制情況1.細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清及100IU/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液將 人急性髓細胞性白血病細胞株HL-60細胞置于培養(yǎng)箱(37°C，5%C02)中懸浮培養(yǎng)，取對數(shù) 生長期細胞進行實驗。2. MTT 比色取對數(shù)生長期的細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至4. 5X105/ml，在96孔板中設加藥、對 照(即只加細胞不加藥物)和空白(即只加無細胞培養(yǎng)液)三個組別。加藥組每孔分別加 入90 μ 1細胞懸液和10 μ 1不同濃度的提取物使提取物的終濃度分別為4、1、0. 25,0. 063、 0. 016mg/ml，每個濃度設三個平行孔，培養(yǎng)72h后每孔加MTT溶液(5mg/ml) 20 μ 1，繼續(xù)孵 育4h后，每孔加入150 μ 1DMS0,震蕩10 min后酶標儀檢測吸光值。測定波長570nm，參比 波長655nm。按下面公式計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率(％)=(對照-加藥)/(對照-空白)X100結果如下表7所示，本發(fā)明胡蘿卜提取物對人白血病HL-60細胞生長的抑制率可 達到85. 7%。表7 MTT法檢測本發(fā)明胡蘿卜提取物對HL-60細胞生長的抑制率 實施例10用磺酰羅丹明Bkulforhodamine B, SRB)蛋白染色法檢測本發(fā)明胡蘿 卜提取物對BEL-7402 (人肝癌)細胞增殖的抑制情況1.細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清及100IU/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液將 人肝癌BEL-7402細胞置于培養(yǎng)箱(37°C，5%C02)中懸浮培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。2. SRB 染色
取對數(shù)生長期的細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至4. 5 XlO5Ail，在96孔板中設加藥、對 照(即只加細胞不加藥物)和空白(即只加無細胞培養(yǎng)液)三個組別。加藥組每孔分別加 入90 μ 1細胞懸液和10 μ 1不同濃度的提取物使提取物的終濃度分別為4、1、0. 25,0. 063、 0.016mg/ml，每個濃度設三個平行孔，培養(yǎng)72h后每孔加10% TCA (三氯醋酸)200 μ 1，4°C 固定lh。用純水沖洗5遍，自然晾干后每孔加入4mg/ml SRB溶液，室溫下染色15min，棄 上清，用1 %乙酸沖洗5遍以去除非特異性結合的染料。每孔加入100 μ 1濃度為IOmM的 Tris (三羥甲基胺基甲烷)溶液，在490nm波長下測吸光值，按下面公式計算細胞生長抑制 率。細胞生長抑制率(％ )=(對照_加藥)/(對照-空白)X 100結果如下表8所示，本發(fā)明胡蘿卜提取物對人肝癌BEL-7402細胞生長的抑制率可 達到95. 0%。表8磺酰羅丹明B蛋白染色法檢測本發(fā)明胡蘿卜提取物對人肝癌BEL-7402細胞 生長的抑制率 本發(fā)明的胡蘿卜提取物以laserine、2-印ilaserine及人參炔醇為活性成分，經(jīng) 實驗證實該胡蘿卜提取物具有很好的抗腫瘤活性，可用于制備治療腫瘤的藥物。此外，本發(fā) 明還通過實驗進一步優(yōu)化了提取工藝，使胡蘿卜提取物中的活性成分含量明顯提高。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能 因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說， 在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范 圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
權利要求
一種胡蘿卜提取物，其特征在于，該胡蘿卜提取物通過將胡蘿卜粉碎、去汁后，在胡蘿卜渣中加入石油醚或乙醇進行提取的方法制得。
2.根據(jù)權利要求1所述的胡蘿卜提取物，其特征在于，所述胡蘿卜提取物通過將胡蘿 卜粉碎、去汁后，在胡蘿卜渣中加入1 4倍胡蘿卜渣重量的石油醚進行提取的方法制得。
3.根據(jù)權利要求2所述的胡蘿卜提取物，其特征在于，所述制得胡蘿卜提取物的方法 還進一步包括將胡蘿卜渣的石油醚提取物用甲醇進行萃取，該甲醇與所述石油醚的體積 比為1 1 1 3。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的胡蘿卜提取物，其特征在于，所述制得胡蘿卜提取物的 方法還包括將胡蘿卜提取物濃縮，待該胡蘿卜提取物中有機提取溶劑蒸除完，加入乙腈溶 解，該乙腈的加入量為胡蘿卜濃縮液體積的5 10倍。
5.一種胡蘿卜提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 將胡蘿卜粉碎、去汁后，在胡蘿卜渣中加入石油醚或乙醇進行提取。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，將胡蘿卜粉碎、去汁后，在胡蘿卜渣 中加入1 4倍胡蘿卜渣重量的石油醚進行提取。
7.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于，還進一步包括步驟將石油醚提取物 用甲醇進行萃取，該甲醇與所述石油醚的體積比為1 1 1 3。
8.根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述甲醇與石油醚的體積比為1 I。
9.根據(jù)權利要求6至8中任一項所述的制備方法，其特征在于，還包括步驟將胡蘿卜 提取物濃縮，待該胡蘿卜提取物中有機提取溶劑蒸除完，加入乙腈溶解，該乙腈的加入量為 胡蘿卜濃縮液體積的5 10倍。
10.權利要求1所述的胡蘿卜提取物在制備治療腫瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種胡蘿卜提取物，該胡蘿卜提取物通過將胡蘿卜粉碎、去汁后，在胡蘿卜渣中加入石油醚或乙醇進行提取的方法制得。本發(fā)明還公開了胡蘿卜提取物的制備方法和應用。本發(fā)明的胡蘿卜提取物，以人參炔醇及苯丙素類化合物laserine、2-epilaserine為活性成分，具有顯著的抗腫瘤活性。
文檔編號A61P35/00GK101919888SQ201010022898
公開日2010年12月22日 申請日期2010年1月18日 優(yōu)先權日2010年1月18日
發(fā)明者嚴忠紅, 楊若林, 陸陽 申請人:上海交通大學醫(yī)學院