專利名稱：具有免疫調(diào)節(jié)劑的可移植細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人或動物的非全能性細(xì)胞，其包含至少一種核酸，在由加入活性物質(zhì)調(diào)控的基因開關(guān)分子控制下編碼至少一種免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明還涉及所述細(xì)胞的生產(chǎn)和其用于移植、用于抑制移植排斥以及還用于預(yù)防和/或治療由移植引起的疾病和/或自體免疫疾病的用途。
人疾病的多重性是基于特定細(xì)胞、組織或器官的死亡或機(jī)能失調(diào)，通常只是用藥物藥物不充分地治療。先前的常規(guī)治療由通過移植已經(jīng)從健康人捐贈者獲得的健康細(xì)胞、組織或器官如心臟、肺、腎臟、胰腺，或來自所述器官的細(xì)胞或組織來替代受損的組織或器官組成。然而，由于目前器官捐贈者的短缺，滿足對捐贈組織的需求是不夠的。通過移植來自特定繁殖的非人捐贈哺乳動物的組織或細(xì)胞可以消除所述的短缺?；蛘撸瑥募?xì)胞系也可以獲得替代細(xì)胞。這些細(xì)胞同樣可以是人或非人來源的。
然而，每個非人細(xì)胞、組織或器官移植入人生物體(異種移植)或遺傳上不同的人捐贈者細(xì)胞、捐贈者組織或捐贈者器官移植入人接受者(同種異體移植)具有免疫為介的移植排斥問題。所述排斥是基于存在于捐贈細(xì)胞上作為外源蛋白識別的組織相容性抗原，因此導(dǎo)致直接對抗移植的免疫反應(yīng)。對抗同種異源或異種細(xì)胞、組織或器官的免疫反應(yīng)是基于免疫系統(tǒng)不同細(xì)胞(例如，B細(xì)胞，T細(xì)胞，抗原提呈細(xì)胞)之間的多種復(fù)雜相互作用，因此最終導(dǎo)致移植細(xì)胞、組織或器官的排斥。為了抑制所述免疫反應(yīng)，因此接受者必須用藥物即“免疫調(diào)節(jié)劑”治療，其抑制了免疫系統(tǒng)或帶來了所述接受者對移植的耐受力，并因此抑制了這樣的排斥。
所用免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例是類固醇(強(qiáng)的松龍及衍生物)、calcineurine抑制劑(環(huán)孢菌素A，他克莫司)、雷帕霉素(雷伯霉素sirolimus)、mycophenolate mofetil(MMF)、硝基咪唑硫嘌呤(硫唑嘌呤)、淋巴細(xì)胞抗血清(ALG-抗白細(xì)胞球蛋白，ATG-抗胸腺細(xì)胞球蛋白)或單克隆抗體(抗CD25ZENAPAX，SIMULECT)而在移植后開始幾周和幾個月內(nèi)抗體治療是作為支援性治療給藥的(誘導(dǎo)治療)，通常calcineurine抑制劑、類固醇常常和MMF或硫唑嘌呤給藥于從移植開始至患者攜帶移植物的整個階段，即有時候是其一生。然而，與常用的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的類型、作用模式及其結(jié)合無關(guān)，藥物通常是靜脈內(nèi)或口服給藥，因此分配至患者的整個體內(nèi)。因此它們不只是達(dá)到它們的作用位點(diǎn)，即，移植的器官或組織，或已經(jīng)獲得移植細(xì)胞的位點(diǎn)，而且達(dá)到生命體所有的其它組織和器官。這導(dǎo)致了免疫防御的總抑制，不是限制于移植物。在非靶向組織和器官中，它們損傷了免疫系統(tǒng)的功能并因此防礙了許多器官的生理機(jī)能，這可能導(dǎo)致多種副作用。
就此而論，常規(guī)免疫調(diào)節(jié)治療最重要的副作用是和高血壓、對腎臟和肝臟的損傷、增大了條件性病原微生物感染的發(fā)生和增加了各種惡性退變?nèi)绨┌Y和淋巴組織增生失調(diào)的比例。因此，例如，通常只有輕微癥狀進(jìn)行的細(xì)胞肥大病毒感染可以導(dǎo)致免疫抑制患者肝炎、肺炎和腦膜炎的發(fā)展，且因此是移植接受者增加死亡率的主要原因(Transplantation Clinical Management(醫(yī)治臨床管理)，Vol.5，2000Medscape，Inc.，Web MD Health Network，NY，USA)。其他研究證實(shí)免疫抑制的同種異體移植接受者，在常規(guī)治療后，會有高出三倍至四倍的癌癥風(fēng)險，其對于特定類型的癌癥，甚至可增加20-500倍。此外，免疫調(diào)節(jié)劑，尤其是抑制免疫的，通常具有毒性特征，與它們對免疫系統(tǒng)的作用無關(guān)。因此，calcineurine抑制劑常常導(dǎo)致腎衰竭、高血壓、高血脂和糖尿病的發(fā)展。此外藥物的常規(guī)治療極大地削弱了生命的質(zhì)量并因此患者常常未進(jìn)行至醫(yī)學(xué)上需要的程度。
進(jìn)一步的缺點(diǎn)是為了使整個循環(huán)分配后在移植部位仍然達(dá)到治療活性濃度，需要給藥相對高劑量的所述藥物。這進(jìn)一步促進(jìn)或增加了所述副作用的發(fā)生。
為了對抗這些事實(shí)，近幾年多種新的免疫治療和伴隨的診斷方法得到了發(fā)展。
例如，減少免疫調(diào)節(jié)副作用的經(jīng)臨床驗(yàn)證的方法由結(jié)合低濃度的新發(fā)展的免疫活性藥物并與此替代標(biāo)準(zhǔn)治療(例如，類固醇、環(huán)孢菌素A)組成。例如，這已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了移植同種異體胰島細(xì)胞用于治療糖尿病，其中結(jié)合使用daclizumab、雷伯霉素和低劑量血流譜阻遏了糖皮質(zhì)激素的致糖尿病作用(Shapiro J.，The New England Journal ofMedicine(新英國醫(yī)學(xué)雜志)，Vol.343，N.4，230-238，2000)。然而，即使通過這種治療，也不可能避免所述組合中單個免疫調(diào)節(jié)劑的副作用，如，白細(xì)胞水平的降低、口潰瘍和消化不良的發(fā)生。
另一個可能的治療方法是通過給藥新的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)在患者中獲得對外源組織的免疫耐受性。就此而論，耐受性表征為不存在對移植排斥的免疫反應(yīng)不需要連續(xù)的免疫抑制。這種免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法給藥(參見，例如，WO00/12138；WO97/41232；WO96/26274；WO01/8733；Ferrari-Lacraz等，The Journalof Immunology(免疫雜志)，2001，Vol.167pp.3478-3485；Kim等，TheJournal of Immunology(免疫雜志)，1998，1605742-5748；Penn，Transplant Proc(移植會刊)，1991，231101；Beveridge等，Lancet，1984，1788)。
常規(guī)治療方法的一個缺點(diǎn)是免疫調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)的耐受性通常還全身給藥(例如，心室內(nèi))的事實(shí)。另一個缺點(diǎn)是為了隨后從外部給藥于患者免疫調(diào)節(jié)劑必須作為治療產(chǎn)物從天然來源分離或作為重組分子從生物技術(shù)制得的事實(shí)。然而，由于生產(chǎn)方面可以導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)劑不能以天然形式或重組分子分離得到或制得足夠量或具有足夠活性。此外，免疫調(diào)節(jié)劑的離體生產(chǎn)需要添加可能引起患者進(jìn)一步健康風(fēng)險的物質(zhì)(例如，已經(jīng)從動物生物體分離的物質(zhì)并因此可能潛在地轉(zhuǎn)移動物寄生物病)。作為該情況的結(jié)果，不可能以適當(dāng)?shù)姆绞綄λ没颊呤褂妹庖哒{(diào)節(jié)劑來治療或治療可能與另外的健康風(fēng)險相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明范圍內(nèi)的目的是發(fā)展避免或減少了上述缺點(diǎn)的免疫治療，尤其是，其顯示了其免疫調(diào)節(jié)劑，尤其是抑制免疫劑，精確地作用于生命體中已經(jīng)或可以激活免疫反應(yīng)的位置，即，在移植細(xì)胞或器官的位置，并且同時使時間和數(shù)量可以調(diào)控的免疫調(diào)節(jié)作用成為可能。
根據(jù)本發(fā)明，通過可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)來控制免疫調(diào)節(jié)劑在細(xì)胞中的表達(dá)是可能的。
通過所述可調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)來局部(例如，在細(xì)胞移植體)和劑量生產(chǎn)免疫調(diào)節(jié)劑是可能的。先前還沒有證明過這樣的免疫調(diào)節(jié)劑的可調(diào)控生產(chǎn)。因此，在瞬時細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中獲得免疫調(diào)節(jié)劑MutIL-15/mFc可調(diào)控生產(chǎn)的發(fā)現(xiàn)是更加令人驚訝的(參見實(shí)施例1和Kim等，J.Immunology 1998，160，5742-5748)。
所述可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)使不再需要連續(xù)和全身或僅在低濃度給藥免疫調(diào)節(jié)劑成為可能。
本發(fā)明另一個重要優(yōu)勢的事實(shí)是甚至在移植的位置，不需要產(chǎn)生免疫反應(yīng)的連續(xù)抑制，如果從醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)看這是不需要的，但是所述抑制只在需要時激活。這減少了副作用還有身體的變形，尤其是在移植區(qū)域。還意味著對患者物理和生理的緩解，由于他不需要連續(xù)地依賴免疫調(diào)節(jié)劑尤其是免疫抑制劑的給藥。在本文中免疫抑制劑意思是完全或部分抑制生物體內(nèi)特別是由細(xì)胞、組織和/或器官移植引起的免疫反應(yīng)的物質(zhì)。
此外，本發(fā)明提供了免疫調(diào)節(jié)劑不再需要從天然來源分離或重組制得和純化的優(yōu)勢。以治療活性的量和形式在接受者生物體內(nèi)和/或在體內(nèi)作用位點(diǎn)制得免疫調(diào)節(jié)劑，并因此保持其全部天然活性。
因此本發(fā)明的一方面涉及可移植的人或動物非全能性細(xì)胞，包括至少一種核酸，其在通過添加活性物質(zhì)調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)控制下編碼至少一種免疫調(diào)節(jié)劑。
根據(jù)本發(fā)明的核酸意思是RNA或DNA，尤其是基因組DNA、重組制得DNA、cDNA或例如在磷酰胺作用水平上合成的合成DNA。同樣包括所述核酸的核苷酸組合和/或修飾。所述術(shù)語進(jìn)一步包括單鏈和雙鏈核酸。
還包括的是含有功能上連接成分例如編碼一個或多個免疫調(diào)節(jié)劑的一個或多個基因或其活性部分的核酸，以及還有至少一種可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)，其活化狀態(tài)是通過添加活性物質(zhì)來調(diào)控的，以及還有可調(diào)控序列如啟動子和調(diào)控核苷酸序列以及還有聚腺苷作用信號，例如SV40聚腺苷作用信號。如果它們以這樣的方式連接所述成分是功能上連接的使基因或所含基因的序列將在轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響下得到轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明的術(shù)語免疫調(diào)節(jié)劑基本上包括具有免疫調(diào)節(jié)作用的任何類型分子，尤其是抑制免疫的，例如蛋白質(zhì)、融合蛋白和可溶配體，融合蛋白意思是通過兩個或多個基因或基因片段連接產(chǎn)生的融合基因的表達(dá)產(chǎn)物。
例如如果通過改變或抑制受體結(jié)合的方式使生物體、細(xì)胞和/或組織的免疫反應(yīng)基本上得到抑制的免疫調(diào)節(jié)作用是存在的。如果引起了對移植細(xì)胞、組織或器官的免疫耐受性的免疫調(diào)節(jié)作用同樣存在。
例如，所述免疫調(diào)節(jié)劑的作用包括以下一個或多個的活性·抑制T細(xì)胞為介的抗原識別，·抑制通過T細(xì)胞上受體為介的信號，·激活通過T細(xì)胞上受體為介的信號，·抑制T細(xì)胞的生長，·抑制支持T細(xì)胞存活的分子，·抑制T細(xì)胞的效應(yīng)物分子(如TNF-α，IFN-γ)，·抑制T細(xì)胞的粘著，·抑制T細(xì)胞的協(xié)同刺激相互作用(通過兩個信號產(chǎn)生淋巴細(xì)胞的激活首先，進(jìn)行通過抗原受體的刺激，其次，發(fā)生非標(biāo)記淋巴細(xì)胞克隆擴(kuò)增和分化的另一個信號；該協(xié)同刺激相互作用可以通過免疫調(diào)節(jié)劑抑制)，·抑制更多參與免疫反應(yīng)細(xì)胞如普通和特異性抗原提呈細(xì)胞，尤其，例如，樹狀細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化、增殖、存活、抗原呈現(xiàn)、信號，和/或效應(yīng)物功能，通過表面受體或通過分泌分子如細(xì)胞因子、趨化因子或生長因子抑制參與免疫反應(yīng)的不同細(xì)胞如，普通和特異性抗原提呈細(xì)胞，尤其，例如，樹狀細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞相互作用，·抑制參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞如特異性抗原提呈細(xì)胞，尤其是，例如，樹狀細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，·抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的成分，·與外源或自體免疫抗原呈現(xiàn)結(jié)合或通過將抗體結(jié)合至抗原抑制吞噬細(xì)胞的活性，和/或·抑制炎癥反應(yīng)。
合適免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例是抗體。尤其優(yōu)選的抗體使IL-15、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-17、IL-18、IL-21、干擾素γ、TNF-α，CD2、CD3、CD4、CD8、CD28、CD40、CD80、CD86或CD154或其受體。
同樣優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑是FasL、PD-L1或PD-L2。
進(jìn)一步優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑是IL-15、IL-10、IL-4、IL-2、干擾素γ或TGF-β，尤其是以融合蛋白的形式。融合蛋白尤其優(yōu)選包括，首先，野生型IL-15、野生型IL-10、野生型IL-4、野生型干擾素γ或野生型TGF-β，以及其次，F(xiàn)c片段。所述融合蛋白進(jìn)一步尤其優(yōu)選包括，首先，突變IL-15，優(yōu)選位置101和108的Q”已經(jīng)由“D”替代的那些，或突變IL-2，以及其次，例如通過鉸鏈區(qū)融合至突變IL-15C末端的Fc片段(參見，例如，WO97/41232；Kim等，J.Immuno.(1998)，160(12)，5742-5748；WO01/87330)。
進(jìn)一步優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑是融合蛋白，首先，TNF-α受體(類型1或2)、ICOS、CTLA-4、PSGL-1、ICAM-1或VCAM-1，以及其次，F(xiàn)c片段如EP417,563中公開的關(guān)于TNF受體融合蛋白的那些。
進(jìn)一步優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞因子受體或生長因子受體的分泌變體，如，IL-15Ralpha、IL-6、IL-7、IL-12、IL-17、IL-18受體，例如無跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)粒尾部的變體，優(yōu)選如含有Fc片段的融合蛋白。
Fc(片段，可結(jié)晶的)片段意思是抗體的片段，其不結(jié)合任何抗原，例如包括全部恒定結(jié)構(gòu)域或除第一個恒定(部分或全部)結(jié)構(gòu)域外全部恒定結(jié)構(gòu)域的片段，如，包括鉸鏈區(qū)、重鏈的第二(CH2)和第三(CH3)恒定結(jié)構(gòu)域的。Fc片段可以源自天然來源，重組/或合成制得。相應(yīng)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。就此而論，F(xiàn)c片段與天然序列相比還可以具有一個或多個突變，例如包括構(gòu)建融合蛋白合適切割位點(diǎn)的那些(參見Kim等，上文)。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，F(xiàn)c片段是免疫球蛋白(Ig)G之一，尤其是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和/或類似哺乳動物IgG/或IgGM，尤其是人IgM或類似哺乳動物IgM和/或小鼠IgG2a。
免疫調(diào)節(jié)劑可以具有野生型序列或突變序列。優(yōu)選，免疫調(diào)節(jié)劑已經(jīng)以功能上活性的形式存在，例如功能上活性的可溶形式或功能上活性的病毒形式。可溶形式意思是未與細(xì)胞膜結(jié)合的分子，如，可溶受體分子。病毒形式意思是通過病毒基因組內(nèi)源編碼的同工型蛋白質(zhì)，如病毒IL-10。
根據(jù)本發(fā)明的突變序列意思是含有偏離野生型序列的核苷酸或氨基酸序列，如由于一個或多個核苷酸或氨基酸的刪除、添加、插入或取代，但是沒有完全失去免疫調(diào)節(jié)作用。
因此根據(jù)本發(fā)明的突變免疫調(diào)節(jié)劑是與野生型序列具有序列同源性的分子，優(yōu)選至少約80％，優(yōu)選至少約90％，尤其優(yōu)選至少約95％，最優(yōu)選至少約99％。
根據(jù)本發(fā)明的序列同源性意思是兩個序列相似性(陽性％)的程度，在多核苷酸的情況下，例如通過BLASTN 2.0.14測定，將濾器設(shè)定為“關(guān)“且BLOSUM＝62(Altschul等，1997，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，253389-3402)。可以使用普通序列同源性程序來檢測序列同源性，例如互聯(lián)網(wǎng)上http//www.hgsc.bcm.tmc.edu/SearchLauncher/。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)意思是編碼基因開關(guān)分子的序列和基因開關(guān)結(jié)合序列的組合，通過添加活性物質(zhì)來調(diào)控所述基因開關(guān)分子和所述基因開關(guān)結(jié)合序列的結(jié)合，因此控制靶基因的表達(dá)，在這種情況下靶基因編碼免疫調(diào)節(jié)劑(也參見Burcin等，1998，F(xiàn)rontiersin Bioscience 3c1-7)。
通常，通過結(jié)合合適的基因開關(guān)結(jié)合序列來激活或抑制基因開關(guān)分子靶基因的轉(zhuǎn)錄是可能的。激活可以基于提供了例如RNA聚合酶和/或有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子接觸位點(diǎn)的基因開關(guān)分子?？梢酝ㄟ^將其和DNA結(jié)合的方式使基因開關(guān)分子阻塞轉(zhuǎn)錄復(fù)合體所需的DNA結(jié)合位點(diǎn)來導(dǎo)致抑制，因此例如使所述結(jié)合位點(diǎn)對RNA聚合酶和/或有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子是隱蔽的。
活性物質(zhì)的添加可以正性(激活)或負(fù)性(抑制)影響靶基因的轉(zhuǎn)錄。例如，在活性物質(zhì)不存在的情況下靶基因是不表達(dá)的。添加活性物質(zhì)后，后者結(jié)合至基因開關(guān)分子并因此引起活化并使所述基因開關(guān)分子和基因開關(guān)結(jié)合序列結(jié)合，借此隨后啟動了靶基因的轉(zhuǎn)錄。另一個實(shí)施例是在活性物質(zhì)不存在的情況下基因開關(guān)分子和DNA結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄?；钚晕镔|(zhì)添加和結(jié)合后，鈍化了基因開關(guān)分子且停止了靶基因的轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語基因開關(guān)分子意思是含有活性物質(zhì)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)的分子，優(yōu)選蛋白質(zhì)，尤其融合蛋白，在活性物質(zhì)結(jié)合后該分子改變了其激活狀態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語基因開關(guān)結(jié)合序列意思是定位于優(yōu)選為基因翻譯起點(diǎn)(+1)5’上游的核酸序列或其活性部分，編碼免疫調(diào)節(jié)劑，其核酸序列控制靶基因的轉(zhuǎn)錄，尤其對于轉(zhuǎn)錄率和/或組織特異性，或控制翻譯。將具有啟動子活性的調(diào)控核酸序列，同樣優(yōu)選具有增強(qiáng)子活性，和所述基因開關(guān)結(jié)合序列間接或直接結(jié)合。
本發(fā)明可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)的功能可以如下描述，例如如果沒有基因開關(guān)分子和基因開關(guān)結(jié)合序列結(jié)合，就不會表達(dá)成對的靶基因，且在這種情況下，不會產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)劑。
例如，當(dāng)加入活性物質(zhì)時，后者和基因開關(guān)分子的二聚結(jié)構(gòu)域結(jié)合。該結(jié)合在二聚結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生了構(gòu)象改變，其導(dǎo)致了兩個基因開關(guān)分子的二聚作用并隨后和基因開關(guān)結(jié)合序列結(jié)合。該結(jié)合使基因開關(guān)分子的活化結(jié)構(gòu)域接近最小的TATA啟動子并因此啟動了編碼免疫調(diào)節(jié)劑的成對靶基因的轉(zhuǎn)錄?；钚晕镔|(zhì)已經(jīng)加入后，解除了基因開關(guān)分子和基因開關(guān)結(jié)合序列的結(jié)合，因此，停止靶基因的表達(dá)。
因此，通過添加活性物質(zhì)并然后和基因開關(guān)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，本發(fā)明的基因開關(guān)分子是可以調(diào)控的，例如抑制或激活，優(yōu)選激活。
優(yōu)選的活性物質(zhì)意思是通過其基因開關(guān)導(dǎo)致一個基因或多個基因直接或間接調(diào)控表達(dá)的藥物學(xué)上相容的物質(zhì)，例如米非司酮、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素或雷帕霉素。
本發(fā)明的調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)尤其是含有表示人工合成轉(zhuǎn)錄因子的基因開關(guān)的黃體酮基因表達(dá)系統(tǒng)，由GAL4-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Gal4-DBD)、源自具有平端配體結(jié)合位點(diǎn)的突變黃體酮受體的二聚結(jié)構(gòu)域(hPR-LBD)，和人NF-κB蛋白質(zhì)p65亞基的活化結(jié)構(gòu)域(p65-AD)組成?；蜷_關(guān)結(jié)合序列是例如由17個核苷酸GAL4結(jié)合序列跟隨最小的TATA啟動子組成的核苷酸序列，相應(yīng)靶基因是成對的。這種具有基因開關(guān)組成Gal4-DBD/hPR-LBD/p65-AD的可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)得到了描述，例如，Wang等，1994，PNAS 918180-8184或Wang等，1997，Gene Therapy(基因治療)4432-441。適于該系統(tǒng)的活性物質(zhì)實(shí)例是米非司酮，在哺乳動物中不產(chǎn)生的人造激素類似分子且其特異性地和基因開關(guān)分子的二聚結(jié)構(gòu)域結(jié)合并通過因此導(dǎo)致的二聚作用激活后者。
本發(fā)明進(jìn)一步的可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)是四環(huán)素基因表達(dá)系統(tǒng)，其表示了通過四環(huán)素(Tet)或衍生的強(qiáng)力霉素(Dox)誘導(dǎo)的系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中基因開關(guān)分子由Tet反式激活蛋白組成。所述反式激活蛋白(tTA)是VP16活化結(jié)構(gòu)域和Escherichia coli(大腸桿菌)Tet阻遏物(TetR)的融合蛋白。在四環(huán)素不存在的情況下，tTA對于其基因開關(guān)結(jié)合位點(diǎn)、Tet應(yīng)答序列(TRE)具有高度親和性，并激活靶基因的表達(dá)?；钚晕镔|(zhì)四環(huán)素的添加抑制了DNA結(jié)合并因此激活靶基因。該可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)得到了描述，例如，Gossen 1995，Science 2681766-1769；Fruh 1995，Nature 375415-418；Chao等，1998，Mol.Cell.Biol.18(8)4883-4898；Halappnavar等，1999，J.Biol.Chem.274(52)37097-37104或Van der Vlag等，2000，J.Biol.Chem.275(1)697-704。
該調(diào)控Tet系統(tǒng)的改進(jìn)是反向反式激活蛋白(rtTA)。在該系統(tǒng)中，野生型TetR已經(jīng)由突變TetR(rTetR)取代，結(jié)果，只在強(qiáng)力霉素存在下融合蛋白結(jié)合至DNA的基因開關(guān)結(jié)合位點(diǎn)，并因此誘導(dǎo)成對的靶基因，如所述的，例如，Gossen 1995，Science 2681766-1769；Gossen等，PNAS 895547-5551；Linstedt等，1997，Mol.Biol.Cell 81073-1087；Mehlen等，1998，Nature 395801-804或Joosse等，2000，Hum.Mol.Genet.93075-3082。
本發(fā)明進(jìn)一步的可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)是雷帕霉素基因表達(dá)系統(tǒng)。這包括蛋白質(zhì)FKBP12和FRAP的可誘導(dǎo)二聚作用，其是通過活性物質(zhì)雷帕霉素為介的。這兩個蛋白質(zhì)的二聚作用導(dǎo)致結(jié)合至FRAP的活化結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合并因此接通了成對的靶基因。這種可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)得到了描述，例如，Rivera等，1996，Nature Med 21028-1032。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法給藥所述的活性物質(zhì)，例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、顱內(nèi)、眶內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、透過肌肉、局部地、口服或通過粘膜，例如鼻腔或口腔。給藥方法的進(jìn)一步實(shí)施例是全身或局部注射、灌注或基于導(dǎo)管的給藥。合適的口服劑型是片劑或膠囊。通過肺進(jìn)行給藥，例如，通過噴霧和在皮膚下植入dispositories形式通過皮膚。公開了透皮治療系統(tǒng)(TTS)，例如，EP 0944 398-A1、EP 0 916 336-A1、EP 0 889 723-A1或EP 0 852 493A1。
細(xì)胞優(yōu)選是可移植的。根據(jù)本發(fā)明可移植的意思是可以移植至相同生命體不同位點(diǎn)或不同(接受者)生命體的活細(xì)胞，所述細(xì)胞優(yōu)選是無腫瘤發(fā)生細(xì)胞，或者如果細(xì)胞是源自腫瘤細(xì)胞，為了抑制其增生在移植前適當(dāng)?shù)靥幚硭黾?xì)胞(例如，通過鈍化有絲分裂)(參見，例如，WO00/64459和US5,175,103；Pleasure等，(1992)，The Journal ofNeuroscience(神經(jīng)科學(xué)雜志)，12(5)1802-1815)。
本發(fā)明的可移植人或動物非全能性細(xì)胞尤其是哺乳動物細(xì)胞，包括人細(xì)胞，和源自例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、綿羊、山羊、馬、豬、狗、貓或猴子，優(yōu)選來自人。
本發(fā)明的細(xì)胞實(shí)例是上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、心臟細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞和胰腺、腎臟、眼睛或肺細(xì)胞。
非全能性細(xì)胞意思是不能獨(dú)立發(fā)展成其完整生物體的細(xì)胞。
進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞是干細(xì)胞、前體細(xì)胞和/或永生化細(xì)胞。優(yōu)選是多能性或多效性的胚胎、胎兒、新生兒或成人的干細(xì)胞。尤其優(yōu)選源自成人組織的干細(xì)胞但不限制于此，此外包括新生兒干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、間葉細(xì)胞干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞以及還有消化道、皮膚、脂肪組織、腸、胎盤和胰管的干細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞還包括含有上述本發(fā)明的細(xì)胞并在所述組織或器官移植入相同或不同人或動物生物體之前/或之后將其引入人或動物生物體的組織或器官中。
優(yōu)選實(shí)施方案涉及以細(xì)胞系形式的本發(fā)明的細(xì)胞。
例如可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知方法，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染使用上述本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化或感染細(xì)胞系制得本發(fā)明的細(xì)胞系。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，核酸還編碼了選擇盒，尤其是合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因和/或分化標(biāo)記基因。
根據(jù)本發(fā)明的選擇盒是編碼至少一種基因的核酸序列，該基因?qū)е绿囟?xì)胞的特異性選擇，例如轉(zhuǎn)染的或分化的細(xì)胞。
例如，這種分化標(biāo)記基因、轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因和受體基因用于選擇是可能的。用作這樣的基因是主要基因其介導(dǎo)了對特定毒性物質(zhì)的抗性，例如抗生素。就此而論最常用的抗生素是新霉素、潮霉素(hph)、zeocin(SH ble)和嘌呤霉素(pacA)。例如這種基因的其它實(shí)例尤其對于選擇干細(xì)胞的基因是調(diào)控?zé)晒鈽?biāo)記例如GFP的基因，通過其經(jīng)熒光輔助細(xì)胞分選(FACS)可以純化所選擇的細(xì)胞。選擇標(biāo)記的其它實(shí)例是表面分子，例如生長因子受體，通過其經(jīng)磁性免疫珠子可以富集細(xì)胞(Bonini C.，Science Vol 276，1719-1724，1997)。其它實(shí)例是編碼酶活性的基因(例如，胸苷激酶)，其將毒性物質(zhì)的前體“前體藥物”(例如，鳥嘌呤)轉(zhuǎn)變至毒性物質(zhì)。在這種情況下，可能發(fā)生負(fù)選擇，即，只有不表達(dá)基因啟動子上游的細(xì)胞存活。
本發(fā)明選擇盒的進(jìn)一步可能基因是lacZ(編碼β-內(nèi)酰胺酶)、β-內(nèi)酰胺酶、氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶(CAT)、腺苷脫氨酶(ADA)、二氫葉酸還原酶(DHFR)和黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(XGPRT)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知確保或增強(qiáng)所述基因功能所用的合適試劑，例如另外的核酸序列。
優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸另外編碼了抑制NK細(xì)胞和/或殺傷細(xì)胞的分子，優(yōu)選人MHC I型分子、嵌合的MHC I型分子或病毒MHC I型同系物。
殺傷細(xì)胞作為帶有自發(fā)或后天細(xì)胞毒素潛能單核細(xì)胞的異質(zhì)群體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。NK細(xì)胞(天然殺傷細(xì)胞)意思是天然存在的殺傷細(xì)胞，即，其不是免疫反應(yīng)的結(jié)果且因此不是抗原特異性誘導(dǎo)的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼至少一種免疫調(diào)節(jié)劑的核酸和至少一種通過添加活性物質(zhì)調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)，如以上已經(jīng)更詳細(xì)地描述。
同樣優(yōu)選核酸編碼至少一種控制基因表達(dá)的序列。例如，這些序列意思是啟動子或調(diào)控核酸序列。這些以及表達(dá)載體(以下將更詳細(xì)說明)可以給核酸表達(dá)創(chuàng)造合適的條件。表達(dá)載體通常包括所有情況下適于特定細(xì)胞或轉(zhuǎn)錄基因的啟動子。
啟動真核生物中組成型表達(dá)的可調(diào)控序列的實(shí)例是通過RNA聚合酶III識別的啟動子。例如用于所有細(xì)胞和組織類型組成型表達(dá)的這種啟動子是pGK(磷酸甘油酸激酶)啟動子、CMV(細(xì)胞肥大病毒)啟動子、TK(胸苷激酶)啟動子、EF1α(延伸因子1-α)啟動子、SV40(猿猴病毒)啟動子、RSV(勞氏肉瘤病毒)啟動子和pUB(泛素)啟動子。
啟動真核生物中細(xì)胞或組織特異性表達(dá)的可調(diào)控序列實(shí)例是啟動子或啟動子激活劑序列或編碼只在特定細(xì)胞類型中表達(dá)的蛋白質(zhì)的那些基因的增強(qiáng)子。這樣的啟動子實(shí)例是用于胰腺β細(xì)胞的胰島素啟動子、用于神經(jīng)細(xì)胞的Sox-2啟動子、用于肌細(xì)胞的肌球蛋白重鏈啟動子、用于內(nèi)皮細(xì)胞的VE-鈣粘著蛋白啟動子和用于上皮細(xì)胞的角蛋白啟動子。
啟動真核生物中可調(diào)控表達(dá)的可調(diào)控序列的進(jìn)一步實(shí)例是結(jié)合對應(yīng)阻遏物的四環(huán)素操縱基因(Gossen M等，(1994)Curr.Opin.Biotechnol.5，516-20)。
同樣可以通過涉及影響數(shù)量和/或以時間函數(shù)表達(dá)的調(diào)控核苷酸序列來控制表達(dá)。它們包括，例如，增強(qiáng)子序列、前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、IRES序列、內(nèi)含子、絕緣體序列和阻遏物序列。
本發(fā)明的核酸可以定位于一個或多個核酸分子上。然而根據(jù)本發(fā)明，在多個核酸分子的情況中，這些必須功能上協(xié)作。根據(jù)本發(fā)明，例如(i)基因開關(guān)分子的序列，(ii)在基因開關(guān)結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控下的免疫調(diào)節(jié)劑序列和(iii)選擇標(biāo)記的序列定位于三個不同的核酸分子上是可能的。由于基因開關(guān)分子在核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，翻譯后在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的基因開關(guān)蛋白質(zhì)可能在核內(nèi)依次和免疫調(diào)節(jié)劑序列的基因開關(guān)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)。
因此本發(fā)明進(jìn)一步還涉及包括至少一種本發(fā)明核酸的載體。
根據(jù)本發(fā)明可能的載體是質(zhì)粒、穿梭載體、噬菌體、裝配型質(zhì)粒、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、表達(dá)載體和基因治療中活性的載體。
根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體包括至少一種本發(fā)明的核酸、至少一種翻譯啟動信號、一個翻譯終止信號和/或一個用于在真核生物中表達(dá)的聚腺苷酸化信號。
這種表達(dá)載體，尤其用于哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的，其中是可購得的，例如pIRES(Clontech，Heidelberg，DE)、pCI-neo載體(Promega，Mannheim，DE)、pCMV-Script(Stratagene，La Jolla，USA)和pcDNA3載體(Invitrogen，Karlsruhe，DE)或從各個序列可以單獨(dú)裝配的。
根據(jù)本發(fā)明的在基因治療中是活性的載體實(shí)例是質(zhì)粒載體、病毒載體，例如腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或基于RNA病毒復(fù)制子的病毒(參見，例如，Lindemann等，1997，Mol.Med.3466-76；Springer等，1998，Mol.Cell.2549-58；Khromykh，2000，Crrr.Opin.Mol.Ther.2555-69)。
基因治療中活性的載體還可以通過將本發(fā)明的核酸載體片段和脂質(zhì)體復(fù)合獲得。脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法包括通過超聲波降解脂質(zhì)體懸浮液來自陽離子脂質(zhì)的小單層脂質(zhì)體的制備。將DNA通過離子鍵結(jié)合至脂質(zhì)體表面，并以保留凈正電荷和使質(zhì)粒DNA100％與脂質(zhì)體符合的比例。除了脂質(zhì)體混合物DOTMA(1，2-二油酰氧丙基-3-三甲基溴化銨)和DPOE(二油酰氧磷脂酰乙醇胺)，同時已經(jīng)合成了多種新的脂質(zhì)制劑并測試了它們在各種細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效能(Behr等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866982-6986；Gao和Huang，1991，Biochem.Biophys.Acta 1189，195-203；Felgner等，1994，J.Biol.Chem.269，2550-2561)。所述新脂質(zhì)制劑的實(shí)例是DOTAP，(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N，-三甲銨硫酸乙酯)和DOGS(TRANSFECTAM；二十八烷基氨基甘氨酰精胺)。提高核酸轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞的賦形劑的可能實(shí)例是結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)或肽或合成的肽DNA分子，其能夠使核酸轉(zhuǎn)移進(jìn)核內(nèi)(Schwartz等，1999，Gene Therapy 6282；Branden等，1999，Nature Biotechs.17784)。賦形劑還可以包括使核酸釋放進(jìn)入細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的分子(Planck等，1994，J.Biol.Chem.269，12918；Kichler等，1997，Bioconj.Chem.8，213)或，例如，脂質(zhì)體(Uhlmann和Peimann，1990，Chem.Rev.90，544)。本發(fā)明的細(xì)胞還可以用于表達(dá)異種基因。
可以通過轉(zhuǎn)染(例如，電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀)或傳染將基因治療載體引入細(xì)胞中。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥物，其包括至少一種本發(fā)明的細(xì)胞和合適的賦形劑和/或添加劑。
本發(fā)明的藥物可以用于預(yù)防和/或治療疾病，例如(a)風(fēng)濕性失調(diào)，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、斯耶格倫綜合癥、硬皮病、皮肌炎、多肌炎、賴特綜合癥或貝赫切特病，(b)I型糖尿病或LADA，(c)甲狀腺的自體免疫疾病，例如格雷夫斯病，(d)中心神經(jīng)系統(tǒng)的自體免疫疾病，例如多發(fā)性腦脊髓硬化癥，(f)皮膚疾病，例如牛皮癬或神經(jīng)性皮炎，(g)炎癥性腸病，例如潰瘍性結(jié)腸炎或節(jié)段性回腸炎，(h)免疫失調(diào)，(j)血管病和(j)由移植引起的疾病，例如移植排斥。
例如用于穩(wěn)定和/或保護(hù)藥物的合適賦形劑和添加劑通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。它們包括，例如，生理鹽水、林格葡萄糖、林格乳酸鹽、威斯康星大學(xué)溶液/ViaSpan(Belzer UW)、EuroCollins溶液、DMSO、乙二醇、蔗糖、海藻糖、Ficoll、全氟化碳、軟化水、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、復(fù)合試劑、抗微生物化合物、蛋白酶抑制劑和/或惰性氣體。
根據(jù)適于特定類型細(xì)胞、組織或器官的方法將本發(fā)明的藥物給藥于其通常給藥的。這種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。根據(jù)此，可以給藥藥物，例如，·靜脈內(nèi)給藥于肝臟細(xì)胞·肌內(nèi)或通過基于導(dǎo)管給藥于心肌細(xì)胞，和·皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、膠囊封裝的或肌內(nèi)給藥于β細(xì)胞。
藥物可以通過離體方法引入器官，其中細(xì)胞從患者取出，遺傳修飾，例如通過DNA轉(zhuǎn)染，然后再引入所述患者中，或者通過本發(fā)明載體的體內(nèi)方法，載體在基因治療中是活化的，以裸露DNA的形式引入患者體內(nèi)，或通過使用本發(fā)明的病毒或非病毒載體或本發(fā)明的細(xì)胞。
已知藥物的劑量依賴于多個因素，例如患者的體重、健康的常規(guī)狀態(tài)、體表的大小、年齡以及和其他藥物的相互作用。劑量也依賴于給藥的類型。因此，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員決定對每個患者單個情況的劑量。藥物可以每天或數(shù)天給藥一次或數(shù)次；這也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來決定。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及人或動物器官特異性組織和/或人或動物哺乳動物器官，其包括至少一種本發(fā)明的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語器官特異性組織和哺乳動物器官包括，例如，哺乳動物器官心臟、皮膚、胰腺、腎臟、肝臟、肌肉、神經(jīng)、眼睛、肺、骨髓、軟骨、骨、導(dǎo)管、結(jié)締組織和所述器官各自的組織。
本發(fā)明還涉及包括至少一種本發(fā)明細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
例如，轉(zhuǎn)基因動物通常顯示了核酸組織特異性增強(qiáng)的表達(dá)并因此非常適于分析免疫反應(yīng)。優(yōu)選使用轉(zhuǎn)基因小鼠。
本發(fā)明的非人哺乳動物的實(shí)例是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、牛、綿羊、山羊、馬、豬、狗、貓或猴子。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明細(xì)胞、本發(fā)明人或動物器官特異性組織和/或本發(fā)明人或哺乳動物器官用于移植至人或哺乳動物的用途。本發(fā)明的移植優(yōu)選是自體移植、同種異體移植或異種移植。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解移植為將活材料，例如細(xì)胞、組織或器官轉(zhuǎn)移或移植至相同生物體的不同位點(diǎn)(自體移植)或從一個生物體(捐贈者)至另一個生物體(接受者)。在移植至不同生物體的情況中，區(qū)別在于·同種移植，其中捐贈者和接受者屬于相同種并通常全部或基本上是相同的，·同種異體移植，其中捐贈者和接受者屬于相同種但是免疫遺傳上是不同的，和·異種移植，其中捐贈者和接受者不屬于相同種且因此免疫遺傳完全不同。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明細(xì)胞、本發(fā)明人或動物器官特異性組織和/或本發(fā)明人或哺乳動物器官用于抑制哺乳動物或人移植排斥的用途。
根據(jù)本發(fā)明的哺乳動物意思是例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、綿羊、山羊、馬、豬、狗、貓或猴子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解移植排斥是接受者生物體排斥移植的材料，例如細(xì)胞、組織或器官的過程。所述排斥是細(xì)胞和體液免疫引起的。所述排斥的原因是移植的材料和接受者之間蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同。轉(zhuǎn)移組織的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)通過接受者免疫系統(tǒng)識別如致免疫的，因此引起免疫反應(yīng)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明細(xì)胞、本發(fā)明人或動物器官特異性組織和/或本發(fā)明人或哺乳動物器官用于預(yù)防和/或治療由移植引起的疾病和/或自體免疫疾病的用途。這樣疾病的實(shí)例已經(jīng)在上文本發(fā)明藥物應(yīng)用字段中得到了描述。
例如可以通過將本發(fā)明的細(xì)胞、組織和/或器官引入人或哺乳動物來進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的用于抑制移植排斥和用于預(yù)防和/或治療由移植引起的疾病和/或自體免疫疾病的用途。本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)劑的表達(dá)是通過本發(fā)明的可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)來控制的。所述控制是通過給藥或停止給藥本發(fā)明的活性物質(zhì)來進(jìn)行的，因此激活或鈍化基因開關(guān)分子。在激活的情況中，基因開關(guān)激活了編碼免疫調(diào)節(jié)劑的靶基因轉(zhuǎn)錄。作為結(jié)果表達(dá)的所述免疫調(diào)節(jié)劑基本上抑制了免疫系統(tǒng)對移植細(xì)胞、組織或器官的防御反應(yīng)，尤其是在人或哺乳動物生物體的移植區(qū)域。
可以通過從上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、非全能性胚胎干細(xì)胞和非全能性胚胎胚細(xì)胞的衍生物或來自成人組織的干細(xì)胞中選擇本發(fā)明的細(xì)胞來獲得基于使用細(xì)胞的治療。源自成人組織的干細(xì)胞優(yōu)選包括神經(jīng)元干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、間葉細(xì)胞干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞，消化道、皮膚、脂肪組織、腸、胎盤和胰管的干細(xì)胞，將其引入人或哺乳動物。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟a.將至少一種本發(fā)明的核酸和/或至少一種本發(fā)明的載體引入可移植人或動物非全能性細(xì)胞中，和b.添加至少一種合適的調(diào)控基因開關(guān)分子的活性物質(zhì)來表達(dá)所述核酸。
為了將根據(jù)本發(fā)明的核酸、載體、分化標(biāo)記基因或轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因或細(xì)胞引入本發(fā)明的細(xì)胞中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、電穿孔或注射的標(biāo)準(zhǔn)方法。
之前已經(jīng)描述了引起或增強(qiáng)所述核酸表達(dá)的合適條件。這些包括，例如，表達(dá)載體、啟動子和可調(diào)控核酸序列如增強(qiáng)子、聚腺苷酸化序列。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明人或動物器官特異性組織和/或本發(fā)明人或哺乳動物器官的體外制備方法，所述方法包括以下步驟a.將至少一種本發(fā)明的核酸和/或至少一種本發(fā)明的載體和至少一種分化標(biāo)記基因引入至少一種非全能性干細(xì)胞、非全能性前體細(xì)胞和/或非全能性永生化細(xì)胞中，b.分化步驟a的細(xì)胞，c.選擇步驟b的分化細(xì)胞，和d.將步驟c所選的細(xì)胞引入人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官中。
進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述體外方法優(yōu)選在步驟a之后、之前或同時將至少一種合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因引入非全能性干細(xì)胞、非全能性前體細(xì)胞和/或非全能性永生化細(xì)胞中，并優(yōu)選在步驟a之后選擇步驟a的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
例如可以通過胚胎體形式，優(yōu)選通過在溶液中培養(yǎng)細(xì)胞，通過高密度培養(yǎng)細(xì)胞，通過細(xì)胞集合，通過去除喂養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)物，去除分化抑制物質(zhì)(例如，LIF或喂養(yǎng)細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基)，通過添加細(xì)胞因子、生長因子、激素、維生素(例如煙酰胺)、視黃酸、丁酸鈉或DMSO至培養(yǎng)細(xì)胞中或通過添加公知的起始分化的其它物質(zhì)來誘導(dǎo)含有本發(fā)明核酸細(xì)胞的分化。
選擇細(xì)胞的多種方法是已知的。
從分化的胚胎干細(xì)胞中選擇細(xì)胞的方法得到了描述，例如，Kiug等(J.Clin.Invest.1996Jul 1；98(1)216-24)和Soria等(Diabetes.2000Feb.；49(2)157-62)。
一個優(yōu)選的選擇方法中，本發(fā)明的選擇盒包括標(biāo)記基因，那是對抗生素抗性的基因。在分化步驟之中或之后添加合適的抗生素后通過濃縮分化細(xì)胞來選擇或分離細(xì)胞。只有表達(dá)標(biāo)記基因的分化細(xì)胞是對抗生素抗性的。未分化的細(xì)胞死亡。還可以通過相同方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇。
本發(fā)明抗生素的意思是通過用作本發(fā)明選擇盒的抗生素抗性基因產(chǎn)生抗性的抗生素。將抗生素添加至培養(yǎng)的干細(xì)胞后，基本上只有含有報告基因表達(dá)載體的那些干細(xì)胞存活并分化。
同樣可能使用的選擇方法是其中本發(fā)明選擇盒的基因編碼熒光素酶、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白和/或黃色熒光蛋白。通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)的方式分離或通過親和純化選擇來選擇細(xì)胞。
進(jìn)一步可能是通過磁性免疫珠子的方式借助表面分子例如生長因子受體來濃縮細(xì)胞(Bonini C.，Science Vol.276，1719-1724，1997)優(yōu)選，可以將第二個標(biāo)記基因引入細(xì)胞，因此使進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明體外方法步驟a將核酸和/或載體已經(jīng)成功引入其中的細(xì)胞的選擇成為可能。該雙選擇使獲得所需細(xì)胞約90％、優(yōu)選約95-100％、純制劑成為可能。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟a.將至少一種本發(fā)明的核酸和/或至少一種本發(fā)明的載體和至少一種合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因引入至少一種的非人哺乳動物卵母細(xì)胞、干細(xì)胞、前體細(xì)胞和或永生化細(xì)胞中，b.選擇步驟a的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，c.將根據(jù)步驟b所選的細(xì)胞引入至少一種非人哺乳動物胚細(xì)胞中，d.將步驟c的胚細(xì)胞或步驟d的胚胎引入非人哺乳動物代母中，和e.鑒定從所述胚胎發(fā)展而來的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
優(yōu)選實(shí)施方案中，干細(xì)胞是多能性或多效性的胚胎、胎兒、新生兒或成人干細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟a.將至少一種本發(fā)明的核酸和/或至少一種本發(fā)明的載體和至少一種合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因引入非人哺乳動物受精卵母細(xì)胞兩個原核中的一個，b.將步驟a的哺乳動物卵母細(xì)胞引入非人哺乳動物代母中，和c.鑒定從所述胚胎發(fā)展而來的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
優(yōu)選已經(jīng)和接受血管切片的雄性交配而呈現(xiàn)假孕的非人哺乳動物代母。
將胚胎/或卵母細(xì)胞引入代母的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如可以通過注射入輸卵管或子宮的方式來進(jìn)行所述的引入(參見，例如，Hogan，B.，Beddington，R.，Constantini，F(xiàn)和Lacy，E.，A LaboratoryManual(1994)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，173-181頁)。
例如可以通過從所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物中如從小鼠尾部提取基因組DNA來鑒定轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。子序列PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))分析中，使用的引物是特異性識別本發(fā)明轉(zhuǎn)基因核酸的。通過該方式可以來檢測所述轉(zhuǎn)基因進(jìn)入基因組的整合性。
還可能的是通過Southern印跡的方式來進(jìn)行鑒定。在這種情況中，基因組DNA轉(zhuǎn)移至膜并通過DNA探針的方式來檢測，例如放射性同位素示蹤的DNA探針，其對所尋找的轉(zhuǎn)基因是特異性的。
通過再生非人干細(xì)胞、卵母細(xì)胞、前體細(xì)胞或永生化細(xì)胞來獲得轉(zhuǎn)基因非人動物尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如DE19625049和US4,736,866；US5,625,122；US5,698,765；US5,583,278和US5,750,825，并包括可以通過例如將本發(fā)明的表達(dá)載體直接注射入胚胎或精母細(xì)胞或通過將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入胚胎干細(xì)胞而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物(參見，例如，Polites和PinkertDNA Microinjection and Transgenic Animal Production(DNA微注射和轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn))，15-68頁，Pinkert，1994Transgenic AnimalTechnologyA Laboratory Handbook(轉(zhuǎn)基因動物實(shí)驗(yàn)室手冊)，Academic Press，London，UK(學(xué)術(shù)出版社，英國倫敦)；Houdebine1997，Harwood Academic Publishers，Amsterdam，The Netherlands(Harwood學(xué)術(shù)出版社，荷蘭阿姆斯特丹)；DoetschmanGene Transferin Embryonic Stem Cells(胚胎干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移)，115-146頁，Pinkert，1994，上文；WoodRetrovirus-Mediated Gene Transfer(逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移)，147-176頁，Pinkert，1994，上文；MonasterskyGeneTransfer TechnologyAlternative Technique and Application(基因轉(zhuǎn)移技術(shù)選擇性的技術(shù)和應(yīng)用)，177-220頁，Pinkert，1994，上文)。
同樣制備轉(zhuǎn)基因動物尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠的多種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，特別是WO98/36052，WO01/32855，DE19625049，US4,736,866，US5,625,122，US5,689,765，US5,583,278和US5,750,825，并包括例如通過將本發(fā)明載體直接注射入胚胎或精母細(xì)胞或通過將載體或核酸轉(zhuǎn)染入胚胎干細(xì)胞而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物(也參見Polites和Pinkert，Pinkert，(1994)Transgenic Animal TechnologyA LaboratoryHandbook(轉(zhuǎn)基因動物實(shí)驗(yàn)室手冊)，Academic Press，London，UK(學(xué)術(shù)出版社，英國倫敦)，15至68頁；Doetschman，Pinkert，1994，上文，115至146頁)。
進(jìn)一步實(shí)施方案中，用于制備本發(fā)明人或動物器官特異性組織和/或本發(fā)明人或哺乳動物器官的本發(fā)明所述體外方法中和本發(fā)明產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物方法中的干細(xì)胞是多能性或多效性的胚胎、胎兒、新生兒或成人干細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及已經(jīng)通過上述本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物和所述哺乳動物的后代。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物來獲得用于同種異體移植和/或異種移植的人或動物細(xì)胞、人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官。
例如，可以通過植入方法的方式或通過導(dǎo)管注射方法的方式通過血管壁來進(jìn)行細(xì)胞移植。
根據(jù)本發(fā)明的獲得意思是從本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的生物體中獲取所述細(xì)胞、組織和/或器官。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物、本發(fā)明細(xì)胞、本發(fā)明人或動物器官特異性組織和/或本發(fā)明人或哺乳動物器官用于發(fā)現(xiàn)藥物學(xué)上有效物質(zhì)和/或用于鑒定毒性物質(zhì)的用途。
例如，這種方法可以包括將本發(fā)明細(xì)胞接種于例如96孔微滴定平板上，接著加入要研究的藥物學(xué)活性或毒性物質(zhì)，然后通過細(xì)胞計數(shù)的方式來分析，是否所述物質(zhì)已經(jīng)導(dǎo)致死亡細(xì)胞數(shù)量的增加。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語藥物學(xué)有效物質(zhì)和毒性物質(zhì)意思是在合適的條件下對人或哺乳動物的單個細(xì)胞、單個組織、單個器官或整個生物體產(chǎn)生藥物學(xué)或毒性影響的所有那些分子、化合物和/或組合物和物質(zhì)混合物?？赡艿乃幬飳W(xué)有效物質(zhì)和毒性物質(zhì)可以是簡單化學(xué)(有機(jī)或無機(jī))分子或化合物、核酸或核酸類似物、核酸反義序列、肽、蛋白質(zhì)或復(fù)合物和抗體。實(shí)例是源自物質(zhì)庫的有機(jī)分子并研究了其藥物學(xué)或毒性活性。
例如，藥物學(xué)活性物質(zhì)是影響以下的物質(zhì)·細(xì)胞分裂和/或存活能力，·蛋白質(zhì)分泌，例如來自胰腺β細(xì)胞的胰島素，來自神經(jīng)細(xì)胞的多巴胺，·肌細(xì)胞收縮和/或，·細(xì)胞遷移行為，·細(xì)胞代謝活性，·細(xì)胞電生理活性，·細(xì)胞產(chǎn)物的酶活性，·細(xì)胞分化，·細(xì)胞成組織或器官的機(jī)體組成。
運(yùn)用至人或哺乳動物整個有機(jī)體，這意思是影響，例如，·心血管系統(tǒng)，·內(nèi)分泌系統(tǒng)，·腸胃系統(tǒng)，·神經(jīng)系統(tǒng)和·代謝活性。毒性物質(zhì)是有效物質(zhì)的實(shí)例，其·跟隨特定的信號例如應(yīng)力，刺激細(xì)胞進(jìn)入凋亡，·影響心血管系統(tǒng)，·影響神經(jīng)系統(tǒng)和/或，·影響代謝活性。
鑒定的藥物學(xué)有效物質(zhì)和毒性物質(zhì)可以適當(dāng)?shù)睾秃线m的添加劑和/或賦形劑結(jié)合或一起使用來制備診斷試劑或預(yù)防和/或治療由移植引起的疾病和/或自體免疫疾病的藥物，如通過之前實(shí)施例中的方式來進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及(i)人或動物非全能性細(xì)胞，包括至少一種核酸，在通過添加活性物質(zhì)調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)控制下編碼至少一種免疫調(diào)節(jié)劑。
(ii)根據(jù)(i)的細(xì)胞，特征在于細(xì)胞是干細(xì)胞、前體細(xì)胞和/或永生化細(xì)胞。
(iii)根據(jù)(i)或(ii)的細(xì)胞，特征在于是多能性或多效性的胚胎、胎兒、新生兒或成人干細(xì)胞。
(iv)根據(jù)(i)至(iii)至少一種的細(xì)胞是細(xì)胞系形式的。
(v)根據(jù)(i)至(iv)至少一種的細(xì)胞，特征在于可調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)是黃體酮基因表達(dá)系統(tǒng)、四環(huán)素表達(dá)系統(tǒng)和/或雷帕霉素基因表達(dá)系統(tǒng)。
(vi)根據(jù)(i)至(v)至少一種的細(xì)胞，特征在于免疫調(diào)節(jié)劑具有至少一種以下的功能特征a.抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原識別，b.抑制通過T細(xì)胞上受體介導(dǎo)的信號，c.激活通過T細(xì)胞上受體介導(dǎo)的信號，d.抑制T細(xì)胞生長，e.抑制支持T細(xì)胞存活的分子，f.抑制T細(xì)胞的效應(yīng)物(如TNF-α、IFN-γ)，g.抑制T細(xì)胞的粘著，h.抑制T細(xì)胞的協(xié)同刺激相互作用(通過兩個信號進(jìn)行淋巴細(xì)胞的激活首先，進(jìn)行通過抗原受體的刺激，其次，產(chǎn)生非標(biāo)記淋巴細(xì)胞克隆擴(kuò)增和分化的另一個信號；該協(xié)同刺激相互作用可以通過免疫調(diào)節(jié)劑來抑制)，i.抑制參與免疫反應(yīng)的更多細(xì)胞的活化、增殖、存活、抗原提呈、信號，和/或效應(yīng)物功能，如普通和特異性抗原提呈細(xì)胞，尤其，例如，樹狀細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞，通過表面受體或通過分泌分子如細(xì)胞因子、趨化因子或生長因子抑制參與免疫反應(yīng)的不同細(xì)胞的細(xì)胞相互作用，如，普通和特異性抗原提呈細(xì)胞，尤其，例如，樹狀細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞，j.抑制參與免疫反應(yīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，如特異性抗原提呈細(xì)胞，尤其是，例如，樹狀細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞，k.抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的成分l.結(jié)合外源或自體免疫抗原呈現(xiàn)或通過將抗體結(jié)合至抗原來抑制吞噬細(xì)胞活性，和/或m.抑制炎癥反應(yīng)。
(vii)根據(jù)(i)至(vi)至少一種的細(xì)胞，特征在于免疫調(diào)節(jié)劑是抗體。
(viii)根據(jù)(i)至(vi)至少一種的細(xì)胞，特征在于免疫調(diào)節(jié)劑是a.受體，b.可溶分泌受體，c.分泌蛋白質(zhì)或肽。
(ix)根據(jù)(viii)的細(xì)胞，特征在于免疫調(diào)節(jié)劑是突變IL 15和Fc片段的融合蛋白，將所述Fc片段融合至突變IL 15分子的C末端，優(yōu)選通過鉸鏈區(qū)。
(x)根據(jù)(ix)的細(xì)胞，特征在于抗體的Fc片段是IgG的Fc片段，尤其是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或類似哺乳動物IgG或IgM，尤其是人IgM或類似哺乳動物IgM。
(xi)根據(jù)(i)至(x)中至少一種的細(xì)胞，特征在于核酸另外編碼了選擇盒，尤其是合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因和/或分化標(biāo)記基因。
(xii)根據(jù)(i)至(xi)中至少一種的細(xì)胞，特征在于核酸另外編碼了抑制NK細(xì)胞和/或殺傷細(xì)胞的分子。
(xiii)根據(jù)(i)至(xii)中至少一種的細(xì)胞，特征在于核酸另外編碼了抑制以下細(xì)胞的分子a.樹狀細(xì)胞，b.單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞，c.B細(xì)胞，d.多形核細(xì)胞，例如嗜中性粒細(xì)胞。
(xiv)根據(jù)(xiii)的細(xì)胞，特征在于所述抑制分子是人MHC I型分子、嵌合的MHC I型分子或病毒MHC I型同系物。
(xv)核酸，編碼至少一種免疫調(diào)節(jié)劑和至少一種通過添加活性物質(zhì)來調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)。
(xvi)載體，包括至少一種根據(jù)(xv)的核酸。
(xvii)藥物，包括根據(jù)(i)至(xiv)任一的至少一種細(xì)胞和合適的賦形劑和/或添加劑。
(xviii)人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官，包括根據(jù)(i)至(xiv)任一的至少一種細(xì)胞。
(xix)轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，包括根據(jù)(i)至(xiv)任一的至少一種細(xì)胞。
(xx)根據(jù)(i)至(xiv)任一的細(xì)胞和/或根據(jù)(xviii)的人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官用于移植入人或哺乳動物的用途。
(xxi)根據(jù)(xx)的用途，特征在于其是同體移植、同種異體移植或異種移植。
(xxii)根據(jù)(i)至(xiv)任一的細(xì)胞、根據(jù)(xv)的核酸、根據(jù)(xviii)的人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官用于制備抑制人或哺乳動物移植排斥藥物的用途，其中適合在至少一種免疫調(diào)節(jié)劑的存在下。
(xxiii)根據(jù)(i)至(xiv)任一的細(xì)胞、根據(jù)(xv)的核酸、根據(jù)(xviii)的人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官用于制備預(yù)防和/或治療由移植引起的疾病和/或自體免疫疾病藥物的用途。
(xxiv)根據(jù)(i)至(xiv)任一細(xì)胞的制備方法，該方法包括以下步驟c.將至少一種根據(jù)(xv)的核酸和/或至少一種根據(jù)(xvi)的載體引入可移植人或動物非全能性細(xì)胞中，和d.添加至少一種合適的調(diào)控基因開關(guān)的活性物質(zhì)來表達(dá)所述核酸。
(xxv)根據(jù)(xviii)的人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官的體外制備方法，該方法包括以下步驟e.將至少一種根據(jù)(xv)的核酸和/或至少一種(xvi)的載體以及至少一種分化標(biāo)記基因引入至少一種非全能性干細(xì)胞、非全能性前體細(xì)胞和/或非全能性永生化細(xì)胞中，f.分化步驟a的細(xì)胞，g.選擇步驟b的分化細(xì)胞，和h.將步驟c所選的細(xì)胞引入人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官中。
(xxvi)根據(jù)(xxv)的方法，特征在于步驟a之后、之前或同時將至少一種合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因引入至少一種非全能性干細(xì)胞、非全能性前體細(xì)胞和/或非全能性永生化細(xì)胞中，并擇優(yōu)在步驟a之后選擇步驟a的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
(xxvii)根據(jù)(xxv)和(xxvi)之一的方法，特征在于干細(xì)胞是多能性或多效性的胚胎、胎兒、新生兒或成人干細(xì)胞。
(xxviii)根據(jù)(xix)的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟f.將至少一種根據(jù)(xv)的核酸和/或至少一種根據(jù)(xvi)的載體和至少一種合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因引入非人哺乳動物的至少一種卵母細(xì)胞、干細(xì)胞、前體細(xì)胞和或永生化細(xì)胞中，g.選擇步驟a的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，h.將根據(jù)步驟b所選的細(xì)胞引入至少一種非人哺乳動物胚細(xì)胞中，i.將步驟c的胚細(xì)胞引入非人哺乳動物代母中，和j.鑒定從所述胚胎發(fā)展而來的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
(xxix)根據(jù)(xxviii)的方法，特征在于干細(xì)胞是多能性或多效性的胚胎、胎兒、新生兒或成人干細(xì)胞。
(xxx)根據(jù)(xix)的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟d.將至少一種根據(jù)(xv)的核酸和/或至少一種根據(jù)(xvi)的載體和至少一種合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因引入非人哺乳動物兩個受精卵母細(xì)胞原核中的一個，e.將步驟a的哺乳動物卵母細(xì)胞引入非人哺乳動物代母中，和f.鑒定從所述胚胎發(fā)展而來的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
(xxxi)轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，特征在于是通過根據(jù)(xxviii)和(xxix)之一的方法來生產(chǎn)的。
(xxxii)轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，特征在于是根據(jù)(xxx)哺乳動物的后代。
(xxxiii)根據(jù)(xix)、(xxx)和(xxxi)任一的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物用于獲得同種異體移植和/或異種移植的非人細(xì)胞、非人器官特異性組織和/或非人哺乳動物器官的用途。
(xxxiv)根據(jù)(xix)、(xxx)和(xxxi)任一的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物、根據(jù)(xviii)的人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官用于尋找藥物學(xué)上有效物質(zhì)和/或用于鑒定毒性物質(zhì)的用途。
以下的圖和實(shí)施例用來說明本發(fā)明但并非是對其的限制

圖1描繪了轉(zhuǎn)染17×4/IL 15/寡+pcDNA3開關(guān)+/-米非司酮的培養(yǎng)基上清液的免疫印跡分析(實(shí)施例3)；圖2描繪了本發(fā)明基因表達(dá)系統(tǒng)作用機(jī)理的原理圖，其可以通過添加活性物質(zhì)來調(diào)控。
本發(fā)明的基因開關(guān)是由以下三個功能單位組成的嵌合蛋白i)Gal4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Gal4-DBD)，其識別基因開關(guān)結(jié)合結(jié)構(gòu)域UAS。本發(fā)明的UAS序列包括17個核苷酸序列基元的四個拷貝，每個基元可以作為兩個Gal4-DBD分子的結(jié)合位點(diǎn)。
ii)人黃體酮受體的平端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PR-LBD)，其介導(dǎo)了活性物質(zhì)米非司酮和基因開關(guān)的結(jié)合，并通過二聚作用導(dǎo)致基因開關(guān)蛋白轉(zhuǎn)化成活性構(gòu)象。
iii)p65活化結(jié)構(gòu)域(p65-AD)，其通過基因開關(guān)激活了靶基因的轉(zhuǎn)錄。
在不存在米非司酮的情況下，通過上游普遍存在的弱堿性的最小胸苷激酶啟動子(pTK)轉(zhuǎn)錄少量的基因開關(guān)。然而，這些基因開關(guān)分子是作為單體存在的并因此還不能結(jié)合任何DNA區(qū)域或啟動轉(zhuǎn)錄。添加活性物質(zhì)米非司酮后，激活了基因開關(guān)系統(tǒng)。配體結(jié)合基因開關(guān)的同型二聚體結(jié)合任何含有UAS序列的DNA區(qū)域(如，用于MutIL15-mFc的TATA啟動子調(diào)控基因的可調(diào)控區(qū)域上游)并因此激活了免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。因此，此外，帶有UAS序列的DNA區(qū)域定位于基因開關(guān)蛋白質(zhì)基因的TK啟動子的上游，同時在自調(diào)控反饋機(jī)理下激活了所述基因開關(guān)蛋白質(zhì)自身的轉(zhuǎn)錄，因此增加了活性基因開關(guān)的數(shù)量。
從細(xì)胞系制得的本發(fā)明的可移植細(xì)胞可以進(jìn)一步包括標(biāo)記基因，例如對抗生素新霉素(Neo-R)和潮霉素(Hygro-R)抗性的。通過普遍存在的啟動子如磷酸甘油酸激酶啟動子(pGK)調(diào)控的標(biāo)記基因來選擇用于DNA構(gòu)建體攝取的細(xì)胞。通過細(xì)胞類型特異性啟動子如大鼠胰島素啟動子(RIP)控制的標(biāo)記基因來選擇特異性細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
為了產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，細(xì)胞必須至少含有序列1和2。為了從細(xì)胞系制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，細(xì)胞還可以含有序列3。
實(shí)施例為了研究和證明免疫調(diào)節(jié)蛋白MutIL-15/mFc調(diào)控表達(dá)的作用方式，發(fā)展了兩個實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚢)用于移植的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在該模型中，用載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，除了用于MutIL-15/mFc免疫調(diào)節(jié)劑可調(diào)控表達(dá)的序列，該載體構(gòu)建體還包含能夠制備特異細(xì)胞類型(例如，胰島素產(chǎn)生細(xì)胞)的選擇盒(參見US5,733,727)。這樣從未分化的轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞制備和分離特異細(xì)胞類型的分化細(xì)胞是可能的。這些轉(zhuǎn)基因分化細(xì)胞可以移植入合適的受體小鼠中(例如，糖尿病小鼠)。如果用米非司酮處理移植的小鼠，移植細(xì)胞自身產(chǎn)生MutIL-15/mFc并因此防止了它們自己的排斥。
b)轉(zhuǎn)基因小鼠模型產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠其基因組含有通過添加米非司酮導(dǎo)致MutIL-15/mFc可調(diào)控表達(dá)的構(gòu)建體。由于MutIL-15/mFc表達(dá)是通過普遍存在的啟動子來調(diào)控的，當(dāng)通過添加米非司酮刺激后小鼠產(chǎn)生了MutIL-15/mFc?？梢詮霓D(zhuǎn)基因動物中取出器官(例如，心臟、腎臟)或細(xì)胞(小島細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞)并移植進(jìn)另一個非轉(zhuǎn)基因小鼠中。當(dāng)用米非司酮處理移植小鼠時，移植器官/細(xì)胞自身產(chǎn)生了MutIL-15/mFc并因此防止了它們自己的排斥。
實(shí)施例1用于轉(zhuǎn)基因小鼠模型的載體克隆17×4/pGL3堿性載體中的熒光素酶基因(來自Promega的修飾pGL3堿性載體，帶有TATA盒和作為基因開關(guān)結(jié)合位點(diǎn)的17個寡聚物的4個拷貝)用突變IL-15蛋白質(zhì)和小鼠Fc部分的融合蛋白(相當(dāng)于以下的MutIL-15/mFcKim等，The Journal of Immunology(免疫雜志)，1998，1605742-5748)的基因替代，其另外含有CD5前導(dǎo)序列(Jones H.，Nature 323(6086)，346-349，1986)。作為結(jié)果，CD5-MutIL-15/mFc基因通過SV40polyA序列終止(載體名稱174×/IL 15)。隨后，將含有SbfI和Pme I切割位點(diǎn)的寡核苷酸引入17寡聚物的上游(載體名稱17×4/IL15/寡)。所述切割位點(diǎn)用于將基因開關(guān)分子基因引入(GS＝Gal4-DBD/hPR-LBD/p65-AD)，包括上游調(diào)控區(qū)域(Gal4UAS-PTK-IVS8)，其是從pswitch載體(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)分離的(載體名稱17×4/IL 15/寡/GS)?；蛘吆土硗獾?，制備載體，其中IVS8內(nèi)含子(同樣來自pswitch)插入TATA盒和CD5-MutIL-15/mFc基因起始密碼子之間(載體名稱17×4/IL 15/寡/IVS8/GS)。所有克隆產(chǎn)物片段之間的翻譯通過測序來檢測。
實(shí)施例2用于來自胰島素生成細(xì)胞轉(zhuǎn)基因體外移植的載體克隆制備這些載體和用于轉(zhuǎn)基因小鼠模型的載體相似。然而，這些質(zhì)粒另外還含有包括大鼠胰島素啟動子(RIP)調(diào)控的新霉素抗性基因(neo)和小鼠磷酸甘油酸激酶(pGK)調(diào)控的潮霉素抗性基因(hygro)的片段。將這些序列插入CD5-MutIL-15/mFc基因下的5’并以兩個轉(zhuǎn)錄方向交替克隆(載體名稱17×4/IL 15/寡/RIPnh/GS和17×4/IL15/寡/RIPnh/GS)。或者和另外，制備載體，其中IVS8內(nèi)含子(同樣來自pswitch)插入TATA盒和CD5-MutIL-15/mFc基因起始密碼子之間(載體名稱17×4/IL15/寡/RIPnh/IVS8/GS和17×4/IL15/寡/RIPnh/IVS8/GS)。所有克隆產(chǎn)物片段之間的翻譯通過測序來檢測。
實(shí)施例3實(shí)施例1和2提及載體中的CD5-mutIL15-mFc可調(diào)控表達(dá)和分泌的檢測進(jìn)行cos-7細(xì)胞(DSMZ，Brunswick，Germany)和A293細(xì)胞(Quantum，Montreal，Canada)的瞬時轉(zhuǎn)染。為了該目的，在轉(zhuǎn)染前一天將5-7.5×105個細(xì)胞/孔接種于6孔平板上。在所有情況下通過將10ng/ml濃度的10-20μl的DNA和250μl OptiMEM-I培養(yǎng)基(LifeTechnologies，Karlsmhe，Germany)混合以1-2μg DNA/孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染。平行試驗(yàn)中，在所有情況下將2μl Lipofectamine2000(Life Technologies，Karlsruhe#11668-019)/μgDNA和250μl OptiMEM-I培養(yǎng)基(LifeTechnologies，Karlsmhe#31985-062)混合。兩個混合物等體積混合，并在室溫下放置20分鐘。同時，將含有50-70％融合細(xì)胞的6孔平板用PBS洗滌一次然后在所有情況下加入1.5ml生長培養(yǎng)基/孔(DMEM+10％FCS)。所有情況下將DNA/Lipofectamine混合物每孔逐滴加至所述細(xì)胞。所有情況下用米非司酮刺激的細(xì)胞另外接受了2μl的80％乙醇(Invitrogen，Karlsmhe，Germany)中的10-5M米非司酮溶液(Sigma，Deisenhofen，Germany；終濃度10-8M)。第二天，除去培養(yǎng)基并加入2ml新鮮培養(yǎng)基(DMEM+10％FCS)。在此所有情況下用米非司酮刺激的細(xì)胞再次另外接受了2μl米非司酮。轉(zhuǎn)染3天后，從細(xì)胞除去培養(yǎng)基，離心除去細(xì)胞殘余物，隨后在-80℃冷凍保存。細(xì)胞用PBS洗滌一次，刮至PBS中，轉(zhuǎn)移至1.5ml的Eppendorf管中，并在所有情況下用50μl RIPA緩沖液(含有1％IGEPAL的PBS/Sigma，DeisenhofenI-3021，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，4mM EDTA和完全無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物/Roche，Mannheim，Germany，#1873580)在4℃溶解30-60分鐘。離心的溶解產(chǎn)物在液氮中速凍并保存于-80℃。
通過識別融合蛋白小鼠Fc部分的ELISA分析CD5-mutIL15-mFc分泌。為此，所有情況下96孔平板(Nunc，Wiesbaden，Germany#439454)用100μl抗小鼠IgG2a抗體(R11-89克隆，BD PharMingen，Heidelberg，Germany#02251D-553446)在37℃覆蓋一小時。為了飽和非特異性結(jié)合位點(diǎn)，隨后將平板用PBS洗滌三次并用DMEM+10％FCS在37℃培養(yǎng)一小時。所有情況下將100μl未稀釋的培養(yǎng)基上清液運(yùn)用于覆蓋的平板，然后將其在室溫下培養(yǎng)1小時，隨后用200μl PBS/0.1Tween20洗滌5次和用200μl PBS洗滌一次。為了檢測小鼠Fc部分，酶聯(lián)合的HRP抗小鼠IgG2a抗體，R11-89克隆(BD PharMingen，Heidelberg#02017E-553391)同樣再次和平板在室溫下培養(yǎng)1小時，然后如上所述再次將平板洗滌。添加含有OPD底物溶液(25ml的0.1M檸檬酸，25ml的0.1M磷酸氫二鉀，加至100ml的H2O+1OPD片劑(Sigma Deisenhofen#P8412)+40μlH2O2，30％)后通過顏色反應(yīng)來觀察結(jié)合的融合蛋白的數(shù)量，通過添加3M HCl停止反應(yīng)后，在ELISA閱讀490nm處測量(μQuant，BIO-TEK Instrument Inc.)。
進(jìn)一步，通過免疫印跡分析未稀釋的培養(yǎng)基上清液。為了該目的，將培養(yǎng)基上清液和Lammli樣品緩沖液混合，加熱至92℃5分鐘，然后運(yùn)用至12.5％強(qiáng)聚丙烯酰胺凝膠并在150V下分級電泳。隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜(Schleicher u.Schuell，Dassel，GermanyCD0564-1)。用5％的奶粉/PBS/0.1％Tween20處理膜來飽和非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后用1∶500稀釋的小鼠抗人IL 15抗體(Becton-Dickinson，Heidelberg#554712)在4℃培養(yǎng)16小時，用PBS/0.1％Tween20大面積洗滌，然后用1∶3000稀釋的過氧化物酶聯(lián)合的綿羊抗小鼠抗體(Amersham，F(xiàn)reiburg.Germany#NA9310)在室溫下處理一小時。大面積洗滌后，用檢測試劑(NENBad Homburg，Germany#NE103E)在室溫下處理膜5分鐘，通過使用X射線涂膜檢測顏色反應(yīng)。
添加或未添加米非司酮轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液分析顯示了以下結(jié)果進(jìn)行了以下轉(zhuǎn)染1.mCD5.6(MutIL-15/mFc分泌的正向控制，在CMV啟動子控制下含有CD5-MutIL-15/mFc的載體)2.17×4/IL 15/寡+/-米非司酮(無基因開關(guān)的負(fù)向控制)3.17×4/IL 15/寡+pcDNA3開關(guān)+/-米非司酮4.17×4/IL 15/寡/GS+/-米非司酮5.17×4/IL 15/寡/GS+pcDNA3開關(guān)+/-米非司酮6.17×4/IL 15/寡/IVS8/GS+/-米非司酮7.17×4/IL 15/寡/IVS8/GS+pcDNA3開關(guān)+/-米非司酮用無基因開關(guān)分子的對照載體(2.)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中和沒有用米非司酮刺激的細(xì)胞中沒有觀察到MutIL-15/mFc的顯著表達(dá)。用僅僅含有自體調(diào)控基因開關(guān)分子(4.+6.)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后，通過ELISA檢測米非司酮刺激后MutIL-15/mFc只有輕微增加。這可能是由于在瞬時轉(zhuǎn)染過程中通過自體調(diào)控基因激活的活性基因開關(guān)分子的形成不夠。因此，通過一貫促進(jìn)高基因開關(guān)產(chǎn)生的pcDNA3開關(guān)載體(在CMV啟動子控制下的基因開關(guān))共轉(zhuǎn)染外部地增加了基因開關(guān)的數(shù)量。這些共轉(zhuǎn)染中，用同時含有無基因開關(guān)(3.)和含有基因開關(guān)構(gòu)建體(5.+7.)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，用米非司酮處理后，通過ELISA檢測MutIL-15/mFc的增加量。
表1測量瞬時轉(zhuǎn)染的A293細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的MutIL-15/mFc(復(fù)制的平均數(shù))
轉(zhuǎn)染3.(圖1)培養(yǎng)基上清液的免疫印跡分析同樣證明了在米非司酮刺激后MutIL-15/mFc(50kDa條帶)增加量的產(chǎn)生(泳道1)，與未刺激細(xì)胞(泳道2)相比較。
這些結(jié)果證明了可以通過將米非司酮添加進(jìn)上述載體(例如，17×4/IL 15/寡/IVS8/GS)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中來誘導(dǎo)MutIL-15/mFc融合蛋白的轉(zhuǎn)錄和分泌。這證明了調(diào)控MutIL-15/mFc表達(dá)的功能。
實(shí)施例4實(shí)施例1和2提及的載體中基因開關(guān)蛋白質(zhì)(Gal4UAS-PTK-IVS8-Gal4-DBD/hPR-LBD/p65-AD)的調(diào)控表達(dá)和功能的檢測如上所述，在只產(chǎn)生自體調(diào)控基因開關(guān)的瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的活性基因開關(guān)分子的數(shù)量(用17×4/IL 15/寡/GS和17×4/IL 15/寡/IVS8/GS轉(zhuǎn)染)是低的。
由于ELISA不夠敏感，為了檢測單個細(xì)胞水平的MutIL-15/mFc表達(dá)，進(jìn)行pGene/V5-His/lacZ質(zhì)粒(Invitrogen，Karlsruhe)共轉(zhuǎn)染。該載體含有l(wèi)acZ基因，其轉(zhuǎn)錄同樣通過基因結(jié)合位點(diǎn)來調(diào)控，意味著只在由于米非司酮刺激而刺激性地含有活性基因開關(guān)的那些細(xì)胞中產(chǎn)生β半乳糖苷酶。所述基因開關(guān)通過第二個載體提供(在這種情況下，構(gòu)建體帶有自體調(diào)控基因開關(guān))。通過單個細(xì)胞中藍(lán)色沉淀的底物反應(yīng)成來檢測β半乳糖苷酶。因此在實(shí)質(zhì)上較高的靈敏度下檢測載體構(gòu)建體的功能是可能的。
如實(shí)施例3所述，用以下構(gòu)建體轉(zhuǎn)染A293細(xì)胞然后部分用米非司酮刺激1.pCMVβ(正向控制lacZ，在CMV啟動子控制下含有l(wèi)acZ基因的載體)2.17×4/IL 15/寡+pGene/V5-His/lacZ+/-米非司酮(無基因開關(guān)的負(fù)向控制)3.17×4/IL 15/寡/GS+pGene/V5-His/lacZ+/-米非司酮4.17×4/IL 15/寡/IVS8/GS+pGene/V5-His/lacZ+/-米非司酮5.pcDNA3開關(guān)+pGene/V5-His/lacZ+/-米非司酮(組成型高基因開關(guān)的正向控制)6.pGene/V5-His/lacZ-米非司酮(無基因開關(guān)的負(fù)向控制)轉(zhuǎn)染后第三天，用-20℃冰冷甲醇混合細(xì)胞，用PBS洗滌3次，然后用lacZ染色溶液(60μl的400mM鐵氰化鉀，60μl的400mM鐵氰化鉀，60μl的200mM MgCl2，300μl的20mg/ml X-Gal，5.52ml的PBS)在37℃處理2.5小時。
通過光學(xué)顯微鏡測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞給出了以下結(jié)果(表2)表2瞬時轉(zhuǎn)染的A293細(xì)胞的β半乳糖苷酶染色的強(qiáng)度
*染色強(qiáng)度的程度觀察到無基因開關(guān)(2.)細(xì)胞沒有明顯藍(lán)色染色。自體調(diào)控基因開關(guān)(3.+4.)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，用米非司酮刺激導(dǎo)致3-5％細(xì)胞明顯的藍(lán)色染色。
由于這低量細(xì)胞只產(chǎn)生極小量的MutIL-15/mFc，所述量低于ELISA檢測極限。然而，在單個細(xì)胞中用lacZ染色來記錄和檢測基因開關(guān)活性還是可能的。
這些實(shí)驗(yàn)證明通過17×4/IL 15/寡/GS和17×4/IL 15/寡/IVS8/GS構(gòu)建體提供的活化基因開關(guān)的能力在用米非司酮刺激后對lacZ轉(zhuǎn)錄的作用。因此這些數(shù)據(jù)證明了上述構(gòu)建體自體調(diào)控基因開關(guān)的功能。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因小鼠的制備和表征用限制性內(nèi)切酶Eco47III和NotI切割50μg構(gòu)建體17×4/IL 15/寡/GS和17×4/IL 15/寡/IVS8/GS的DNA，然后各自純化所需的4800bp和4924bp片段。然后將所述片段注入C3HeB/FeJ小鼠的原核中，隨后將胚胎植入假孕雌性體中。從獲得的小鼠中提取基因組DNA，并通過PCR分析檢測轉(zhuǎn)基因的整合性。以下是所述PCR分析中所用的引物GS-IL 15FW.2(5’-TAT GGC TTC TGA GGC GGA AAG AAC CAG C-3’)和GS-IL15RV.3(5’-G CAG AGA CCC CAT GGG CAT GGT GGCTAG-3’)。因此，獲得的PCR產(chǎn)物長度各自是211bp(無內(nèi)含子)和335bp(帶有IVS8內(nèi)含子)。
從注射17×4/IL 15/寡/GS構(gòu)建體卵母細(xì)胞獲得的44只小鼠中，16只動物(36％)是轉(zhuǎn)基因的。
起始動物(F0代)和野生型DBA/2小鼠交配，獲得的F1后代再次檢測轉(zhuǎn)基因的基因組存在。隨后將轉(zhuǎn)基因F1動物檢測MutIL-15/mFc的調(diào)控表達(dá)。約8-16周大小時，每隔一天給小鼠腹膜內(nèi)注射250μg/kg溶解于芝麻油的米非司酮(Sigma，Deisenhofen M 8046)，總共三次。最后一次注射后的一天將動物處死，從組織中提取RNA和蛋白質(zhì)。然后通過ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析組織中基因開關(guān)蛋白質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)劑的表達(dá)。為了測定轉(zhuǎn)錄的基因開關(guān)和免疫調(diào)節(jié)劑的量，通過定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)來檢測RNA的量。
在所有情況下，根據(jù)制造者的說明通過擴(kuò)展反轉(zhuǎn)錄酶(ExpandReverse Transcriptase)(Roche，Mannheim)將1μg RNA轉(zhuǎn)錄進(jìn)cDNA。隨后通過光循環(huán)快速啟動DNA程序SYBR綠色試劑盒(Light Cycle FastStart DNA Master SYBR Green Kit)(Roche，Mannheim)研究基因開關(guān)和免疫調(diào)節(jié)劑MutIL-15/mFc的定量表達(dá)。檢測免疫調(diào)節(jié)劑的PCR條件如下變性95℃，600秒循環(huán)95℃15秒，60℃5秒，72℃10秒。
引物CD5.6-FW5’-CCTGCTGGGGATGCTGGTC引物CD5.6-RV5’-TTTTCCTCCAGTTCCTCACATTCMgCl23mM檢測基因開關(guān)的PCR條件如下變性95℃，600秒循環(huán)95℃15秒，53℃5秒，72℃10秒。
引物GS-FW5’-GACTTAAAAAGCTCAAGTCAAGTGCTCCAAAG引物GS-RV5’-TATATCCTGTAAAGAATCCATMgCl23mM此外，在米非司酮處理之前和之中定時間隔地從動物取血，并通過ELISA測定其中所含的MutIL-15/mFc量。
相同大小和相同轉(zhuǎn)基因系而先前沒有用米非司酮處理的小鼠作為對照。
或者，用兩步法來制備轉(zhuǎn)基因小鼠。首先，產(chǎn)生兩個不同系的轉(zhuǎn)基因小鼠，其只表達(dá)基因開關(guān)分子(系“A”)或只表達(dá)通過基因開關(guān)位點(diǎn)調(diào)控的免疫調(diào)節(jié)劑(系“B”)。獲得的A系轉(zhuǎn)基因小鼠品系中，選擇那些表達(dá)合適量基因開關(guān)分子的動物并在第二步驟中和B系轉(zhuǎn)基因動物交配。然后將獲得的后代檢測兩個轉(zhuǎn)基因的同時表達(dá)。在這種方式中，獲得了雙轉(zhuǎn)基因系“A/B”，其表達(dá)免疫調(diào)節(jié)劑受到基因開關(guān)分子的調(diào)控。
用合適的限制性內(nèi)切酶切割50μg pswitch構(gòu)建體(用于系“A”)或17×4/IL 15/寡和17×4/IL 15/寡/IVS8/GS構(gòu)建體(用于系“B”)的DNA，并純化所需的片段。然后將所述片段注入C3HeB/FeJ小鼠的原核中，隨后將胚胎植入假孕雌性體中。從獲得的小鼠中提取基因組DNA，并通過PCR分析檢測轉(zhuǎn)基因的整合性。
實(shí)施例6來自轉(zhuǎn)基因小鼠捐贈者器官的小島移植小島移植包括將從小鼠胰腺分離的小島注入糖尿病小鼠的腎囊下(Ferrari-Lacraz等，The Journal of Immunology(免疫雜志)，2001，Vol.167pp.3478-3485)。捐贈小島是從DBA/2J品系轉(zhuǎn)基因小鼠中分離的，其在基因開關(guān)控制下表達(dá)MutIL-15/mFc。為了在器官切除那天可檢測產(chǎn)生的MutIL-15/mFc，用米非司酮(250μg/kg)預(yù)處理捐贈小鼠。為了制備小島，捐贈者胰腺原地灌注了IV型膠原酶(2mg/ml；Worthington Biochemical Corp.)。37℃消化30分鐘后，通過不連續(xù)Ficoll梯度純化小島并隨后在含有5.6mM葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，Karlsruhe)中培養(yǎng)。然后在接受者腎囊下移植300-400個小島。
接受者是6-10周大的非轉(zhuǎn)基因B6AFl小鼠，其中通過腹膜內(nèi)注射β-細(xì)胞毒素鏈脲菌素(225mg/kg；Sigma，Deisenhofen)已經(jīng)誘導(dǎo)了糖尿病。作為對照將同源小島(即，B6AFl小鼠的小島)移植入糖尿病小鼠中。
將胰腺小島無菌移植至左腎囊下。為了該目的，將小鼠麻醉并在左肋弓下進(jìn)行切口。將左腎移出腹腔并在腎囊較低的頂點(diǎn)形成短切口。使用無菌鈍頭套管，在腎囊下形成口袋。然后通過無菌吸管尖端將小島注入該空腔內(nèi)。隨后，將腎臟放回腹腔內(nèi)并將腹部關(guān)閉。從移植那天往前，接受者小鼠每隔一天用米非司酮(250μg/kg)處理以致它們連續(xù)產(chǎn)生MutIL-15/mFc。
通過常規(guī)血糖測量(Accu-Check III；Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)來監(jiān)控同種異體移植機(jī)能。在糖尿病誘導(dǎo)之前和之后以及小島移植之后，定時間隔地從動物尾部靜脈或眼球后靜脈叢取血并測定血糖含量。在取血之間使用尿素測試條帶進(jìn)行另外的控制。主要移植機(jī)能定義為移植后3-5天血糖含量低于11.1mmol/l(200mg/dl)。在觀察主要移植機(jī)能后，如果至少連續(xù)兩天血糖水平已經(jīng)增加至高于500mg/dl，就認(rèn)為是移植排斥。
作為對照，進(jìn)行小島移植，其中動物沒有接受任何米非司酮并因此也沒有表達(dá)任何基因開關(guān)調(diào)控的MutIL-15/mFc，或其中動物用外部添加MutIL-15/mFc進(jìn)行了處理。
從轉(zhuǎn)基因捐贈小鼠獲得的小島細(xì)胞移植后，用所述方式處理的小鼠可以更好地調(diào)控它們的血糖水平并顯示了米非司酮處理后細(xì)胞移植排斥的降低。
實(shí)施例7異位心臟移植異位心臟移植包括將捐贈心臟和接受者腹部內(nèi)大血管連接(Ono等，J.Cardiovasc.Surg.1969，Corry等，Transplantation 1973)。從基因開關(guān)控制下表達(dá)MutIL-15/mFc的DBA/2J品系轉(zhuǎn)基因小鼠分離捐贈心臟。為了在器官切除那天可檢測產(chǎn)生的MutIL-15/mFc，用米非司酮(250μg/kg)預(yù)處理捐贈小鼠。分離麻醉小鼠的腔靜脈并注射肝素(400U/kg)使其分配至整個循環(huán)。隨后通過割開腹部血管使動物出血并通過胸骨正中切開術(shù)使心臟暴露。分離主動脈和肺管并割開，用4-10個Tevdek(Deknatal，Queens Village)將肺靜脈和腔靜脈全部綁扎。取出后立即將心臟保存于4℃生理鹽水中(Physiolosol，Abbot Laboratories，Illinois，USA)。將接受者(6-8周大的非轉(zhuǎn)基因B6AFl小鼠)的下腔靜脈和腹部主動脈暴露，給血管提供松散配合的血管夾。捐贈者主動脈的末端和接受者腹主動脈一側(cè)相連接，通過8-0個Prolene縫合。以相同的方式將捐贈者的肺動脈融合至接受者的主動脈。除去血管夾并用林格乳酸鹽溶液在37℃加熱捐贈者心臟以致心臟開始自發(fā)地收縮。從移植那天往前，接受者小鼠每隔一天用米非司酮(250μg/kg)處理以致它們連續(xù)產(chǎn)生MutIL-15/mFc。每隔一天通過腹壁觸摸跳動的心臟來檢查移植存活并在脈搏強(qiáng)度和頻率的基礎(chǔ)上以1+至4+的等級來評價。當(dāng)心肌收縮不再可觸知時就認(rèn)為心臟排斥。如果捐贈者心臟跳動時間比未處理對照動物心臟長，排斥就得到了防止。作為對照，進(jìn)行心臟移植，其中動物沒有接受任何米非司酮并因此也沒有表達(dá)任何基因開關(guān)調(diào)控的MutIL-15/mFc，或者其中動物用外部添加MutIL-15/mFc進(jìn)行了處理。
這個實(shí)施例顯示了那些用米非司酮處理的動物異位心臟移植保持了較長時間的機(jī)能，與未處理動物比較。
實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞系的制備用限制性內(nèi)切酶Eco47III和NotI切割100μg構(gòu)建體17×4/IL15/寡/RIPnh/GS、17×4/IL 15/寡/RIPnh/GS、17×4/IL 15/寡/RIPnh/IVS8/GS和17×4/IL 15/寡/RIPnh/IVS8/GS的DNA，純化片段并重懸浮于至少100μl無菌PBS中。然后通過電穿孔的方式將構(gòu)建體17×4/IL15/寡/RIPnh/GS和17×4/IL15/寡/RIPnh/IVS8/GS引入SVJ129或R1系的小鼠ES細(xì)胞中。為了該目的，將按指數(shù)規(guī)律生長的ES細(xì)胞胰蛋白酶化、分離并計數(shù)。用5-10ml冷PBS洗滌約3×107個細(xì)胞兩次，然后取出冷PBS中的細(xì)胞球以致最終體積，包括DNA，是800μl。隨后將消化的DNA加入細(xì)胞中，混合溶液并在冰上培養(yǎng)至少10分鐘。在無菌操作臺上將細(xì)胞/DNA混合物裝入0.4cm電極裂縫的預(yù)冷電穿孔小管中(BioRad，Munich，Germany)。使用Genepulser 2裝置(BioRad，Munich)在0.8kV和3μF進(jìn)行電穿孔。然后將細(xì)胞和ES細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM含有20mM Hepes，15％熱滅活FCS，50U/ml青霉素，50U/ml鏈霉素，0.1mM非必需氨基酸，0.1mM巰基乙醇，103U/ml白血病抑制因子)混合并平均分配到覆蓋0.1％明膠的10個10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。第二天，通過添加200μg/ml潮霉素(Sigma，Deisenhofen H 3274)至ES細(xì)胞培養(yǎng)基中開始選擇。選擇細(xì)胞用于吸收構(gòu)建體約5-9天，在無菌操作臺上人工分離單個轉(zhuǎn)基因克隆并轉(zhuǎn)移至96孔平板上。在到達(dá)合生之前將細(xì)胞排出并接連放置在48孔平板、24孔平板、6孔平板和10cm培養(yǎng)皿中。
添加10nM米非司酮后，通過定量RT-PCR檢測細(xì)胞克隆基因開關(guān)和MutIL-15/mFc的可調(diào)控表達(dá)或通過ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析來檢測MutIL-15/mFc(如以上實(shí)施例3和4中所述)。
或者，轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞以兩步法制得。首先，產(chǎn)生只表達(dá)可調(diào)控方式基因開關(guān)分子的轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞。在獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中，選擇表達(dá)合適量基因開關(guān)分子的那些克隆。第二步中，這些克隆用編碼由基因開關(guān)結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控的免疫調(diào)節(jié)劑的DNA構(gòu)建體超轉(zhuǎn)染。如實(shí)施例5中所述的，獲得的雙轉(zhuǎn)基因系通過RT-PCR來檢測兩個轉(zhuǎn)基因的同時表達(dá)。在該方式下，獲得表達(dá)基因開關(guān)分子-調(diào)控免疫調(diào)節(jié)劑的雙轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞。
如上所述，用合適的限制性內(nèi)切酶切割100μg基因開關(guān)構(gòu)建體的DNA，純化所需片段，重懸浮于無菌PBS中并通過電穿孔將其引入ES細(xì)胞。由于構(gòu)建體給予了對抗生素zeocin的抗性，可以通過所述抗生素處理來選擇成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。從獲得的細(xì)胞分離轉(zhuǎn)基因克隆，并通過定量RT-PCR研究米非司酮添加和基因開關(guān)分子表達(dá)的函數(shù)。在第二步中，這些表達(dá)合適量基因開關(guān)分子的克隆用純化的構(gòu)建體17×4/IL15/寡/RIPnh和17×4/IL15/寡/RIPnh/IVS8的Eco47III/NotI片段通過電穿孔再次超轉(zhuǎn)染，并通過潮霉素處理來選擇用于第二個轉(zhuǎn)基因的吸收。通過基因組DNA的PCR分析來檢測兩個轉(zhuǎn)基因的同時整合性。
如以上實(shí)施例5中已經(jīng)描述的，添加10nM米非司酮后，通過定量RT-PCR來檢測獲得的雙轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆的基因開關(guān)和MutIL-15/mFc的可調(diào)控表達(dá)或通過ELISA和印跡分析來檢測MutIL-15/mFc。
隨后，從獲得的細(xì)胞系中選擇那些克隆，其只在添加米非司酮后產(chǎn)生和分泌足夠量的免疫調(diào)節(jié)劑MutIL-15/mFc。
實(shí)施例9從轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞制得的胰島素生成細(xì)胞的移植在移植之前，從未分化的潮霉素抗性ES細(xì)胞系制得在基因開關(guān)控制下表達(dá)MutIL-15/mFc的胰島素生成細(xì)胞，Soria等(Diabetes.2000Feb.；49(2)157-62)。
在移植前用米非司酮處理胰島素生成細(xì)胞以致產(chǎn)生足夠量的MutIL-15/mFc。
隨后，將1百萬個胰島素生成細(xì)胞注入C57BL/6小鼠腎囊下(如實(shí)施例7中所述的)或脾臟中(Soria等Diabetes.2000Feb.；49(2)157-62)中，小鼠由于鏈脲菌素處理是糖尿病的。從移植那天往前，接受者動物每隔一天用米非司酮(250μg/kg)處理以致它們連續(xù)產(chǎn)生MutIL-15/mFc。
通過常規(guī)血糖測量(Accu-Check III；Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)來監(jiān)控同種異體移植機(jī)能。主要移植機(jī)能定義為移植后3-5天血糖含量低于11.1mmol/l(200mg/dl)。如之前觀察了主要移植機(jī)能，如果至少連續(xù)兩天血糖水平已經(jīng)增加至高于500mg/dl，就認(rèn)為是移植排斥。
作為對照，將從相同細(xì)胞系制得的但是沒有用米非司酮預(yù)處理并因此也沒有表達(dá)任何基因開關(guān)調(diào)控MutIL-15/mFc的胰島素生成細(xì)胞移植入接受者動物中?；蛘?，還可能的是使用含有MutIL-15/mFc構(gòu)建體但沒有基因開關(guān)的胰島素生成細(xì)胞。
已經(jīng)接受源自干細(xì)胞的胰島素生成細(xì)胞之后用外部添加MutIL-15/mFc處理的動物作為進(jìn)一步的對照。
已經(jīng)接受從干細(xì)胞制得的胰島素生成細(xì)胞動物的血糖水平的研究顯示了細(xì)胞移植在用米非司酮處理的動物中的功能活性時間是相對長的。
權(quán)利要求
1.人或動物的非全能性細(xì)胞，包括至少一種核酸，所述核酸在由添加活性物質(zhì)調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)控制下編碼至少一種免疫調(diào)節(jié)劑。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，特征在于細(xì)胞是干細(xì)胞、前體細(xì)胞和/或永生化細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞，特征在于其是多能性或多效性的胚胎、胎兒、新生兒或成人干細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1至3至少一種所述的細(xì)胞，其是細(xì)胞系的形式。
5.如權(quán)利要求1至4至少一種所述的細(xì)胞，特征在于可調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)是黃體酮基因表達(dá)系統(tǒng)、四環(huán)素表達(dá)系統(tǒng)和/或雷帕霉素基因表達(dá)系統(tǒng)。
6.如權(quán)利要求1至5至少一項所述的細(xì)胞，特征在于免疫調(diào)節(jié)劑具有至少一種以下的功能特征a.抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原識別，b.抑制通過T細(xì)胞上受體介導(dǎo)的信號，c.激活通過T細(xì)胞上受體介導(dǎo)的信號，d.抑制T細(xì)胞生長，e.抑制支持T細(xì)胞存活的分子，f.抑制T細(xì)胞的效應(yīng)物(如TNF-α、IFN-γ)，g.抑制T細(xì)胞的粘著，h.抑制T細(xì)胞的協(xié)同刺激相互作用(通過兩個信號進(jìn)行淋巴細(xì)胞的激活首先，進(jìn)行通過抗原受體的刺激，其次，產(chǎn)生非標(biāo)記淋巴細(xì)胞克隆擴(kuò)增和分化的另一個信號；該協(xié)同刺激相互作用可以通過免疫調(diào)節(jié)劑來抑制)，i.抑制參與免疫反應(yīng)的更多細(xì)胞的活化、增殖、存活、抗原提呈、信號，和/或效應(yīng)物功能，如普通和特異性抗原提呈細(xì)胞，尤其，例如，樹狀細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞，通過表面受體或通過分泌分子如細(xì)胞因子、趨化因子或生長因子抑制參與免疫反應(yīng)的不同細(xì)胞的細(xì)胞相互作用，如，普通和特異性抗原提呈細(xì)胞，尤其，例如，樹狀細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞，j.抑制參與免疫反應(yīng)細(xì)胞的遷移，如特異性抗原提呈細(xì)胞，尤其是，例如，樹狀細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞，k.抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的成分，l.結(jié)合外源或自體免疫抗原呈現(xiàn)或通過將抗體結(jié)合至抗原來抑制吞噬細(xì)胞活性，和/或m.抑制炎癥反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求1至6至少一種所述的細(xì)胞，特征在于免疫調(diào)節(jié)劑是抗體。
8.如權(quán)利要求1至6至少一項所述的細(xì)胞，特征在于免疫調(diào)節(jié)劑是d.受體，e.可溶分泌受體，f.分泌蛋白質(zhì)或肽。
9.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其中免疫調(diào)節(jié)劑是突變IL15和Fc片段的融合蛋白，所述Fc片段融合至突變IL15分子的C末端，優(yōu)選通過鉸鏈區(qū)融合。
10.如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞，特征在于抗體的Fc片段是IgG的Fc片段，尤其是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或類似哺乳動物IgG或IgM，尤其是人IgM或類似哺乳動物IgM。
11.如權(quán)利要求1至10至少一項所述的細(xì)胞，特征在于核酸另外編碼了選擇盒，尤其是合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因和/或分化標(biāo)記基因。
12.如權(quán)利要求1至11至少一項所述的細(xì)胞，特征在于核酸另外編碼了抑制NK細(xì)胞和/或殺傷細(xì)胞的分子。
13.如權(quán)利要求1至11至少一項所述的細(xì)胞，特征在于核酸另外編碼了抑制以下的分子a.樹狀細(xì)胞，b.單核細(xì)胞和/或或巨噬細(xì)胞，c.B細(xì)胞，d.多形核細(xì)胞，例如嗜中性粒細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，特征在于所述抑制分子是人MHC I型分子、嵌合的MHC I型分子或病毒MHC I型同系物。
15.一種核酸，編碼至少一種免疫調(diào)節(jié)劑和至少一種由添加活性物質(zhì)調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)。
16.一種載體，包括至少一項如權(quán)利要求15所述的核酸。
17.一種藥物，包括至少一項如權(quán)利要求1至14任一所述的細(xì)胞和合適的賦形劑和/或添加劑。
18.人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官，包括至少一種如權(quán)利要求1至14任一項所述的細(xì)胞。
19.轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，包括至少一種如權(quán)利要求1至14任一項所述的細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求1至14任一項所述的細(xì)胞和/或如權(quán)利要求18所述的人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官用于移植入人或哺乳動物的用途。
21.如權(quán)利要求20所述的用途，特征在于是自體、同種異體或異種移植。
22.如權(quán)利要求1至14任一項所述的細(xì)胞、如權(quán)利要求15所述的核酸、如權(quán)利要求18所述的人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官用于制備抑制人或哺乳動物移植排斥藥物的用途，其中合適的是至少存在一種免疫調(diào)節(jié)劑。
23.如權(quán)利要求1至14任一項所述的細(xì)胞、如權(quán)利要求15所述的核酸、如權(quán)利要求18所述的人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官用于制備預(yù)防和/或治療由移植引起的疾病和或自體免疫疾病藥物的用途。
24.一種制備如權(quán)利要求1至14任一項所述細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟c.將至少一種如權(quán)利要求15所述的核酸和/或至少一種如權(quán)利要求
16所述的載體引入可移植人或動物非全能性細(xì)胞中，和d.添加至少一種合適的調(diào)控基因開關(guān)的活性物質(zhì)來表達(dá)所述核酸。
25.一種體外制備如權(quán)利要求18所述的人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官的方法，該方法包括以下步驟e.將至少一種如權(quán)利要求15所述的核酸和/或至少一種如權(quán)利要求16所述的載體以及至少一種分化標(biāo)記基因引入至少一種非全能性干細(xì)胞、非全能性前體細(xì)胞和/或非全能性永生化細(xì)胞中，f.分化步驟a的細(xì)胞，g.選擇步驟b的分化細(xì)胞，和h.將步驟c所選的細(xì)胞引入人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官中。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，特征在于步驟a之后、之前或同時將至少一種合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因引入至少一種非全能性干細(xì)胞、非全能性前體細(xì)胞和/或非全能性永生化細(xì)胞中，并擇優(yōu)在步驟a之后選擇步驟a的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
27.如權(quán)利要求25和26之一所述的方法，特征在于干細(xì)胞是多能性或多效性的胚胎、胎兒、新生兒或成人干細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求18中所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的方法，該方法包括以下步驟f.將至少一種如權(quán)利要求15所述的核酸和/或至少一種如權(quán)利要求16所述的載體和至少一種合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因引入非人哺乳動物的至少一種卵母細(xì)胞、干細(xì)胞、前體細(xì)胞和/或永生化細(xì)胞中，g.選擇步驟a的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，h.將根據(jù)步驟b所選的細(xì)胞引入至少一種非人哺乳動物胚細(xì)胞中，i.將步驟c的胚細(xì)胞引入非人哺乳動物代母中，和j.鑒定從所述胚胎發(fā)展而來的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，特征在于干細(xì)胞是多能性或多效性的胚胎、胎兒、新生兒或成人干細(xì)胞。
30.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的方法，該方法包括以下步驟d.將至少一種如權(quán)利要求15所述的核酸和/或至少一種如權(quán)利要求16所述的載體和至少一種合適的轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因引入非人哺乳動物兩個受精卵母細(xì)胞原核中的一個，e.將步驟a的哺乳動物卵母細(xì)胞引入非人哺乳動物代母中，和f.鑒定從所述哺乳動物卵母細(xì)胞發(fā)育而來的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
31.轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，特征在于是通過如權(quán)利要求28和29之一所述的方法產(chǎn)生的。
32.轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，特征在于是如權(quán)利要求30所述的哺乳動物的后代。
33.如權(quán)利要求19、30和31任一項所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物用于獲得同種異體和/或異體移植中所用的非人細(xì)胞、非人器官特異性組織和/或非人哺乳動物器官的用途。
34.如權(quán)利要求19、30和31任一項所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物、如權(quán)利要求18所述的人或動物器官特異性組織和/或人或哺乳動物器官用于尋找藥物學(xué)活性物質(zhì)和/或鑒定毒性物質(zhì)的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及人或動物的非全能性細(xì)胞，其包含至少一種核酸，其通過由添加活性物質(zhì)調(diào)節(jié)的基因開關(guān)分子控制來編碼至少一種免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明還涉及其生產(chǎn)和在移植中的用途，為了抑制移植排斥以及用于預(yù)防和/或治療由移植引起的疾病和/或自體免疫疾病。
文檔編號A61K35/12GK1705744SQ200380101413
公開日2005年12月7日 申請日期2003年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月14日
發(fā)明者M·布爾欽, S·埃塞爾, M·呂迪格 申請人:豪夫邁－羅氏公司