專利名稱：一種改變植物中葉綠素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改變植物中葉綠素含量的方法。
背景技術(shù)：
光合作用是地球上最大規(guī)模利用太陽能的過程，它為幾乎所有的生命活動提供有機物、能量和氧氣。每年地球上通過光合作用合成的有機物約為2200億噸，相當(dāng)于人類每年所需能耗的10倍。植物干物質(zhì)的90% -95%來自光合作用的產(chǎn)物，光合作用是作物產(chǎn)量形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。光合作用主要在植物葉片的葉綠體中進行，需要一系列的色素和蛋白復(fù)合體的參與。葉綠素是吸收光能的主要色素，葉綠素的減少或缺失將使葉片顏色變淺，直接影響光合作用的效率和功能。隨著植物分子生物學(xué)和生物化學(xué)的發(fā)展，人們分離克隆了催化葉綠素合成的各種酶及其基因。然而，葉綠素的合成受到體內(nèi)和環(huán)境因子的調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)作用又是受核基因和(或)質(zhì)體基因的控制，因此，葉綠素的合成和降解存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。分離和克隆關(guān)鍵或重要的調(diào)控因子，對揭示葉綠素的代謝，通過人工改造提高光能利用效率具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種降低植物中葉綠素含量的方法。本發(fā)明所提供的降低植物中葉綠素含量的方法，包括如下步驟使出發(fā)植物中的 FHY3蛋白的編碼基因功能喪失，得到目的植物；所述目的植物的葉綠素含量低于所述出發(fā)植物和/或所述目的植物的光系統(tǒng)II光化學(xué)效率低于所述出發(fā)植物。上述方法中，所述FHY3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；上述方法中，所述FHY3蛋白的編碼基因為如下1)或2)或3)所示1)核苷酸序列是SEQ ID NO 1所示DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述FHY3蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述FHY3蛋白的DNA分子。上述方法中，所述使出發(fā)植物中的FHTO蛋白的編碼基因功能喪失是通過向所述出發(fā)植物中導(dǎo)入干擾載體實現(xiàn)的；所述干擾載體為向載體PART27的NotI和NotI酶切位點間插入如下DNA片段得到的由CaMV35S啟動子、FHY3正向片段、內(nèi)含子、FHY3反向片段和 OCS終止子依次連接而成的DNA片段；所述FOT3正向片段的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示；所述FHY3反向片段的核苷酸序列是所述FOT3正向片段的反向互補序列；所述內(nèi)含子的核苷酸序列如SEQ ID NO 6 所示。所述CaMV35S啟動子的核苷酸序列為GenBank AJ311873所示的核苷酸序列中第 3104-4449位核苷酸所示；所述OCS終止子的核苷酸序列為GenBank AJ311873所示的核苷酸序列中第4493-5234位核苷酸所示。
上述方法中，所述干擾載體按照包括如下步驟的方法制備得到以擬南芥的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示引物對進行 PCR擴增，得到PCR擴增片段；用BamHI和ClaI酶切所述PCR擴增片段，回收酶切產(chǎn)物，記作產(chǎn)物I ；用BamHI和 ClaI酶切載體pKANNIBAL，回收載體大片段，記作產(chǎn)物II ；將產(chǎn)物I和產(chǎn)物II進行連接，得到重組載體，記作中間重組載體I ；用BioI和KpnI酶切所述PCR擴增片段，回收酶切產(chǎn)物，記作產(chǎn)物III ；用BioI和 KpnI所述中間重組載體I，回收載體大片段，記作產(chǎn)物IV ；將產(chǎn)物III和產(chǎn)物IV進行連接， 得到重組載體，記作中間重組載體II ；用NotI酶切所述中間重組載體II，回收小片段，記作產(chǎn)物V ；用NotI酶切載體 PART27，回收載體大片段，記作產(chǎn)物VI ；將產(chǎn)物V和產(chǎn)物VI進行連接，得到重組載體，即為所述干擾載體。上述方法中，所述葉綠素含量為葉片中的葉綠素含量；所述光系統(tǒng)II光化學(xué)效率為葉片的光系統(tǒng)II光化學(xué)效率；上述方法中，所述葉綠素為葉綠素a和/或葉綠素b ；上述方法中，所述出發(fā)植物為擬南芥。本發(fā)明的另一個目的是提供一種蛋白。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與葉綠素合成相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。上述任一所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述編碼基因為如下1)或2)或3)或4)所示1)其核苷酸序列是SEQ ID NO 1所示DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。擴增上述任一所述編碼基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍；所述引物對中的一條引物序列如SEQ ID NO :3所示，所述引物對中的另一條引物序列如 SEQ ID NO 4 所示。本發(fā)明通過RNAi抑制FHY3基因，獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為葉片葉綠素含量下降，造成葉色變淡，光合作用的光化學(xué)效率降低。本發(fā)明方法在植物的遺傳育種領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為干擾植物和野生型植物的表型。圖2為干擾植株的鑒定。圖3為干擾載體的鑒定。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。擬南芥中FHY3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。其編碼的蛋白序列如SEQ ID NO 2 所示。實施例1、改變植物中葉綠素含量的方法一、干擾載體的構(gòu)建及驗證ic # pKANNIBAL ^ ^； K (Chris Helliwell and Peter Waterhouse, Methods, 2003,30 :289-295)中公開過，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。雙元載體pART27在文獻(AndrewP Gleave,Plant Molecular Biology, 1992,20 1203-1207)中公開過，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。農(nóng)桿菌 GV3101 菌株在文獻(Steven J Clough and Andrew F Bent, Plant Journal, 1998，16 :735-743)中公開過，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。植物反義抑制載體構(gòu)建過程中PCR擴增片段也可按照如下方法得到人工合成 SEQ ID NO 5 所示 DNA 片段，作為模板，用引物 Pl (5，-CTAGGATCCCTCGAGATGGATATAGATCTTC GACTAC-3，) (SEQ ID NO 3)和 P2(5，-GTAGGTACCATCGATACCAGCCATATTCTCTGGATC-3‘ ) (SEQ ID NO 4)進行PCR擴增，得到PCR擴增片段。植物反義抑制載體構(gòu)建在FHY3基因的開放讀碼框區(qū)設(shè)計引物Pl (5，-CTAGGATCC CTCGAGATGGATATAGATCTTCGACTAC-3') (SEQ ID NO 3)和 P2 (S^GTAGGTACCATCGATACCAGCCA TATTCTCTGGATC-3，)(SEQ ID NO :4)，引物上包含了用于克隆的酶切位點。通過PCR從野生型擬南芥(N0生態(tài)型)DNA擴增目的片段，PCR反應(yīng)程序為94°C 3分鐘；94°C 50秒，58°C 50 秒，72°C 1分鐘，30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘?？寺》?步進行第一步，PCR產(chǎn)物分離純化后，用BamHI和ClaI酶切，載體pKANNIBAL也用BamHI和ClaI酶切，回收純化后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，用LB+Kan培養(yǎng)基篩選陽性克隆，并通過PCR和酶切鑒定，得到中間載體A。第二步，PCR擴增產(chǎn)物用BioI和KpnI酶切，中間載體A用BioI和KpnI酶切，兩者回收純化后連接并轉(zhuǎn)化DH5 α，用LB+Kan培養(yǎng)基篩選陽性克隆，并通過PCR和酶切鑒定，得到中間載體B。第三步，中間載體B和雙元載體pART27均用NotI酶切，回收純化后連接并轉(zhuǎn)化DH5ci，用LB+Spec培養(yǎng)基篩選陽性克隆，得到最后目的載體pFHY3-RNAi。將 pFHY3-RNAi進行PCR鑒定和酶切鑒定，PCR鑒定所用的引物為Pl和P2，結(jié)果如圖3A所示， 獲得目的片段；酶切鑒定結(jié)果如圖3B所示，大片段為載體，小片段為插入的序列。(圖3A 中，泳道1為marker，泳道2為PCR擴增產(chǎn)物；圖3B中，泳道1為marker，泳道2為空載體對照酶切；泳道3為目的載體酶切)。雙元載體pART27中的NotI和NotI酶切位點間插入了如下序列CaMV35S啟動子-FHY3(l-444bp)正向序列-內(nèi)含子(742bp)-FHY3 (l_444bp)反向序列-OCS終止子。 FHY3(l-444bp)正向序列的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，內(nèi)含子(742bp)的核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示；FHY3(l-444bp)反向序列是FHY3 (l_444bp)正向序列的反向互補序列。CaMV35S啟動子的核苷酸序列是GenBank AJ311873所示的核苷酸序列中第 3104-4449位核苷酸；OCS終止子的核苷酸序列是GenBank AJ311873所示的核苷酸序列中第4493-5234位核苷酸。
二、干擾植物的構(gòu)建及驗證植物轉(zhuǎn)化將植物雙元載體pFHY3_RNAi用電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株，在 LB+Spec+Gent抗性培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。用花浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥NO野生型植株。轉(zhuǎn)基因植物的篩選與鑒定農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后獲得Tl代種子，在MS+卡那霉素50mg/L 培養(yǎng)基上生長7至10天，篩選抗性植株，并轉(zhuǎn)到培養(yǎng)土中生長。經(jīng)自交結(jié)實后收T2代種子， 種子在卡那霉素50mg/L培養(yǎng)基上萌發(fā)，觀察抗性和敏感植株的比例，符合3 1比例，表明外源基因以單拷貝整合到基因組中。再經(jīng)自交結(jié)實獲得T3代種子，獲得T3代種子，在MS+卡那霉素50mg/L培養(yǎng)基上篩選100%抗性植株，表明純合體。純合體和野生對照在光下生長7天，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用引物Pl和 P2PCR擴增，經(jīng)凝膠電泳比較目的帶的亮度。以看家基因Actin作為對照。RT-PCR實驗表明與野生型相比，該純合體中沒有檢測到內(nèi)源FHY3基因表達，說明FHY3基因被反義抑制， 純合體中的內(nèi)源FOT3基因不表達(圖2，WT表示野生型，RNAi表示干擾植株)，表明外源 RNAi使內(nèi)源FOT3基因發(fā)生了沉默，抑制其表達。 以未經(jīng)任何處理的野生型擬南芥為野生型對照。三、干擾植物的功能下述實驗中均以野生型擬南芥(NO生態(tài)型)為野生型對照。(一 )葉片顏色將T3代純合體在長日照(16小時光照/8小時黑暗)條件下生長4周，觀察植株的葉片顏色。轉(zhuǎn)基因植株的葉片顏色明顯比野生型對照淺(圖1，A表示野生型，B表示干擾植株)。( 二)葉綠素含量檢測用80%丙酮提取法提取葉片葉綠素，在波長663nm和645nm測定吸收，計算葉綠素含量。葉綠素a含量計算公式為12. 7XA663-2. 69XA645。葉綠素b含量計算公式為22. 9 X A645-4. 48 X A663。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果干擾植株中，葉綠素a含量為252. 7士36.2 (ng/mg FW)，葉綠素b含量為 107. 6士8. 7(ng/mg Fff)；野生型對照中，葉綠素a含量為425. 5士62. 4(ng/mg FW)，葉綠素 b含量為168. 5 士 16. 1 (ng/mg Fff)。干擾植株的葉綠素a和葉綠素b含量均比野生型對照低，說明干擾基因FHY3的表達，降低了葉綠素a和葉綠素b含量。(三)用PAM-2000(德國Walz公司)測定葉片的光系統(tǒng)II光化學(xué)效率Fv/Fm比值。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果干擾植株中，F(xiàn)v/Fm比值為0. 62 士 0. 06 ；野生型對照中，F(xiàn)v/Fm比值為 0. 81 士0. 04。干擾植株中Fv/Fm比值比野生型對照中低，說明基因FHY3被干擾后，植株光化學(xué)效率下降。
權(quán)利要求
1.一種降低植物中葉綠素含量的方法，包括如下步驟使出發(fā)植物中的FHTO蛋白的編碼基因功能喪失，得到目的植物；所述目的植物的葉綠素含量低于所述出發(fā)植物和/或所述目的植物的光系統(tǒng)II光化學(xué)效率低于所述出發(fā)植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述FHTO蛋白的氨基酸序列如SEQID NO :2所示；所述FHY3蛋白的編碼基因為如下1)或2)或3)所示1)核苷酸序列是SEQID NO 1所示DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述FHY3蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述FOT3蛋白的DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述使出發(fā)植物中的FHY3蛋白的編碼基因功能喪失是通過向所述出發(fā)植物中導(dǎo)入干擾載體實現(xiàn)的；所述干擾載體為向載體 PART27的NotI和NotI酶切位點間插入如下DNA片段得到的由CaMV35S啟動子、FHY3正向片段、內(nèi)含子、FHY3反向片段和OCS終止子依次連接而成的DNA片段；所述FHY3正向片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；所述FHY3反向片段的核苷酸序列是所述FOT3正向片段的反向互補序列；所述內(nèi)含子的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述CaMV35S啟動子的核苷酸序列為GenBankAJ311873所示的核苷酸序列中第3104-4449位核苷酸所示；所述OCS終止子的核苷酸序列為GenBank AJ311873所示的核苷酸序列中第4493-5234位核苷酸所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述干擾載體按照包括如下步驟的方法制備得到以擬南芥的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示引物對進行PCR 擴增，得到PCR擴增片段；用BamHI和ClaI酶切所述PCR擴增片段，回收酶切產(chǎn)物，記作產(chǎn)物I ；用BamHI和ClaI 酶切載體PKANNIBAL，回收載體大片段，記作產(chǎn)物II ；將產(chǎn)物I和產(chǎn)物II進行連接，得到重組載體，記作中間重組載體I ；用BioI和KpnI酶切所述PCR擴增片段，回收酶切產(chǎn)物，記作產(chǎn)物III ；用BioI和KpnI 所述中間重組載體I，回收載體大片段，記作產(chǎn)物IV ；將產(chǎn)物III和產(chǎn)物IV進行連接，得到重組載體，記作中間重組載體II ；用NotI酶切所述中間重組載體II，回收小片段，記作產(chǎn)物V ；用NotI酶切載體pART27， 回收載體大片段，記作產(chǎn)物VI ；將產(chǎn)物V和產(chǎn)物VI進行連接，得到重組載體，即為所述干擾載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述葉綠素含量為葉片中的葉綠素含量；所述光系統(tǒng)II光化學(xué)效率為葉片的光系統(tǒng)II光化學(xué)效率；所述葉綠素為葉綠素a和/或葉綠素b ；所述出發(fā)植物為擬南芥。
7.一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由SEQID NO :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將SEQID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與葉綠素合成相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7所述蛋白的編碼基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)或2)或3) 或4)所示1)其核苷酸序列是SEQID NO 1所示DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
10.擴增權(quán)利要求8或9所述編碼基因全長或其任意片段的引物對；所述引物對中的一條引物序列如SEQ ID NO 3所示，所述引物對中的另一條引物序列如SEQ IDNO 4所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改變植物中葉綠素含量的方法。該方法包括如下步驟使出發(fā)植物中的FHY3蛋白的編碼基因功能喪失，得到目的植物；所述目的植物的葉綠素含量低于所述出發(fā)植物和/或所述目的植物的光系統(tǒng)II光化學(xué)效率低于所述出發(fā)植物。本發(fā)明通過RNAi抑制FHY3基因，獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為葉片葉綠素含量下降，造成葉色變淡，光合作用的光化學(xué)效率降低。本發(fā)明方法在植物的遺傳育種領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/82GK102409062SQ20101028843
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月20日
發(fā)明者唐為江, 景艷軍, 林榮呈 申請人:中國科學(xué)院植物研究所