專利名稱：水稻高葉綠素含量突變基因det1及其重組植物超表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，特別涉及水稻高葉綠素含量突變基因DET1 ，還涉及該突變 基因的重組植物超表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
水稻是C3植物，其光呼吸較強(qiáng)，有效光合速率較低，尤其是在高溫伏旱區(qū)水稻的灌 漿期，由于氣溫高，其光呼吸將浪費大量的光合產(chǎn)物，不但會影響產(chǎn)量，還會嚴(yán)重影響米質(zhì)。 因此，提高有效光合速率是提高水稻產(chǎn)量和改善米質(zhì)的一條有效途徑。提高有效光合速率 的途徑是降低光呼吸或提高光合速率，而C3植物的生理和解剖結(jié)構(gòu)決定了其高光呼吸特 性，由于葉綠素是水稻光合作用必備的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，通過提高葉綠素含量來提高光合速 率是提高水稻有效光合速率的一條有效途徑。發(fā)明人在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)了一個由簡單遺傳的高葉綠素性狀的突變株系， 并對其遺傳行為和生理功能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該性狀由顯性單基因控制；該基因的主 要生理功能是通過顯著提高葉綠素b的含量來實現(xiàn)總?cè)~綠素含量的提高，從而通過提高 對光能的“捕捉”能力來提高光合速率，可提高生物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量16%以上，降低堊白 粒率17%左右；分子標(biāo)記定位結(jié)果顯示該基因定位于水稻第1染色體短臂，與微衛(wèi)星標(biāo)記 RM 6464、RM6340和RM462之間的遺傳距離分別為0cM、0. 588cM和1. 18cM(李賢勇等.一 個水稻高葉綠素含量基因的發(fā)現(xiàn).西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，15 (4) :122-123;李賢勇等.一個 水稻高葉綠素基因的生物學(xué)特性研究.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2004，17 (3) 292-294 ；Wang FH et al. Heredity,physiology and mapping of a chlorophyll content gene of rice(Oryza sativa L.). Journal of Plant Physiology, 2008,165(3) :324_330)。因此，確定該基因的 核苷酸序列，將有利于高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻的育種研究，促進(jìn)水稻生產(chǎn)上一個新的臺階。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供水稻高葉綠素含量突變基因的核苷酸序 列；目的之二在于提供所述水稻高葉綠素含量突變基因的重組植物超表達(dá)載體，從而為水 稻轉(zhuǎn)基因研究提供有力的工具，促進(jìn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻的育種研究。為達(dá)到上述目的，首先，本發(fā)明提供了水稻高葉綠素含量突變基因DET1，具有如 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明在前期基因定位的基礎(chǔ)上，先通過基因預(yù)測、同源搜索及基因序列差異比 較，初步確定了水稻高葉綠素含量突變基因為DETl (DE-ETIOLATED 1)。隨后，本發(fā)明以水稻 高葉綠素突變體為材料，克隆了突變基因DETl的cDNA。測序結(jié)果顯示突變基因DETl全 長cDNA為1536bp，由11個外顯子組成，編碼512個氨基酸。與野生型珍汕97B相比，突變 基因DETl在第7個外顯子上有T-C的轉(zhuǎn)換，該改變引入了一個EcoR I酶切位點，并導(dǎo)致第 328位的亮氨酸(L)改變?yōu)榻z氨酸(S)，且突變位點處于高度保守區(qū)域內(nèi)。突變基因DETl的氨基酸序列與玉米等其它高等植物的氨基酸序列同源性高達(dá)62%以上。其次，本發(fā)明提供了含有所述水稻高葉綠素含量突變基因DETl的重組植物超表 達(dá)載體。進(jìn)一步，所述重組植物超表達(dá)載體是在pCUPHN載體的多克隆位點中插入水稻高 葉綠素含量突變基因DETl而獲得；所述pCUPHN載體由pCAMBIA_1300載體改造而來，即在 pCAMBIA-1300載體的多克隆位點處通過限制性內(nèi)切酶PstI引入玉米泛素啟動子基因，之 后通過Sac I和Spe I引入HA標(biāo)簽基因，再通過Spe I及EcoR I引入終止子NOS基因。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了一個與水稻葉綠素含量提高相關(guān)的突變基 因DET1，并構(gòu)建了其重組植物超表達(dá)載體，為水稻轉(zhuǎn)基因研究提供了有力的工具，可促進(jìn)高 產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻的育種研究。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述，其中圖1為基因DETl的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，1泳道為DL2，000DNA Marker，2泳道為空白對照，3泳道為DETl (高葉綠素突變體)的RT-PCR產(chǎn)物， 4泳道為DETl (野生型)的RT-PCR產(chǎn)物；圖2為重組載體pMD19T-DETl的酶切鑒定，1泳道為DNA Marker III，2泳道為Spe I酶切pMD19T-DETl (高葉綠素突變體)，3泳道為Spe I/BamH I酶切pMD19T_DETl (高葉 綠素突變體)，4泳道為Spe I酶切pMD19T-DETl(野生型)，5泳道為Spe I/BamH I酶切 PMD19T-DET1 (野生型)；圖3為基因DETl包含突變位點的部分核苷酸序列對比結(jié)果，下劃線部分為突變引 入的EcoR I酶切位點；圖4為基因DETl編碼蛋白的氨基酸同源性對比結(jié)果，箭頭所指處為基因DETl的 突變位點，下劃線所示區(qū)域為基因DETl的高度保守區(qū)域；圖5為基因DETl的系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖6為基因DETl編碼蛋白的親水性和疏水性分析；圖7為突變基因DETl重組植物超表達(dá)載體pCUPHN-DETl的構(gòu)建示意圖；圖8為突變基因DETl重組植物超表達(dá)載體pCUPHN-DETl的PCR鑒定，1泳道為 DNAMarker III，2泳道為空白對照，3泳道為pCUPHN-DETl的PCR產(chǎn)物，4泳道為pCUPHN的 PCR產(chǎn)物(陰性對照)，5泳道為pMD19T-DETl的PCR產(chǎn)物(陽性對照)；圖9為突變基因DETl重組植物超表達(dá)載體pCUPHN-DETl的酶切鑒定，1泳道為 λ -Hind III DNA Marker，2 泳道為 Spe I 酶切 pCUPHN-DETl，3 泳道為 Spe I/BamH I 酶切 pCUPHN-DETl，4 泳道為 Spe I 酶切 pCUPHN，5 泳道為 Spe I/BamH I 酶切 pCUPHN，6 泳道為 DNA Marker III。
具體實施例方式
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實施例中使用的材料野生型水稻材料珍汕97B(Wt.)和高葉綠素突變體(Mut.)由重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA 聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、PMD19-T載體、Trizo 1試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、 質(zhì)粒提取試劑盒、λ-Hind III DNA Marker 及 DL2, 000DNA Marker 購自 TaKaRa 公司；DNA Marker III購自天根生化科技(北京)有限公司；氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)和卡拉 霉素(Kanamycin，Kan)為Sigma公司產(chǎn)品；引物合成和DNA測序由上海英俊生物技術(shù)有 限公司完成；其它化學(xué)試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；大腸桿菌JM109、農(nóng)桿菌 GV3101由本實驗室保存。本發(fā)明在前期基因精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，首先通過在線基因預(yù)測(http://mendel. cs. rhul. ac. uk)及 BLAST 在線比對(http//blast, ncbi. nlm. nih. gov/)，初步確定了水稻 高葉綠素含量突變基因為DET1?；駾ETl在番茄、擬南芥、玉米、高粱中有報道。在番茄 中，基因DETl使總?cè)~綠素含量提高，整個植株均表現(xiàn)為深綠色。在擬南芥中，基因DETl調(diào) 控一光調(diào)控啟動子的啟動能力，當(dāng)喜光植物擬南芥處于黑暗環(huán)境中時，基因DETl通過時空 調(diào)節(jié)光調(diào)控啟動子的啟動能力；此外，基因DETl還可以通過調(diào)節(jié)蛋白酶體的降解來調(diào)控擬 南芥的晝夜紀(jì)律鐘。隨后，本發(fā)明以水稻高葉綠素突變體為材料，克隆了突變基因DETl的cDNA，利用 生物信息學(xué)手段對突變基因DETl的核苷酸序列、進(jìn)化樹、編碼蛋白的理化性質(zhì)及親疏水性 等進(jìn)行了分析，并構(gòu)建了突變基因DETl重組植物超表達(dá)載體用于水稻的轉(zhuǎn)基因研究。一、突變基因DETl的克隆與測序根據(jù)GenBank已登錄的水稻日本晴基因DETl序列，利用Primer5. 0和01igo6. 0 軟件設(shè)計特異引物上游引物 DETlF :5，-cggatccggtgatggcgaccttcttc-3，(SEQID No. 2)， 下劃線部分為 BamH I 酶切位點；下游引物 DETlR :5'-ggactagtccg-ctcacaactgttacaaatac -3’ (SEQ ID No. 3)，下劃線部分為Spe I酶切位點。分別取水稻野生型和高葉綠素突變體光照培養(yǎng)兩周的幼葉2g，迅速放入液氮中研 磨成粉末，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA。所得水稻野生型和高葉綠素突變體總RNA 的電泳結(jié)果顯示主帶清晰完整，28S和18S的條帶亮度比約為2 1，說明RNA的濃度和純 度符合實驗要求，可以用于合成雙鏈cDNA。分別以所得水稻野生型和高葉綠素突變體總RNA為模板，按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說 明書，使用Oligo(dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ；再以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用特 異引物DET1F/DET1R及高保真DNA聚合酶PFU進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 4分鐘；然后94°C變性30秒，60°C復(fù)性30秒，72°C延伸2分鐘，共32個循環(huán)；最后72°C延 伸10分鐘。將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 0% (g/mL)瓊脂糖凝膠電泳檢測，再按照DNA凝膠回收 試劑盒說明書進(jìn)行切膠回收純化；純化的DNA片段與pMD19-T載體在T4DNA連接酶的作用 下于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平 板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定片段大小后測序，得重組載體PMD19T-DET1。基因DETl的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定如圖1所示，可見DETl (野生型) 和DETl (高葉綠素突變體)的RT-PCR產(chǎn)物均在約1600bp處呈單一特異性條帶，與GenBank 報道的基因DETl大小相符。
重組載體pMD19T-DETl的酶切鑒定結(jié)果如圖2所示，可見pMD19T_DETl (野生型) 和pMD19T-DETl (高葉綠素突變體)用Spe I/BamH I雙酶切均可得到約1600bp的目的片 段，與預(yù)期結(jié)果相符，證實目的片段已連入PMD19-T載體且為正向連接。測序結(jié)果顯示，水稻野生型和高葉綠素突變體的DETl全長cDNA均為1536bp，編 碼512個氨基酸。其中，高葉綠素突變體的DETl全長cDNA序列如SEQ ID No. 1所示。基 因DETl包含突變位點的部分核苷酸序列對比結(jié)果如圖3所示，與野生型相比，高葉綠素突 變體的基因DETl由11個外顯子組成，在第7個外顯子上發(fā)生了 1個堿基突變，即第983位 的T突變?yōu)镃，該突變引入了一個EcoR I酶切位點，并導(dǎo)致了編碼蛋白第328位氨基酸的差 異，野生型為亮氨酸(Leu)，高葉綠素突變體為絲氨酸(Ser)。二、突變基因DETl的生物信息學(xué)分析禾IjM NCBI ψ 白勺 ORF Finder (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html) it 開放賣框i只另ll ；^1Jffl CDD(conserved domain database) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析；利用Clustalx和DNA Man軟 件進(jìn)行氨基酸序列的比對及進(jìn)化樹的生成；利用ExPASy (http ://Cn. expasy. org/)在線分 析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其理化特性。ORF Finder軟件分析顯示突變基因DETl由一個完整且連續(xù)的開放閱讀框組成。⑶D分析顯示基因DETl有兩個高度保守區(qū)域，分別為從第282到336位氨基酸和 第400到442位氨基酸，突變基因DETl的突變位點發(fā)生在第一個高度保守區(qū)域內(nèi)。突變基因DETl編碼蛋白的氨基酸序列比對結(jié)果如圖4所示，突變基因DETl (圖中 表示為 OsDETl)與擬南芥 AtDETl (GenBank 登錄號為 NP_192756)、番茄 SlDETl (GenBank 登 錄號為 Q9ZNU6)、高粱 SbDETl (GenBank 登錄號為 XP_002443935)、玉米 ZmDETl (GenBank 登 錄號為NP_001147932)及蓖麻RcDETl (GenBank登錄號為XP_002519399)編碼蛋白的同源 性高達(dá)62%以上，且突變位點發(fā)生在高度保守區(qū)域內(nèi)。突變基因DETl的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5所示，突變基因DETl (圖中表示為OsDETl)與 高粱SbDETl的親緣性較近，與玉米ZmDETl的親緣性次之。突變基因DETl編碼蛋白的組成及理化性質(zhì)分析表明其編碼蛋白由512個氨基酸 組成，相對分子質(zhì)量為59126. 8，分子式為C2683H4mciN716O768S16，等電點(pi)為7. 65，絲氨酸含 量高達(dá)10. 6%。通過在線軟件ExPASy中的ProtParam工具對突變基因DETl編碼蛋白進(jìn)行親疏 水性分析，結(jié)果如圖6所示，統(tǒng)計結(jié)果顯示GRAVY (Grand average ofhydropathicity)值 為-0. 098，說明突變基因DETl編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)，這可能與基因的功能相關(guān)， 因為葉綠素的合成是一個需要水參與的過程，該基因產(chǎn)物的親水性增加，有利于水分的運 輸，從而加快葉綠素的生物合成。三、突變基因DETl重組植物超表達(dá)載體的構(gòu)建pCUPHN載體由pCAMBIA-1300載體改造而來，即在pCAMBIA_1300載體的多克隆位 點處通過限制性內(nèi)切酶Pst I引入玉米泛素啟動子(Ubi Promter)基因，之后通過Sac I 及SpeI引入HA標(biāo)簽(tag)基因，再通過Spe I及EcoR I引入了終止子NOS基因。玉米泛 素啟動子具有較強(qiáng)的啟動能力，特別適合于在禾本科植物中應(yīng)用。HA tag盡管不是雙元表 達(dá)載體中所必須的，但它的引入為將來分離純化基因的表達(dá)產(chǎn)物提供了很大便利。PCUPHN載體適用于所有植物基因的表達(dá)。將含有突變基因DETl的重組載體PMD19T-DET1用BamH I/Spe I雙酶切，回收突變基因DETl片段，再與同樣經(jīng)BamH I/Spe I雙酶切的pCUPHN載體在T4DNA連接酶的 作用下于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有卡拉霉素的LB 平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定，即得突變基因DETl重組植物超表達(dá)載體 pCUPHN-DETl，其構(gòu)建過程如圖7所示。隨后將pCUPHN_DETl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3103，-80°C保 存?zhèn)溆?。突變基因DETl重組植物超表達(dá)載體pCUPHN-DETl的PCR鑒定和酶切鑒定結(jié)果分 別如圖8和圖9所示，目的片段突變基因DETl已經(jīng)連入pCUPHN載體中。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
水稻高葉綠素含量突變基因DET1，其特征在于具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述水稻高葉綠素含量突變基因DET1的重組植物超表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組植物超表達(dá)載體，其特征在于所述重組植物超表達(dá)載 體是在PCUPHN載體的多克隆位點中插入水稻高葉綠素含量突變基因DET1而獲得；所述 pCUPHN載體由pCAMBIA-1300載體改造而來，即在pCAMBIA_1300載體的多克隆位點處通過 限制性內(nèi)切酶Pst I引入玉米泛素啟動子基因，之后通過Sac I和Spe I引入HA標(biāo)簽基因， 再通過Spe I及EcoR I引入終止子N0S基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻高葉綠素含量突變基因DET1，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，還公開了含有該突變基因的重組植物超表達(dá)載體，為水稻轉(zhuǎn)基因研究提供了有力的工具，可促進(jìn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻的育種研究。
文檔編號C12N15/29GK101831439SQ201010177039
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者岳彩黎, 王貴學(xué), 秦峰, 胡鋒, 黃俊麗 申請人:重慶大學(xué)