專利名稱：檢測母豬總產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)突變等位基因的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測母豬總產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)突變等位基因的方法及其專用試劑盒。
背景技術(shù)：
繁殖力是影響?zhàn)B豬業(yè)的一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，繁殖力的提高無疑將給養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn) 帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，但是如何提高豬繁殖力的育種效率一直是備受關(guān)注的問題。豬的育 種主要分為常規(guī)育種和分子育種兩方面，在傳統(tǒng)育種中，選擇的依據(jù)通常是表現(xiàn)型而非基 因型，這是因?yàn)槿藗儫o法直接知道個(gè)體的基因型，只能從表現(xiàn)型加以推斷。由于數(shù)量性狀的 表現(xiàn)型與基因型之間缺乏明確的對應(yīng)關(guān)系，使得選擇效率不高。要提高選擇的效率，最理想 的方法應(yīng)是能夠直接對基因型進(jìn)行選擇。分子標(biāo)記的基因型是可以識別的，為實(shí)現(xiàn)對基因 型的直接選擇提供了可能，這也是分子標(biāo)記在育種中應(yīng)用的最主要方面。目前，利用目標(biāo)性 狀與標(biāo)記基因型之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇是目前研究的重點(diǎn)之一。紅細(xì)胞生成素受體(Erythropoietin Receptor, EP0R)是哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞發(fā)育過 程中最有效且最主要的調(diào)節(jié)激素受體，它通過與紅細(xì)胞生成素(EPO)相結(jié)合，在紅系祖細(xì) 胞的存活、增殖及分化過程中起調(diào)節(jié)作用。美國學(xué)者Vallet等(2001,2006)研究發(fā)現(xiàn)，EPOR 基因第4內(nèi)含子T等位基因與提高子宮存量顯著相關(guān)(P < 0. 01)。一般來說，子宮存量與 產(chǎn)仔數(shù)是正相關(guān)的，EPOR基因已經(jīng)成為一個(gè)可影響母豬總產(chǎn)仔數(shù)的主效候選基因，具有很 大的研究價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測母豬總產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)突變等位基因的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測母豬總產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)突變等位基因的專用試劑盒。本發(fā)明還一個(gè)目的是提供一種用于檢測母豬總產(chǎn)仔數(shù)性狀的引物對，包括由序列 表中序列ι所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸組成。本發(fā)明的再一個(gè)目的是公開了含有引物對的試劑盒在制備豬的育種方面的應(yīng)用， 特別是在制備高總產(chǎn)仔數(shù)性狀豬方面的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案一種檢測母豬總產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)突變等位基因的方法，其特征在于它是以檢測待測母 豬GenBank Accession Number EU407778的第2348位脫氧核糖核苷酸是T還是C，確定待 測母豬的基因型是TT還是CC，TT基因型的母豬的產(chǎn)仔數(shù)高于CC基因型的母豬的產(chǎn)仔數(shù)； 所述TT基因型為GenBank Accession Number EU407778的自5'末端第2348位脫氧核糖 核苷酸為T的純合體；所述CC基因型為GenBank Accession Number EU407778的自5'末 端第2348位脫氧核糖核苷酸為C的純合體。本發(fā)明所述確定待測母豬GenBank Accession Number EU407778的自5'末端第
32348位脫氧核糖核苷酸是T還是C的方法可采用測序分析、PCR-SSCP法等。
其中測序分析包括PCR擴(kuò)增和對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序的步驟；所述PCR擴(kuò)增用 的引物對為以豬的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物含有GenBank AccessionNumber EU407778的自5'末端第2348位脫氧核糖核苷酸。所述PCR擴(kuò)增所用的引物對具體可為由序列表的序列1所示的核苷酸和序列表的 序列2所示的核苷酸組成的引物對。即上游引物5，-ACTACCCCCTTGTCCCAAAC-3，；下游引物5，-GGACCAAGCCAATCAGAGAA-3，。當(dāng)采用所述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，根據(jù)待測豬的基因組DNA的不同，擴(kuò)增得到的 DNA片段為序列3所示的核苷酸序列或序列4所示的核苷酸序列。所述確定待測母豬的GenBank Accession Number EU407778的自5'末端第2348 位脫氧核糖核苷酸是T還是C的方法也可以是PCR-SSCP法。本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種檢測母豬總產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)突變等位基因的試劑盒，它是由 序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸組成的引物對及Si、S2、S3 三種標(biāo)準(zhǔn)品組成。本發(fā)明所述試劑盒的制備方法，是將引物對，Si、S2和S3在同一聚丙烯酰胺凝膠 中，同時(shí)電泳得到的TT基因型標(biāo)準(zhǔn)品、CC基因型標(biāo)準(zhǔn)品和TC基因型標(biāo)準(zhǔn)品。同時(shí)電泳三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品及以本試劑盒所提供引物擴(kuò)增需檢測豬所得的PCR產(chǎn)物，例 如圖1，可清晰、準(zhǔn)確、快捷的判別所檢豬基因型。本發(fā)明還保護(hù)由序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸組 成的引物對在制備輔助檢測母豬的總產(chǎn)仔數(shù)性狀的試劑盒中的應(yīng)用。所述方法、所述試劑 盒均可用于培育具有高總產(chǎn)仔數(shù)性狀的豬，從而應(yīng)用于豬的育種。所述待測母豬具體可為大白豬，購自總參兵種部種豬場。豬GenBank Accession Number EU407778的自5'末端第2348位脫氧核糖核苷酸 存在一個(gè)脫氧核糖核苷酸的差異(τ/c)。經(jīng)產(chǎn)階段，TT純合基因型群體比AA純合基因型群 體總產(chǎn)仔數(shù)提高約0. 81頭，所以該突變等位基因可作為豬總產(chǎn)仔數(shù)性狀分子育種標(biāo)記。本發(fā)明公開的檢測母豬總產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)突變等位基因的方法及其專用試劑盒所具 有的積極效果在于(1)本發(fā)明使用 PCR-SSCP 方法檢測豬 GenBank Accession Number EU407778 的 自5'末端第315位脫氧核糖核苷酸，基因型判型非常準(zhǔn)確，檢測費(fèi)用低廉，具有很高的育 種實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。用本發(fā)明的方法對豬總產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行選擇，可使豬群經(jīng)產(chǎn)階段總產(chǎn)仔 數(shù)提高約0. 81頭，從而獲得可觀的經(jīng)濟(jì)效益。(2)應(yīng)用本發(fā)明提供的方法對豬進(jìn)行育種，可對待選豬進(jìn)行早期篩選，有效地緩解 實(shí)際生產(chǎn)中的選優(yōu)良種豬時(shí)間長的問題，降低育種花費(fèi)，有效增加實(shí)際生產(chǎn)中的豬總產(chǎn)仔 數(shù)，提高經(jīng)濟(jì)效益。(3)本發(fā)明的檢測方法操作簡單、費(fèi)用低廉、準(zhǔn)確度高，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的直接檢 測。本發(fā)明將在豬的育種工作中發(fā)揮巨大作用。


圖 1 為包含豬GenBank Accession Number EU407778 的自 5'末端第 2348 位脫氧 核糖核苷酸的PCR擴(kuò)增片段的SSCP電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合 成。其中的大白豬購自總參兵種部種豬場。實(shí)施例1、育種方法的建立一、PCR-SSCP檢測方法的建立及多態(tài)性位點(diǎn)確定1、PCR 擴(kuò)增根據(jù)豬GenBank Accession Number EU407778序列設(shè)計(jì)引物，引物如下U(上游引物)5，-ACTACCCCCTTGTCCCAAAC-3，(序列表的序列 1)；D (下游引物):5，-GGACCAA GCCAATCAGAGAA-3，(序列表的序列 2)。選擇大白豬為實(shí)驗(yàn)材料。以大白豬的基因組DNA為模板，使用引物U和D進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為10X buffer 2. 0 μ L, 25 μ mol/L Mg2+2. 0 μ L, 10 μ mol/L dNTPs 0· 4 μ L，10 μ mol/L上、下游引物各0. 4 μ L，模板DNA 50ng, Taq DNA聚合酶0. 3 μ L,超純水 至 20μ L。PCR反應(yīng)條件為95°C變性5min ；然后95°C變性20s，55°C退火30s，72°C延伸30s， 共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測后于-20°C保存。2、SSCP 分析取步驟1的PCR產(chǎn)物各1. 5ul，分別與8. 5ul上樣緩沖液(98%甲酰胺，0. 09%溴 酚藍(lán)，0.09%二甲苯氰，2%甘油，0. lmol/L EDTA)混合，98變性10分鐘，迅速置冰上冷卻10 分鐘，進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(12小時(shí)，電壓8V/cm)，銀染顯色，根據(jù)染色結(jié)果分析 基因型。結(jié)果如圖1所示，上述PCR產(chǎn)物具有三種帶型，表明擴(kuò)增序列存在多態(tài)性位點(diǎn)，純 合基因型豬個(gè)體經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)生2中帶型(cc型、TT型)，分別產(chǎn)生兩條帶，雜合基因型豬個(gè)體 經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)生三條帶(TC型)。3、克隆測序及序列分析分別將兩種純合基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有 限公司)回收純化，回收的DNA片段連接載體pGEM-T (Promega公司)后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞{明日百傲(北京)科技有限公司}，根據(jù)載體上的羧卞青霉素 抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7和SP6 啟動(dòng)子序列為引物對其進(jìn)行核苷酸序列測定(北京優(yōu)博奧生物技術(shù)有限公司)。測序結(jié)果 表明產(chǎn)物1為序列3，產(chǎn)物2為序列4 ；序列3和序列4的長度均為206bp，只存在一個(gè)脫氧 核糖核苷酸的差異(G/A)，該多態(tài)位點(diǎn)(命名為T2348C)位于序列表中自5’端第133位脫 氧核糖核苷酸，即GenBank Accession Number EU407778的自5'末端第2348位脫氧核糖核苷酸。如果待測母豬的T2348C為T時(shí)，其純合體的基因型為TT ；如果待測母豬的T2348C 為C時(shí)，其純合體的基因型為CC ；它們的雜合體基因型為TC。4、三種基因型標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)計(jì)取步驟2中三種基因型PCR產(chǎn)物(TT基因型為Si，CC基因型為S2，TC基因型為 S3)各30ul，分別用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收純化，將純化后 的PCR產(chǎn)物按照上述SSCP凝膠電泳方法進(jìn)行凝膠電泳。從結(jié)果圖1中可以看出，Si、S2、 S3電泳后條帶清晰、無雜帶、判型清楚，在本試劑盒中可制作為標(biāo)準(zhǔn)品S1為TT基因型標(biāo)準(zhǔn) 品，S2為CC基因型標(biāo)準(zhǔn)品，S3為TC基因型標(biāo)準(zhǔn)品。在同一聚丙烯酰胺凝膠中，同時(shí)電泳三 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品及以本試劑盒所提供引物擴(kuò)增需檢測豬所得的PCR產(chǎn)物，例如圖1，可清晰、準(zhǔn)確、 快捷的判別所檢豬基因型。二、T2348C多態(tài)位點(diǎn)與豬總產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性分析為確定T2348C多態(tài)位點(diǎn)與豬總產(chǎn)仔數(shù)是否相關(guān)，以192頭大白豬母豬為實(shí)驗(yàn)材 料，進(jìn)行如下試驗(yàn)提取基因組進(jìn)行PCR-SSCP分析，方法同步驟一；同時(shí)記錄胎次、總產(chǎn)仔數(shù)等表型， 對T2348C位點(diǎn)與總產(chǎn)仔數(shù)開展最小二乘關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果見表1。表1產(chǎn)仔性狀最小二乘均值及EPOR基因T2350C多態(tài)位點(diǎn)與總產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián) 分析
權(quán)利要求
一種檢測母豬總產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)突變等位基因的方法，其特征在于它是以檢測待測母豬GenBank Accession Number EU407778的第2348位脫氧核糖核苷酸是T還是C，確定待測母豬的基因型是TT還是CC，TT基因型的母豬的產(chǎn)仔數(shù)高于CC基因型的母豬的產(chǎn)仔數(shù)；所述TT基因型為GenBank Accession Number EU407778的自5′末端第2348位脫氧核糖核苷酸為T的純合體；所述CC基因型為GenBank Accession Number EU407778的自5′末端第2348位脫氧核糖核苷酸為C的純合體。
2.權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中所述確定待測母豬GenBankAccession NumberEU407778的自5'末端第2348位脫氧核糖核苷酸是T還是C的方法采用測序分析 或 PCR-SSCP 法。
3.權(quán)利要求2所述的檢測方法，其中測序分析包括PCR擴(kuò)增和對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測 序的步驟；所述PCR擴(kuò)增用的引物對為以豬的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物含有 GenBank Accession Number EU407778的自5'末端第2348位脫氧核糖核苷酸。
4.權(quán)利要求3所述的檢測方法，其中所述PCR擴(kuò)增用的引物對為上游引物 5，-ACTACCCCCTTGTCCCAAAC-3，；下游引物5，-GGACCAA GCCAATCAGAGAA-3，。
5.權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其中所述的待測母豬為大白豬。
6.一種檢測母豬總產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)突變等位基因的試劑盒，其特征在于它是由序列表1和 序列表2所示的核苷酸引物對及Si、S2、S3三種標(biāo)準(zhǔn)品組成。
7.權(quán)利要求6所述的試劑盒的制備方法，其特征在于將引物對、Si、S2和S3在同一聚 丙烯酰胺凝膠中同時(shí)電泳得到的TT基因型標(biāo)準(zhǔn)品、CC基因型標(biāo)準(zhǔn)品和TC基因型標(biāo)準(zhǔn)品。
8.權(quán)利要求6所述的試劑盒在制備豬的育種方面的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6所述的試劑盒在制備高總產(chǎn)仔數(shù)性狀豬方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測母豬總產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)突變等位基因的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明提供的方法是以檢測待測母豬GenBank Accession Number EU407778的第2348位脫氧核糖核苷酸是T還是C，確定待測母豬的基因型是TT還是CC，TT基因型的母豬的產(chǎn)仔數(shù)高于CC基因型的母豬的產(chǎn)仔數(shù)；所述TT基因型為GenBank Accession NumberEU407778的自5′末端第2348位脫氧核糖核苷酸為T的純合體；所述CC基因型為GenBank Accession Number EU407778的自5′末端第2348位脫氧核糖核苷酸為C的純合體。應(yīng)用本發(fā)明提供的方法對豬進(jìn)行育種，可對待選豬進(jìn)行早期篩選，有效地緩解實(shí)際生產(chǎn)中的選優(yōu)良種豬時(shí)間長的問題，降低育種花費(fèi)，有效增加實(shí)際生產(chǎn)中的豬總產(chǎn)仔數(shù)，提高經(jīng)濟(jì)效益，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測，將在豬育種中發(fā)揮巨大作用。
文檔編號C12Q1/68GK101942517SQ20101028796
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者張春華, 李千軍, 王立剛, 穆淑琴, 趙宏志, 馬墉, 高榮玲 申請人:天津市畜牧獸醫(yī)研究所