專利名稱：基于ENU誘變產(chǎn)生的Pax6基因突變小鼠在篩選胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因突變小鼠的在藥物篩選中的應(yīng)用，具 體涉及基于ENU誘變產(chǎn)生的Pax6基因突變小鼠在篩選胰高血糖素樣肽-1受體激
動(dòng)劑中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Pax6基因是一種轉(zhuǎn)錄因子,位于人染色體llq3-14 ，其編碼蛋白pax6從 N-末端到C-末端由DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域組成(Susie Jun, 1996， Development 122:2639-2650 );在小鼠中，該基因位于二號(hào)染色體。很多研究 表明Pax6基因在動(dòng)物眼睛、胰腺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起重要作用(T. Ian Simpson, 2002, BioEssays 24:1041-1051 )。但是，目前并不清楚Pax6與 糖代謝之間的確切關(guān)系，對(duì)Pax6的缺失引起的問題如代謝異常也沒有深入研究。 胰高血糖素樣肽l(GLP-l)是來自小腸L細(xì)胞的胰高血糖素原(proglucagon)基 因，proglucagon基因直接受Pax6基因的調(diào)控。根據(jù)最新的文獻(xiàn)報(bào)道，GLP-1 具有促進(jìn)體內(nèi)胰島素合成和分泌從而達(dá)到治療糖尿病的目的(TracyAnn Perry， Trends in pharmacological science 24:377-382)。 GLP-1還具有神經(jīng)調(diào)節(jié)功 能，可延遲胃排空，減少食欲。同時(shí)，GLP-1的降血糖作用是自限的，不會(huì)發(fā)生 低血糖，這些情況對(duì)糖尿病的控制非常有利。因此，從糖尿病治療的角度看， 類似于GLP-1作用的藥物是非常理想的治療糖尿病的藥物。由于GLP-1非常不 穩(wěn)定，在人體內(nèi)會(huì)迅速降解，因此無法作為臨床藥物使用，于是人們從美國西南部大毒蜥唾液中分泌的天然腸促胰島素?cái)M似物(incretin mimetic): Exendin- 4 ，它是一種含有39個(gè)氨基酸的多肽，雖然與哺乳動(dòng)物GLP -1的 氨基酸序列只有53%同源，但ExendinH是胰腺GLP-1受體(glucagon-l ike peptide 1 receptor, GLP-1R )的一種有效的激動(dòng)劑，能模擬GLP-l的作用，從 而達(dá)到控制血糖的效果，由美國A町lin和Lil]y制藥公司共同開發(fā)。人工合成 的exendin-4 (exenatide,商品名為Byetta)是首個(gè)獲準(zhǔn)上巿的腸促胰島素?cái)M 似物，其新藥上巿申請(qǐng)，于2005年4月獲美國FDA批準(zhǔn)，主要用于改善二甲雙 胍和磺酰脲類藥物治療不理想的2型糖尿病患者的血糖控制。
目前，高通量篩選已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)的一個(gè)重要原則和發(fā)展趨勢(shì)。在小 鼠遺傳學(xué)領(lǐng)域，運(yùn)用表型鑒定的方法，篩選化學(xué)誘變或射線誘變的小鼠來建立 人類疾病模型近年來已經(jīng)在發(fā)達(dá)國家流行?；瘜W(xué)誘變劑ENU (N-乙基-N-亞硝基 脲)， 一種化學(xué)小分子，導(dǎo)致的誘變已經(jīng)成為當(dāng)今研究基因功能和產(chǎn)生人類疾病 模型的一種最有力的工具(Nolan, PM等，2000, Nature Genetics 25:440-443 )。 美、英、德、曰、澳和加拿大等國先后建立了基于P,NU誘變的大規(guī)模篩選中心， 數(shù)以千計(jì)新的小鼠品系，模擬人類代謝性疾病、自身免疫疾病、老年性疾病和 神經(jīng)系統(tǒng)疾病的模型正在不斷被建立起來，相關(guān)基因開始被克隆。逐年增加的 突變小鼠資源為人們鑒定新的疾病相關(guān)基因、解釋疾病的病理機(jī)制和發(fā)明新的 治療手段和藥物提供了豐富來源(Balling R, 2001， Annu Rev Genomics Hum Genet. 2: 463-492 )。在國內(nèi)，國家遺傳工程小鼠資源庫和申請(qǐng)人是首家釆取ENU 誘變的方法進(jìn)行人類疾病模型的高通量篩選的。到目前為止，研究人員運(yùn)用ENU誘變方法已經(jīng)得到了 30多種小鼠突變品系，其中包括白內(nèi)障、耳聾、骨密度異 常、肢體缺陷及毛發(fā)異常等，克隆了部分相關(guān)突變基因，這些突變基因?qū)檫@ 些疾病的治療找到新的藥物靶點(diǎn)，同時(shí)這些模型可能可以用于新藥的篩選和開
發(fā)(賀芳等，2003，科學(xué)通報(bào)，48: 2308-2314 )。
但是，對(duì)于2型糖尿病的藥物篩選研究， 一般選用db/db或者ob/ob小鼠， 作為I,eptin信號(hào)通路的遺傳工程小鼠，它們具有肥胖和胰島素耐受等表型，這 與人類中肥胖引起的糖尿病非常類似，因此在這些年的糖尿病藥物篩選中扮演 了非常重要的角色，成為了公認(rèn)的糖尿病藥物動(dòng)物篩選模型。鑒于最近十年來 對(duì)于GLP-1的研究，人們發(fā)現(xiàn)類似于GLP-1作用的藥物也是非常理想的治療糖 尿病的藥物。如果可以篩選出類似于GLP-1作用的藥物，將對(duì)于糖尿病的治療 提供很大的幫助，但是db/db或者ob/ob小鼠的Leptin缺失與GLP-1并無確切 的聯(lián)系，用它們來作為GLP-1受體激動(dòng)劑的篩選并不能特異的反映這些藥物與 GLP-1受體的特異性結(jié)合。用于篩選GLP-1受體激動(dòng)劑的最好的動(dòng)物模型應(yīng)該是 GLP-1基因剔除小鼠，如果有此小鼠模型，使用待篩選的藥物來治療GLP-1基因 剔除小鼠，通過觀察小鼠的異常癥狀的回復(fù)來衡量藥物的有效性。但是目前世 界上尚未有研究小組在小鼠中剔除GLP-1 。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于ENU誘變產(chǎn)生的Pax6基因突變小鼠在篩選 GLP-1受體(GLP-1R)激動(dòng)劑中的應(yīng)用，其特異性強(qiáng)，為篩選治療糖尿病的藥物 提供新途徑。本發(fā)明的原理是建立了直接控制GLP-l表達(dá)的Pax6基因的突變小鼠品系， 這個(gè)小鼠模型完全表現(xiàn)出GLP-1缺失的表型特征，可以替代GLP-1剔除小鼠模 型，進(jìn)行篩選GLP-1受體激動(dòng)劑。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，首先，制備基于ENU誘變產(chǎn)生 的Pax6基因突變小鼠的小鼠模型，其方法包括如下步驟
步驟一、誘變實(shí)驗(yàn)小鼠，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行腹腔注射誘變劑ENU，注射劑量為 75-150mg/kg，注射周期2-4周；將注射周期結(jié)束后60-80天的實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行繁 殖，剔除可育的雄性實(shí)驗(yàn)小鼠，得到的不育的雄性實(shí)驗(yàn)小鼠，即誘變充分的實(shí)
驗(yàn)小鼠；
步驟二、篩選基因突變的實(shí)驗(yàn)小鼠，將誘變充分的實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行繁殖，對(duì) 產(chǎn)生的下 一 代實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行可見異常表型篩選，得到可見異常表型的小鼠即為
基因突變的代謝異常小鼠；
步驟三、確定實(shí)驗(yàn)小鼠的突變基因和突變位點(diǎn)，對(duì)基因突變的代謝異常小
鼠進(jìn)行繁殖，提取其后代小鼠的腿A進(jìn)行PCR反應(yīng)，所得的PCR產(chǎn)物再進(jìn)行瓊 脂糖凝膠電泳分離，分析后確定實(shí)驗(yàn)小鼠的突變基因?yàn)镻ax6基因，突變位點(diǎn)為 Pax6基因編碼序列的第1367位核苷酸；
步驟四、鑒定基因突變的實(shí)驗(yàn)小鼠，提取步驟三中基因突變的代謝異常小 鼠的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)的引物是-f: GATGATGGGAGTTGGGTG和 -r: AAGTTACCAGGTGTGGTGGG,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，所述PCR產(chǎn)物與酶反應(yīng) 體系體積比為l: 1，反應(yīng)溫度35-40。C,反應(yīng)時(shí)間1. 5-2. 5h后，最后進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳，得出小鼠的基因型。
在所述步驟一中，從注射ENU開始和注射周期結(jié)東后的一周內(nèi)向小鼠飲水中添加濃度為150-250mg/L的SDM，此后添加濃度為50-150mg/L的SDM。所述 步驟二中基因突變的代謝異常小鼠包括眼睛異常、糖耐受異常、胰島素分泌異 常、體重和脂肪含量減少、攝食以及活動(dòng)量增加的小鼠。所述Pax6基因編碼序 列的第1367位核苷酸由A到T產(chǎn)生點(diǎn)突變，其編碼的蛋白pax6 (此處用小寫與 Pax6區(qū)別)的266位氨基酸從精氨酸到終止子產(chǎn)生突變。
其次，將上述小鼠模型應(yīng)用在篩選GLP-l受體激動(dòng)劑一一Exendin-4藥物上, 通過實(shí)驗(yàn)證明由本發(fā)明的方法制得的Pax6突變的小鼠模型可以用于GLP-1受 體激動(dòng)劑藥物的篩選。
本發(fā)明用ENU誘變實(shí)驗(yàn)小鼠，致使其精原細(xì)胞發(fā)生點(diǎn)突變，產(chǎn)生遺傳性的眼 睛異常的小鼠，并將突變定位到小鼠二號(hào)染色體56cM附近，通過克隆、測(cè)序得 出該品系(A;rZ+)小鼠在Pax6基因編碼序列的第1367位核甘酸發(fā)生了由A到T 的點(diǎn)突變，從而導(dǎo)致其編碼的蛋白pax6在266位氨基酸從精氨酸到終止子的突 變，得出其Pax6基因缺失了整個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的結(jié)果，同時(shí)也引起直接受P"6基因 調(diào)控的GLP-].的缺失。通過對(duì)A;r《,j、鼠進(jìn)行表型分析，得出A;^' j、鼠除了具 有已知的眼睛異常表型外，還具有糖代謝紊亂的表型的結(jié)論。根據(jù)關(guān)于Pax6轉(zhuǎn) 錄調(diào)控proglucagon (gcg)基因的報(bào)道(Mary E. Hill, Molecular Endocrinology, 1999, 13: 1474 1486 )和Exendin-4對(duì)A^f j、鼠的表型的治 療實(shí)驗(yàn)得出，Ax^+小鼠也具有GLP-l缺失而引起的代謝異常表型，Exendin-4 對(duì)A《f/+小鼠的表型的治療實(shí)驗(yàn)說明A《n、鼠可以應(yīng)用于胰高血糖素樣肽-1 受體(GLP-1R)激動(dòng)劑的篩選。本發(fā)明的有益效果是建立了一個(gè)新的GLP-l缺 失的代謝異常的Pax6突變小鼠模型，并且可以利用該模型來篩選GLP-1受體激動(dòng) 劑，為篩選治療糖尿病的藥物提供新途徑。


圖1為Pax6基因突變小鼠的 一個(gè)異常表型圖。
圖2為Pax6基因編碼區(qū)1367A到T的突變圖。
圖3為預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)域改變圖。
圖4為突變小鼠基因型的鑒定圖。
圖5為野生型小鼠和Pax6突變小鼠的胰腺重量對(duì)比圖。
圖6為野生型小鼠和Pax6突變小鼠的胰島免疫組織化學(xué)染色圖。
圖7為野生型小鼠和Pax6突變小鼠的糖耐受檢測(cè)圖。
圖8為野生型小鼠和Pax6突變小鼠的胰島素耐受檢測(cè)圖。
圖9為野生型小鼠和Pax6突變小鼠的胰島素分泌對(duì)比圖。
圖10為野生型小鼠和Pax6突變小鼠的體重增長曲線對(duì)比圖。
圖11為野生型小鼠和Pax6突變小鼠的脂肪重量對(duì)比圖。
圖12為野生型小鼠和Pax6突變小鼠的日攝食量對(duì)比圖。
圖13為Pax6突變小鼠的Progiucagon (Gcg)基因表達(dá)水平圖。
圖14為Gcg基因在野生型小鼠和Pax6突變小鼠的小腸中的表達(dá)水平圖。
圖15為野生型小鼠和Pax6突變小鼠的GLP-1濃度對(duì)比圖。
圖16為注射Exendin-4的野生型小鼠和Pax6突變小鼠的糖耐受改變圖。
圖17為注射Exendin-4的野生型小鼠和Pax6突變小鼠的胰島素分泌改變圖。
圖18為注射Exendin-4的野生型小鼠和Pax6突變小鼠的攝食量改變圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一
小鼠的飼養(yǎng)和繁育C57BL/6J購自Jackson實(shí)驗(yàn)室(美國),飼養(yǎng)在AAALAC
9認(rèn)證的SPF級(jí)的動(dòng)物房里，動(dòng)物房位于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。所有的小鼠
操作均嚴(yán)格按照"Principles of laboratory animal care"(美國國立衛(wèi)生 院發(fā)行號(hào)85 23， 1985修訂版)和"the care and use of laboratory animals" (美國國家研究理事會(huì)，1996)進(jìn)行，并由模式動(dòng)物研究所動(dòng)物管理委員會(huì)的批 準(zhǔn)和監(jiān)督。
本實(shí)施例包括以下步驟
步驟一、誘變C57BL/6J雄性小鼠取10-14周齡的雄性C57BL/6J小鼠按 100mg/kg體重經(jīng)腹腔注射濃度8mg/mL的誘變劑ENU。每星期固定時(shí)間注射1次， 連續(xù)注射3周。從注射ENU開始向小鼠飲水中添加SDM(磺胺間二甲氧嗜嚏)，用 于預(yù)防由于ENU可能引發(fā)的小鼠免疫系統(tǒng)受損導(dǎo)致的病原微生物感染。注射ENU 期間和注射完畢隨后的l周SDM使用濃度為200mg/L,在此之后的2個(gè)月為100 mg/L。經(jīng)過充分誘變的雄性小鼠約有70天的不育期，將誘變后的雄性小鼠與正 常B6雌性小鼠合籠，進(jìn)行可育性檢驗(yàn)，將70天內(nèi)可育小鼠定義為誘變不充分 的小鼠，不再用于進(jìn)一步試驗(yàn)，通過可育性檢驗(yàn)的小鼠為誘變充分的雄性小鼠。
步驟二、篩選基因突變的實(shí)驗(yàn)小鼠，將誘變充分的雄性小鼠定義為GO代小
鼠，從注射ENU結(jié)束后120天起，將G0代小鼠與正常的B6雌性小鼠合籠交配，
繁殖產(chǎn)生的小鼠定義為Gl代小鼠，用于突變表型的篩選。通過可見異常表型篩
選，篩選出眼睛異常的基因突變小鼠，例如眼睛變小或發(fā)白，見圖l,箭頭標(biāo)注
為眼睛發(fā)育異常的基因突變小鼠。
步驟三、確定實(shí)驗(yàn)小鼠的突變基因和突變位點(diǎn)，通過遺傳連鎖分析和基因 克隆測(cè)序確定突變位置，將基因突變小鼠與C3HeJ近交系小鼠交配產(chǎn)生Fl代小鼠，再將眼睛異常的Fl代雌鼠與C3HeJ雄鼠交配產(chǎn)生N2代小鼠。提取N2小鼠 尾巴DNA，選取Whitehead/MIT數(shù)據(jù)庫(http: 〃www-ge腳e. wi. mit. edu)提供的 任意引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物用4%的瓊脂糖(agarose)凝膠進(jìn)行水平電 泳分離。從98個(gè)N2小鼠的連鎖分析(原理及具體方法詳見冷泉港出版社 扁/，i' a /Wans f町微爾/ 一書中pp. 71-131 ),得出與Pax6位點(diǎn)緊密連 鎖的突變位點(diǎn)，該突變位點(diǎn)在小鼠二號(hào)染色體56cM附近，并通過克隆、測(cè)序得 出該品系小鼠在pax6基因編碼序列的第1 367位核甘酸發(fā)生了由A到T的點(diǎn)突 變，從而導(dǎo)致其編碼的蛋白PAX6在266位氨基酸從精氨酸到終止子的突變，見 圖2,密碼子AGA變成了 TGA,由此得出Pax6基因缺失了整個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，見 圖3。
步驟四、鑒定基因突變的實(shí)驗(yàn)小鼠，采用PCR酶切法鑒定小鼠的基因型，T —A的突變?cè)贒NA序列上與臨近的核苷酸形成了 一個(gè)新的v^力/內(nèi)切酶的識(shí)別位 點(diǎn)。用N2代小鼠尾巴的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物如下-f: GATGAGATGGGAGTTGGGTG 和-r: AAGTTACCAGGTGTGGTGGG。對(duì)所得的P(〕R產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，將10jil的 PCR產(chǎn)物與10|i 1酶反應(yīng)體系(2n 1的NEB緩沖液4, 0. 5 y 1的Hphl酶，7.5 ial雙蒸水)混合，37。反應(yīng)2小時(shí)后，進(jìn)行l(wèi)%agarose膠電泳，得出小鼠的 基因型為野生型(Wt)、雜合子型，z^， (m/+)和純合子型(m/m)，見 圖4。另外，也可以根據(jù)眼睛是否發(fā)育異常來判斷小鼠的基因型，由于純合子小 鼠死于圍產(chǎn)期，所以只有野生型和雜合子小鼠可以存活下來。在分籠時(shí)，將存 在表型小眼或者角膜發(fā)白的小鼠基因型定義為，x^々型，而其它的小鼠則定義 為野生型(Wt)。
以下實(shí)施例均以野生型(Wt)小鼠作為對(duì)照組，在圖中用Control表示。 實(shí)施例二小鼠胰腺的組織學(xué)研究分別取1月齡和1年齡的Wt和； ^(fA小鼠，斷 頸處死，取出胰腺進(jìn)行稱量，結(jié)果見圖5。用4%多聚甲醛固定胰腺組織，石蠟 切片，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究，分別用鼠源胰島素的抗體和兔源胰高血糖 素抗體對(duì)切片進(jìn)行染色，用激光共聚焦顯微鏡拍攝，結(jié)果見圖6，綠色為胰島素 分泌細(xì)胞(e細(xì)胞)，藍(lán)色為胰高血糖素分泌細(xì)胞(oc細(xì)胞)?？梢夾;r^+小 鼠的胰腺包括胰島的發(fā)育均無明顯異常。其中，鼠源胰島素的抗體購自Sigma 公司，兔源胰高血糖素抗體購自DAK0公司。
實(shí)施例三
小鼠葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)，取3月齡的Wt和戶ax(T^小鼠各7 - 8只，實(shí)驗(yàn)前一 天的17: OO禁食，但不禁水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天9: 00開始實(shí)驗(yàn)，稱量小鼠體重，并從 小鼠的尾尖取10nl血，用血糖儀測(cè)量小鼠的空腹血糖濃度。注射用的葡萄糖 (D - Glucose )溶液濃度為15%,按照1. 5克葡萄糖/千克小鼠體重的劑量腹腔 注射，分別在注射后15分鐘，30分鐘，60分鐘，90分鐘和120分鐘取尾尖血 測(cè)量血糖濃度，見圖7， 3月齡的/^^/+小鼠的葡萄糖耐受已經(jīng)開始出現(xiàn)明顯異 常。以上實(shí)驗(yàn)用血糖儀和試紙購自日本京都公司，葡萄糖購自Sigma公司。
實(shí)施例四
小鼠胰島素耐受實(shí)驗(yàn)取3月齡的Wt和，x^"各7-8只，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天9: 00開始禁食，13: 00開始實(shí)驗(yàn)，稱量小鼠體重，并割破小鼠尾巴尖，擠出10 Ul血，測(cè)量小鼠的空腹血糖濃度。按O. 751U胰島素/千克小鼠體重的劑量腹腔 注射，分別在注射后30分鐘，6G分鐘，90分鐘和12G分鐘取尾尖血測(cè)量血糖 濃度，見圖8, 3月齡的w^f j、鼠的胰島素耐受無明顯異常。其中，注射用 的胰島素購自諾華諾德。 實(shí)施例五
小鼠的葡萄糖促胰島素分泌實(shí)驗(yàn)取3月齡的Wt和，x^+各20只，實(shí)驗(yàn)前一天17: OO禁食，但不禁水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天9: ()0開始實(shí)驗(yàn)，將小鼠隨機(jī)分為4 組，每組兩種基因型各5只。對(duì)第一組進(jìn)行眼眶靜脈采血，每只采100jai全血。 稱量其余3組小鼠體重，注射用的葡萄糖溶液濃度為15%,按照1.5克葡萄糖/ 千克小鼠體重的劑量腹腔注射，分別在注射后2分鐘，30分鐘和60分鐘(每個(gè) 時(shí)間點(diǎn)Wt和各5只)從眼眶靜脈采血100 u 1。把全血置于4°C冰箱2 小時(shí)，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心，取血清。按照購自Mercodia公司的小鼠胰島素試劑 盒的操作說明，檢測(cè)血清中胰島素的含量，血清中胰島素含量見圖9。
由以上實(shí)施例可知3月齡的尸^n、鼠的糖耐受就開始出現(xiàn)明顯異常而胰 島素耐受無明顯異常，說明/^^',j、鼠中的胰島素作用的下游信號(hào)通路沒有發(fā) 生異常。/^xZ'小鼠不能分泌足夠量的胰島素以應(yīng)付血糖的升高，說明在A^(T"
小鼠中出現(xiàn)的糖代謝異常的表型主要原因是/^^"'/+小鼠不能分泌足夠量的胰島 素。而Ax^Vj、鼠的胰腺包括胰島的發(fā)育均無明顯異常，可見導(dǎo)致Z^nfA小鼠
的胰島素分泌不足的原因不是因?yàn)橐葝u的發(fā)育異常。
實(shí)施例六
小鼠體重和身體構(gòu)成取Wt和/^n、鼠各"只，從.2月齡開始，每兩 個(gè)月稱量一下小鼠的體重， 一直持續(xù)到8月齡。用購自GE公司的小鼠DEXA (dual-energy X-ray absorptiometry)儀測(cè)量8月齡的小鼠的身體重量，見 圖IO,測(cè)定小鼠的脂肪重量，見圖1L小鼠的攝食的測(cè)量將3個(gè)月大的小鼠 Wt和AA7fA型各8只，單獨(dú)置于沒有墊料的籠子里，先適應(yīng)環(huán)境一周，每天 15: 00稱取添加和剩余的小鼠飼料重量，得出的差量就是單只小鼠每天的攝食 量，結(jié)果見圖12。
實(shí)施例七
小鼠Proglucagon基因表達(dá)水平以及GLP-1濃度檢測(cè)取胚胎期18. 5天的小鼠，野生型，雜合子和純合子胚胎各一只，分離所有的消化道置于RMiso 中勻漿，提取RNA，結(jié)果見圖13。將每個(gè)基因型的3個(gè)月大的小鼠各4只斷頸 處死，取盲腸上面1.5-2cm的回腸，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗去食物殘?jiān)?置于RNA iso中勻漿，提取RNA，結(jié)果見圖14。將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA,然后將胚 胎的cDNA和成體回腸cDNA分別進(jìn)行PCR反應(yīng)和real - time PCR反應(yīng),結(jié)果見 圖15。 A^f力小鼠中的GLP-l水平受到了 Pax6基因突變的影響，因而，在還沒 有GLP - 1敲除小鼠的情況下，A^^小鼠是第一個(gè)因?yàn)镚LP - 1下調(diào)而產(chǎn)生糖尿 病的小鼠模型。其中，RNA iso購自TAKARA公司。
利用A;n^+小鼠對(duì)GLP-1受體激動(dòng)劑藥物的篩選進(jìn)行可行性驗(yàn)證，以 Exendin-4來治療A;n5^小鼠的代謝異常表型，實(shí)驗(yàn)如下在實(shí)驗(yàn)前30分鐘，對(duì) 小鼠腹腔注射exendin-4 (購自Anaspec公司)，劑量為0. 1 M g exendin-4/千 克小鼠體重，然后繼續(xù)進(jìn)行上述的小鼠葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖16以及葡萄 糖促胰島素分泌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖17， Az^+小鼠的糖耐受異常和胰島素分泌不 足的表型均得到了有效控制。在攝食實(shí)驗(yàn)中每天注射兩次Exendin-4，分別為9: 00和21: 00,劑量為0. 1 jag exendin-4/千克小鼠體重，測(cè)量小鼠的攝食量， 結(jié)果見圖18, Ax,型小鼠的曰攝食量得到了控制，與此同時(shí)，陰性對(duì)照PBS未 對(duì)Ax^、鼠起任何作用。因此，/^r^小鼠可以特異地被用來作為GLP-1受體 激動(dòng)劑的藥物篩選的動(dòng)物疾病模型。
除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡釆用等同替換或等效 變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.基于ENU誘變產(chǎn)生的Pax6基因突變小鼠在篩選胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑中的應(yīng)用。
2. 基于ENU誘變產(chǎn)生的Pax6基因突變小鼠的方法，包括如下步驟步驟一、誘變實(shí)驗(yàn)小鼠，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行腹腔注射誘變劑ENU，注射劑量為 75-150mg/kg,注射周期2-4周；將注射周期結(jié)束后60-80天的實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行繁 殖，剔除可育的雄性實(shí)驗(yàn)小鼠，得到的不育的雄性實(shí)驗(yàn)小鼠，即誘變充分的實(shí) 驗(yàn)小鼠；步驟二、篩選基因突變的實(shí)驗(yàn)小鼠，將誘變充分的實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行繁殖，對(duì) 產(chǎn)生的下一代實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行可見異常表型條選，得到可見異常表型的小鼠即為基因突變的代謝異常小鼠；步驟三、確定實(shí)驗(yàn)小鼠的突變基因和突變位點(diǎn)，對(duì)基因突變的代謝異常小鼠進(jìn)行繁殖，提取其后代小鼠的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，所得的PCR產(chǎn)物再進(jìn)行瓊 脂糖凝膠電泳分離，分析后確定實(shí)驗(yàn)小鼠的突變基因?yàn)镻ax6基因，突變位點(diǎn)為 Pax6基因編碼序列的第1367位核苷酸；步驟四、鑒定基因突變的實(shí)驗(yàn)小鼠，提取步驟三中基因突變的代謝異常小 鼠的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)的引物是-f: GATGATGGGAGTTGGGTG和 -r: AAGTTACCAGGTGTGGTGGG，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，所述PCR產(chǎn)物與酶反應(yīng) 體系體積比為l: 1,反應(yīng)溫度35-40°C,反應(yīng)時(shí)間1. 5-2. 5h后，最后進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳，得出小鼠的基因型。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于ENU誘變技術(shù)產(chǎn)生Pax6基因突變的方法，其特征 在于所述步驟一中，從注射ENU開始和注射周期結(jié)東后的一周內(nèi)向小鼠飲水中 添加濃度為150-250mg/L的SDM，此后添加濃度為50-150mg/L的SDM。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于ENU誘變技術(shù)產(chǎn)生Pax6基因突變的方法，其特征 在于所述步驟二中基因突變的代謝異常小鼠包括眼睛異常、糖耐受異常、胰 島素分泌異常、體重和脂肪含量減少以及攝食增加的小鼠。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于ENU誘變技術(shù)產(chǎn)生Pax6基因突變的方法，其特征 在于所述Pax6基因編碼序列的第1367位核苷酸由A到T產(chǎn)生點(diǎn)突變，其編 碼的蛋白pax6的266位氨基酸從精氨酸到終止子產(chǎn)生突變。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因突變小鼠的在藥物篩選中的應(yīng)用，具體涉及基于ENU誘變產(chǎn)生的Pax6基因突變小鼠在篩選胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明誘變實(shí)驗(yàn)小鼠，致使其精原細(xì)胞發(fā)生點(diǎn)突變，產(chǎn)生遺傳性的眼睛異常的小鼠，并將突變定位到小鼠二號(hào)染色體56cM附近，通過克隆、測(cè)序得出該品系(Pax6^m/+)小鼠在Pax6基因編碼序列的第1367位核甘酸發(fā)生了由A到T的點(diǎn)突變，從而導(dǎo)致其編碼的蛋白pax6在266位氨基酸從精氨酸到終止子的突變，其Pax6基因缺失了整個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，同時(shí)也引起直接受Pax6基因調(diào)控的GLP-1缺失。建立了一個(gè)新的GLP-1缺失的代謝異常的Pax6突變小鼠模型，可以利用該模型來篩選GLP-1受體激動(dòng)劑，為篩選治療糖尿病的藥物提供新途徑。
文檔編號(hào)C12N15/01GK101590244SQ20091014585
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2009年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月11日
發(fā)明者鈞 丁, 虎 曾, 阮海斌, 翔 高 申請(qǐng)人:南京大學(xué)