專利名稱：用于優(yōu)化組織和細(xì)胞富集的移植物的系統(tǒng)、方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文中公開的實(shí)施方式普遍地涉及包含包括脂肪組織的移植物、植入物或可移植的制品的，具有以及不具有脂肪來源的再生細(xì)胞群(例如，包括干細(xì)胞的脂肪來源的再生細(xì)胞濃縮群)的組合物、以及用于制備、優(yōu)化和給藥該組合物的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
脂肪組織轉(zhuǎn)移到身體的各個(gè)區(qū)域是相對(duì)普通的美容、治療和構(gòu)建過程 (structural procedure)，涉及從一個(gè)位置采集脂肪組織，以及將采集的和通常經(jīng)過加工的組織再植入另一個(gè)位置(參見Coleman 1995 ；和Coleman 2001)。脂肪組織的轉(zhuǎn)移最近已用于美容的和/或治療的隆胸和乳房重建(Bircoll和Novack 1987;以及Dixon 1988)， 以及隆臀(Cardenas-Camarena，Lacouture 等人 1999 ；de Pedroza 2000 ；以及Peren，Gomez 等人2000)，同時(shí)廣泛地用于修復(fù)小的美容缺陷，如面部皺褶、皺紋、痘痕和痘疤(pock marks and divots)0在過去，脂肪組織移植物和脂肪組織轉(zhuǎn)移方法一直受到包括壞死、由身體的移植吸收、感染(Castello，Barros 等人 1999 ；Valdatta，Thione 等人 2001)、鈣化及痕痕(Huch， Kunzi ^A 1998) >^ffiWW^liItliiA (inconsistent engraftment) (Eremia and Newman 2000)、耐久性的缺乏，以及由缺乏新生血管形成和移植物組織的壞死而產(chǎn)生的其他問題的困難和副作用的困擾。在脂肪組織轉(zhuǎn)移中最大的挑戰(zhàn)之一是由身體的移植吸收和轉(zhuǎn)移之后的脂肪組織移植物的體積保留。當(dāng)采集或清洗脂肪組織時(shí)，被采集的脂肪組織的各個(gè)部分之間的空間由液體(例如水、血液、腫脹液、油(oil))充滿。當(dāng)該組織/液體混合物植入到受體中，液體部分被身體迅速吸收導(dǎo)致體積損失。將大量的液體從組織/液體混合物中去除的過程通常稱為“干燥脂肪組織”或“使脂肪組織脫水”。由于炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)或加重， 脂肪組織移植物中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞等的含量也可以顯著影響移植物移植后保留的移植物體積。組織保留的另一個(gè)方面涉及脂肪組織移植物內(nèi)的脂質(zhì)(lipid)的量。據(jù)了解，月旨肪組織移植物內(nèi)的游離脂質(zhì)的存在(意味著從死亡或受損的脂肪細(xì)胞釋放的脂質(zhì)；也稱為油)可以導(dǎo)致帶有實(shí)質(zhì)上吞噬活性的炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)或加重以及移植物體積的必然損失。還已知與脂肪來源的再生細(xì)胞濃縮群混合的未加工的脂肪組織克服了許多與上述脂肪組織移植物和脂肪組織轉(zhuǎn)移相關(guān)的問題。具體地，以包含脂肪來源干細(xì)胞的脂肪來源細(xì)胞濃縮群補(bǔ)充的未加工的脂肪組織增加了脂肪移植物的重量、血管生成和保持力。 (參見第7390484號(hào)美國專利以及未決的公布號(hào)2005/0025755的美國專利申請(qǐng)，其全部以引用的方式明確地并入本文中)。在動(dòng)物模型中，以包含脂肪來源的干細(xì)胞的細(xì)胞濃縮群補(bǔ)充或與包含脂肪來源的干細(xì)胞的細(xì)胞濃縮群混合的脂肪組織碎片(fragment)與脂肪組織未補(bǔ)充的移植物單獨(dú)相比，在移植物中表現(xiàn)出改善的新血管形成(neoangiogeneis)和灌流。此外，以包括脂肪來源干細(xì)胞的脂肪來源再生細(xì)胞補(bǔ)充的脂肪組織移植物，當(dāng)與未補(bǔ)充的移植物相比時(shí)，表現(xiàn)出隨著時(shí)間的推移的增加的移植物保持力和重量(參見公開號(hào) 2005/0025755的美國專利申請(qǐng))。此外，在封閉的、無菌液體通道中的脂肪組織的加工，大大降低了感染的機(jī)會(huì)。在上述動(dòng)物模型中觀察到的脂肪組織的自體同源轉(zhuǎn)移的改進(jìn)也已經(jīng)在人體臨床研究復(fù)制。盡管如此，包括脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)的脂肪來源再生細(xì)胞的濃縮群的分離和純化，通常涉及到一系列的清洗、消化、過濾和/或離心步驟，它可以減少有生活力的細(xì)胞的產(chǎn)量，需要機(jī)械設(shè)備和專業(yè)臨床醫(yī)生，和/ 或可以對(duì)移植物的質(zhì)量、外觀、壽命、水合或功效妥協(xié)。對(duì)制備和優(yōu)化脂肪組織移植物和植入物，并分離和/或濃縮脂肪來源再生細(xì)胞的額外的方法的需要是顯然的。

發(fā)明內(nèi)容
本文所述的實(shí)施方式涉及加工脂肪組織移植物的裝置，以及制備脂肪組織移植物和以脂肪來源的再生細(xì)胞補(bǔ)充的脂肪組織移植物的方法。本文提供的幾個(gè)實(shí)施方式涉及用于制備脂肪組織移植物的組織的裝置。在一些實(shí)施方式中，該裝置可以包括具有柔性可折疊袋，該袋具有第一室和第二室，所述第一室和第二室由具有小孔的過濾器來限定。該裝置還可以包括位于第二室內(nèi)的分離器，以及連接到柔性可折疊袋的出口和一個(gè)或多個(gè)進(jìn)口。所述進(jìn)口可以配置為允許脂肪組織無菌引入第一室；以及所述出口可配置為從所述第二室中無菌去除液體和細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述分離器可以是在第二室中自由浮動(dòng)的多孔結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方式中，所述分離器可以是在第二室中限定第三室的多孔結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方式中，所述分離器可以包括脂質(zhì)芯吸材料(lipid-wicking material)，如聚酯網(wǎng)篩等。在一些實(shí)施方式中所述分離器可以是一種系統(tǒng)的多孔結(jié)構(gòu)，其具有大于過濾器小孔的小孔。例如，在一些實(shí)施方式中，所述分離器的小孔具有以下孔徑大小，其可以大于或等于過濾器小孔的 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39或40倍。在一些實(shí)施方式中，所述分離器的孔徑大小可以為約 300-2000 μ m。在一些實(shí)施方式中，所述過濾器的孔徑大小可以大于或等于約30 μ m,例如， 在約30 μ m至約200 μ m之間。在一些實(shí)施方式中，所述過濾器的孔徑大小為35 μ m。在一些實(shí)施方式中，所述進(jìn)口可以配置為與適配器可拆連接。在一些實(shí)施方式中， 所述適配器可以配置為與注射筒的尖端可拆連接，例如60或250ml的注射器、托米注射器 (Toomey syringe)等。在一些實(shí)施方式中，所述進(jìn)口可以配置為允許物質(zhì)進(jìn)入該端口，但不允許物質(zhì)從該端口排出。例如，在一些實(shí)施方式中，所述進(jìn)口包括或配置為與可變形的塑料閥和/或組織入口組件(tissue access port assembly)連接。在一些實(shí)施方式中，所述進(jìn)口可以配置為連接到插管(cannula)，而保持無菌液體/組織通道。在一些實(shí)施方式中，該裝置可以包括第二裝置，其中所述第二裝置是脂肪來源再生細(xì)胞分離裝置。在一些實(shí)施方式中，所述脂肪來源的再生細(xì)胞分離裝置可以連接到用于制備脂肪組織移植物的組織的第一裝置上，而保持封閉的通道。在一些實(shí)施方式中，脂肪來源再生細(xì)胞的分離裝置可以是本文上述的裝置。在一些實(shí)施方式中，所述第二裝置可以通過管道(conduit)連接到用于制備脂肪組織移植物的組織的裝置上，所述管道可以配置為將分離的脂肪來源再生細(xì)胞從第二裝置轉(zhuǎn)移到用于制備脂肪組織移植物的組織的裝置的第一室。在一些實(shí)施方式中，所述管道可以包括Y形連接。本文提供的一些實(shí)施方式涉及制造脂肪組織移植物的方法。該方法可以包括獲得未加工的脂肪組織的第一部分；用生理溶液沖洗未加工的脂肪組織的第一部分；以及將沖洗后的脂肪組織脫水到小于脫水前未加工的脂肪組織的第一部分中存在的水合量的步驟。 例如，在一些實(shí)施方式中，將沖洗后的脂肪組織脫水到液體含量小于約1/2、1/3、或1/4倍 (優(yōu)選約1/3倍)的脫水前所述未加工脂肪組織的第一部分的液體含量。在一些實(shí)施方式中，所述生理溶液可以是乳酸林格氏液、林格氏乙酸鹽、生理鹽水、磷酸鹽緩沖的生理鹽水、勃脈* (PLASMALYTE )溶液、晶體溶液和注射液體(IV fluid)、膠體溶液和注射液體、5%葡萄糖水(D5W)、哈特曼氏(hartmarm' s)溶液等。在一些實(shí)施方式中，該方法可以另外包括從脂肪組織的第二部分分離脂肪來源再生細(xì)胞群，以及使脫水的脂肪組織與所述分離的脂肪來源再生細(xì)胞群在允許所述分離的脂肪來源再生細(xì)胞群滲透入所述脫水的脂肪組織中的條件下相接觸的步驟。在一些實(shí)施方式中，所述分離的脂肪來源再生細(xì)胞群在接觸脫水的脂肪組織前沒有經(jīng)過離心。在一些實(shí)施方式中，所述分離的脂肪來源再生細(xì)胞群可以在本文上述所公開的裝置中，例如，以在釋放所述細(xì)胞的條件下從結(jié)締組織基質(zhì)釋放細(xì)胞和包括膠原蛋白酶的酶溶液的方式，通過與所述裝置的第一室中存在的脂肪組織接觸而制備。在一些實(shí)施方式中，此類釋放所述細(xì)胞的條件包括熱、冷卻、機(jī)械消化、超聲波或激光輔助釋放或現(xiàn)有技術(shù)中已知的以及第7390484 號(hào)美國專利所述的其他方法，第7390484號(hào)美國專利全部明確地并入本文中。在一些實(shí)施方式中，所述接觸步驟可以在連接到所述第一裝置上的第二裝置(例如，與第一裝置具有相同結(jié)構(gòu)的裝置)中進(jìn)行。一些實(shí)施方式涉及脂肪組織移植物的生產(chǎn)方法，該方法包括獲得未加工的脂肪組織的第一部分；將未加工的脂肪組織中的第一部分引入上述裝置的第一室中；將生理清洗液加入到帶有未加工的脂肪組織的第一室中以沖洗未加工的脂肪組織；以及從所述裝置的第二室去除液體(例如，水、生理清洗液、血液、游離脂質(zhì)等，或它們的任何組合)，從而干燥脂肪組織和減少游離脂質(zhì)含量的步驟。在一些實(shí)施方式中，該方法可以另外包括從脂肪組織的第二部分分離脂肪來源再生細(xì)胞群，以及使脫水的脂肪組織與所述分離的脂肪來源再生細(xì)胞群在允許所述分離的脂肪來源再生細(xì)胞群滲透入所述脫水的脂肪組織中的條件下相接觸的步驟。在一些實(shí)施方式中，所述分離的脂肪來源再生細(xì)胞群在接觸脫水的脂肪組織前沒有經(jīng)過離心。在一些實(shí)施方式中，所述分離的脂肪來源再生細(xì)胞群可以在本文上述所公開的裝置中，例如，以在釋放所述細(xì)胞的條件下從結(jié)締組織基質(zhì)釋放細(xì)胞和包括膠原蛋白酶的酶溶液的方式，通過與所述裝置的第一室中存在的脂肪組織接觸而制備。在一些實(shí)施方式中，此類釋放所述細(xì)胞的條件包括熱、冷卻、機(jī)械消化、超聲波或激光輔助釋放或現(xiàn)有技術(shù)中已知的以及第7390484 號(hào)美國專利所述的其他方法，第7390484號(hào)美國專利全部明確地并入本文中。在一些實(shí)施方式中，所述接觸步驟可以在連接到所述第一裝置上的第二裝置(例如，與第一裝置具有相同結(jié)構(gòu)的裝置)中進(jìn)行。


圖1顯示說明本文公開的示例性的移植物的補(bǔ)充方法的圖。圖2顯示柔性收集容器的框圖。圖3圖示用于優(yōu)化脂肪組織移植物的示例性系統(tǒng)。所述移植物可以用脂肪來源再生細(xì)胞補(bǔ)充。圖4圖示系統(tǒng)300中的端口和適配器。圖5顯示系統(tǒng)300的外膜310。圖6圖示系統(tǒng)300的過濾器320。圖7圖示系統(tǒng)300的分離篩(screen) 330。圖8圖示系統(tǒng)300的示例性封口 311。圖9為帶有端口和適配器600的系統(tǒng)300的透視圖。圖10為與系統(tǒng)300的端口一起使用的組織端口組件600的剖視圖。圖11為與系統(tǒng)300的端口一起使用的組織端口組件600的剖視圖。圖12為與組織端口組件600 —起使用的帽610的剖視圖。圖13為用于優(yōu)化脂肪組織移植物的示例性系統(tǒng)800的圖解。圖14A及圖14B是示例性的組織富集裝置的透視圖。圖14A顯示帶有第一室和第二室的用于移植的罐，所述第一室用于加工脂肪組織，所述第二室用于以脂消化物 (Iipodigestate)補(bǔ)充脂肪組織。圖14B圖示用于圖14A所示的罐的示例性殼體/平臺(tái) (housing/platform)。圖15為顯示未加工的脂肪組織(對(duì)照)、由重力制備方法(重力)制備的脂肪組織、由離心法(離心)制備的脂肪組織，以及根據(jù)本文所述的方法和系統(tǒng)(純移植物 (PureGraft))制備的干燥的脂肪組織的百分比含量水(V/V)的條形圖。圖16為顯示未加工的脂肪組織(對(duì)照)、由重力制備方法(重力)制備的脂肪組織、由離心法(離心)制備的脂肪組織，以及根據(jù)本文所述的方法和系統(tǒng)(純移植物 (PureGraft))制備的干燥的脂肪組織的百分比脂質(zhì)含量(V/V)條形圖。圖17為顯示將每克組織的紅細(xì)胞(RBC)的含量標(biāo)準(zhǔn)化為根據(jù)本文所述的方法和系統(tǒng)(純移植物(PureGraft))制備的移植物中每克組織存在的紅細(xì)胞含量的條形圖。顯示了未加工的脂肪組織(對(duì)照)、由重力制備方法(重力)制備的脂肪組織和由離心法(離心)制備的脂肪組織以及根據(jù)本文所述的方法和系統(tǒng)(純移植物(PureGraft))制備的脂肪組織的數(shù)據(jù)。
具體實(shí)施例方式本文公開的實(shí)施方式涉及單獨(dú)或以脂肪來源的再生細(xì)胞(例如，包括脂肪來源干細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞群)補(bǔ)充、增強(qiáng)或加強(qiáng)的脂肪組織移植物(例如，“脂肪移植物”)或脂肪組織植入物的生產(chǎn)方法和系統(tǒng)。本文公開的實(shí)施方式是部分基于可以用于快速制備及優(yōu)化脂肪組織移植物和植入物，以及用于通過例如重力流，以及如需要，在離心、高壓、真空過濾存在下制備脂肪來源再生細(xì)胞(例如，包括脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞群)群富集的移植物和植入物的裝置和系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)。本文如下所述，用本文公開的裝置制備的脂肪組織移植物，與采用傳統(tǒng)技術(shù)制備的移植物相比，具有降低的液體、血細(xì)胞和游離脂質(zhì)或油
7含量的水平。特別地，使用本文所公開的裝置制備的脂肪組織移植物不需要經(jīng)受可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生活力下降和降低脂肪組織移植物保持力的強(qiáng)烈的機(jī)械力。使用本文所公開的裝置可以得到更加可預(yù)測(cè)的以及穩(wěn)定的脂肪組織植入物。本文所公開的實(shí)施方式也部分基于申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)完整的脂肪片段或“未加工的脂肪組織基質(zhì)”可用于過濾、結(jié)合以及從而有效地原位濃縮經(jīng)過部分或全部消化的分解的脂肪組織的溶液或懸浮液提供的脂肪來源再生細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，“干燥的脂肪組織”或“脫水的脂肪組織”，可用于過濾、結(jié)合以及從而有效地原位濃縮以脂肪消化物 (lipo-digestate)的形式提供的脂肪來源再生細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，在加入脂肪消化物(lipo-digestate)后，“未加工的脂肪組織基質(zhì)”可以干燥或脫水。因此，在一些實(shí)施方式中，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在脂肪組織移植物或脂肪移植物增大，補(bǔ)充或加強(qiáng)之前，分解的脂肪組織中的細(xì)胞成分的濃縮不再需要。下面詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，其實(shí)例在附圖中說明。只要是可能的，在附圖以及關(guān)于附圖的說明或類似部分中使用相同或相似的參考編號(hào)。應(yīng)當(dāng)注意，附圖是簡化形式，而不是精確規(guī)模.在本文的公開內(nèi)容中，僅為了方便和清楚起見，關(guān)于附圖使用方向術(shù)語例如頂部、底部、左面、右面、向上、向下、在上面、在上方、在下面、在下方、后面和前面這樣的方向術(shù)語不應(yīng)當(dāng)理解為是以任何方式對(duì)本發(fā)明的限制。雖然本文的公開提供了一些舉例說明的實(shí)施方式，但是應(yīng)當(dāng)理解，提供這些實(shí)施方式只是為了舉例說明，而不是限制性的。雖然討論了示例性實(shí)施方式，但是應(yīng)當(dāng)理解，以下詳細(xì)描述的目的是包括在如通過權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)的所有變型、 替代方式和等同實(shí)施方式?？梢越Y(jié)合本領(lǐng)域常用的各種細(xì)胞或組織分離技術(shù)來實(shí)施本發(fā)明，將所有這樣的常用加工步驟包括在本文中只是因?yàn)檫@是理解本發(fā)明所必需的。干燥或脫水的脂肪組織本發(fā)明提供的一些實(shí)施方式涉及可以直接用在同源自體移植程序，例如同源自體移植或在移植前可以用細(xì)胞(如脂肪來源再生細(xì)胞，脂肪來源干細(xì)胞等)、添加劑等加強(qiáng)的干燥或脫水的脂肪組織移植物的生產(chǎn)方法。在某些情況下，術(shù)語“脂肪組織”可能指包括儲(chǔ)存脂肪的結(jié)締組織的脂肪。脂肪組織中含有若干再生細(xì)胞類型，其包括由結(jié)締組織基質(zhì)包裹的脂肪來源干細(xì)胞(“ADSCs”)、內(nèi)皮祖細(xì)胞和前體細(xì)胞、周皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、包括淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的淋巴細(xì)胞等， 在一些實(shí)施方式中，是從受試者中去除單位脂肪組織(unit)以產(chǎn)生脂肪組織移植物。“單位脂肪組織(unit of adipose tissue) ”是指脂肪組織的不連續(xù)的可測(cè)量的量，其可以通過確定單位的體積和/或重量的來測(cè)量。單位脂肪組織可指從受試者中去除的脂肪組織的全部量，或小于從受試者中去除的脂肪組織的全部量的量。因此，單位脂肪組織可與其他單位脂肪組織連接，形成具有各個(gè)單位的總和的重量或體積的單位脂肪組織。在一些實(shí)施方式中，將一個(gè)或多個(gè)單位脂肪組織從受試者中去除。本文所述的實(shí)施方式中使用的脂肪組織，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法獲得。例如，可以通過抽吸輔助脂肪整復(fù)、超聲輔助脂肪整復(fù)、脂肪切除術(shù)、激光脂肪整復(fù)、水射流脂肪整復(fù)等將脂肪組織從受試者中去除。此外，該程序可以包括此類程序的結(jié)合如脂肪切除術(shù)和抽吸輔助脂肪整復(fù)結(jié)合。優(yōu)選地，脂肪組織以保留組織的生活力和細(xì)胞成分以及使收集的材料的潛在的傳染性微生物如細(xì)菌和/或病毒的污染的可能性最小化的方式收集。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，組織提取是以消毒或無菌的方式進(jìn)行，以使污染最小化，例如，在封閉的無菌液體/組織通道中。在一些實(shí)施方式中，抽吸輔助脂肪整復(fù)用來從受試者中去除脂肪組織，從而提供可以與其他技術(shù)例如超聲輔助脂肪整復(fù)聯(lián)合，減少細(xì)胞或組織損傷可能性的收集組織的微創(chuàng)方法。對(duì)于抽吸輔助脂肪整復(fù)程序，通過將插管插入受試者中存在的脂肪組織儲(chǔ)藏處內(nèi)或其附近，接著將脂肪吸出到抽吸裝置中來收集脂肪組織。在一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)小插管可以與注射器連接，使用手動(dòng)力量可以吸出脂肪組織。使用注射器或其他類似的裝置可用于收獲相對(duì)中等量的脂肪組織(例如，從0. Iml到數(shù)百毫升的脂肪組織)。采用這些相對(duì)小的裝置的程序具有可以以僅局部麻醉而不是全身麻醉進(jìn)行該程序的優(yōu)勢(shì)。超出該范圍的更大體積的脂肪組織(例如，大于數(shù)百毫升)可能需要由供體或進(jìn)行收集程序的人自行決定的全身麻醉。當(dāng)期望去除更大體積的脂肪組織時(shí)，在該程序中可以采用相對(duì)較大的插管和自動(dòng)抽吸裝置。脂肪切除術(shù)程序包括并不僅限于，在被切除的組織的直接或間接的可視化下，通過去切除例如外科解剖去除包含組織(如皮膚)的脂肪組織的程序。在一些實(shí)施方式中， 這可能會(huì)作為程序的附帶部分發(fā)生，也就是說，其中，手術(shù)的主要目的是去除組織(在肥胖治療或整容手術(shù)中，如皮膚)，其中脂肪組織隨著主要關(guān)心的組織得以去除。為在本文公開的方法中使用而收集的脂肪組織的量取決于許多變量，包括但不限于，供體的體重指數(shù)，易接近的脂肪組織收獲點(diǎn)的可用性，伴隨和已有的藥物治療和情況 (如抗凝治療)，以及該組織將被收集的目的。已經(jīng)證明脂肪組織移植體的植入是具有閾值效應(yīng)的細(xì)胞劑量依賴性。因此，可能“越多越好”的一般原則將在由其他變量設(shè)置的限制范圍內(nèi)適用，并在可行的情況下，收獲將收集盡可能多的組織。在一些實(shí)施方式中，例如在干燥或脫水的脂肪組織用來制造強(qiáng)化或補(bǔ)充的脂肪組織移植物的實(shí)施方式中，單位脂肪組織分割成部分。脂肪組織的第一部分未經(jīng)消化，也根本未經(jīng)加工或沖洗、清洗，以獲得本文如下所述的干燥或脫水的脂肪組織。未加工的干燥或脫水的脂肪組織的第一部分可以作為以脂肪消化物脂肪消化物或來自第二部分的脂肪來源細(xì)胞濃縮群中存在的脂肪來源再生細(xì)胞(例如，包括脂肪來源干細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞和/ 或祖細(xì)胞的細(xì)胞群)補(bǔ)充的移植物的基礎(chǔ)。如下所述，一部分可以經(jīng)加工以將脂肪來源再生細(xì)胞例如，包括脂肪來源干細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞群從結(jié)締組織基質(zhì)中釋放或釋出，以獲得脂肪消化物或包括再生細(xì)胞或干細(xì)胞的脂肪來源細(xì)胞濃縮群。在一些實(shí)施方式中，兩個(gè)不同的單位脂肪組織，例如，從受試者的相同或不同區(qū)域，或從不同受試者中收集。如下所述，一個(gè)單位可以經(jīng)加工獲得脂肪消化物或包含再生細(xì)胞或干細(xì)胞的脂肪來源細(xì)胞濃縮群，其他單位可以作為以脂肪來源再生細(xì)胞(例如，脂肪消化物和/或包括脂肪來源干細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞群)補(bǔ)充的脂肪移植物的基礎(chǔ)。在一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或兩個(gè)單位脂肪組織可以在本發(fā)明的裝置和系統(tǒng)中低溫保存，使得遞送移植物到受試者與組織的收獲在時(shí)間上可以分開。在一個(gè)此類實(shí)施方式中，一個(gè)或兩個(gè)脂肪組織單位可以在本發(fā)明的裝置和系統(tǒng)中低溫保存，其中裝置的室是由在如下所述的低溫保存、低溫儲(chǔ)存、解凍以及隨后的使用過程中保持機(jī)械和結(jié)構(gòu)的完整性的材料制造的。 在另一個(gè)此類實(shí)施方式中，在用在本文所述的移植物或植入物的強(qiáng)化之前，脂肪消化物或包含包括脂肪來源干細(xì)胞的再生細(xì)胞的脂肪來源細(xì)胞濃縮群可以低溫保存。
如參照“干燥的脂肪組織”使用的術(shù)語“干燥”，是指與來自同一受試者和同一位置的未加工的脂肪組織相比在干燥的脂肪組織中存在的具有較低的液體含量的脂肪組織單位(例如，取自與干燥的脂肪組織相同的受試者和相同的位點(diǎn)的單位脂肪組織的(W/W))， 例如，水或其他液體(例如，腫脹液)。如參照“脫水的脂肪組織，，使用的術(shù)語“脫水，，與來自同一受試者和同一位置的未加工的脂肪組織相比在脫水的脂肪組織中存在的具有較低的液體含量的單位脂肪組織(例如，取自與脫水的脂肪組織相同的受試者和相同的位點(diǎn)的單位脂肪組織的(W/W))，例如，水或其他液體(例如，腫脹液)。本文使用的“等效單位”，可以指來自一個(gè)受試者的等體積或重量的脂肪組織。例如，等效單位可以指來自一個(gè)受試者的等體積(或重量)的脂肪組織。在一些實(shí)施方式中， 等效單位可以意味著從相同或不同的受試者，從同一個(gè)位置(例如，臀部、腹部、大腿、背部等)獲得的等體積(或重量)?！拔醇庸さ闹窘M織”，是指尚未部分或完全分解的脂肪組織，即未受到機(jī)械和/或酶分解的脂肪組織。因此，未加工的組織包含了完整的包括結(jié)合脂肪來源再生細(xì)胞的結(jié)締組織的組織片段。本文所用“脂肪來源再生細(xì)胞”，是指從脂肪組織中獲得的任何引起或促進(jìn)完全或局部的再生、修復(fù)或器官、組織或生理單位或系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)或功能的替代，從而提供治療、組織或美容益處的細(xì)胞。再生細(xì)胞的例子包括脂肪來源干細(xì)胞(“ADSCs”)、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、分化或去分化的脂肪細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、單能和多能祖細(xì)胞和前體細(xì)胞(及其子代)和淋巴細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，干燥或脫水的脂肪組織具有未加工的脂肪組織的等效單位的約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、35%、 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或 95% (或在此范圍之間任何％)液體含量(按體積和/或重量計(jì)算)。例如，干燥脂肪組織可以小于未加工的等效單位的脂肪組織的液體含量大于或等于約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、 10倍(或此范圍之間的任何數(shù)字)液體含量。同樣，參照“脫水的脂肪組織”，所用的術(shù)語 “脫水”是指在“脫水的脂肪組織”中存在的與未加工的脂肪組織或未加工的等效單位的脂肪組織相比較低的水含量。在一些實(shí)施方式中，脫水脂肪組織可以具有大于或等于約1%、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,12%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%, 50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%或95% (或在這個(gè)范圍之間的任何％ )的未加工的等效單位的脂肪組織或通過離心或其他常規(guī)方法制備的等效單位的脂肪組織的含量水。例如，干脂肪組織可以具有小于未加工的等效單位的脂肪組織的大于或等于約1. 5倍、2倍、3 倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍(或此范圍之間的任何數(shù)字)的含水量。在一些實(shí)施方式中，本文所述的“干燥”或“脫水”的脂肪組織可以含有與未加工的等效單位的脂肪組織相比較低的脂質(zhì)和/或紅細(xì)胞或白細(xì)胞的含量或百分比。在一些實(shí)施方式中，干燥或脫水的脂肪組織可以具有小于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、 10% ,12% ,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,80%, 90%、95%或99% (或此范圍之間的任何％)(或在這個(gè)范圍之間的任何數(shù)值)的在未加工的等效單位的脂肪組織和/或使用離心法，例如切除的組織在固定角度的離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)的方法或其他傳統(tǒng)的制備技術(shù)加工的等效單位的脂肪組織中的白細(xì)胞。例如，在一些實(shí)施方
10式中，干燥或脫水的脂肪組織可以包含小于約75 %、小于80 %、小于85 %、小于90 %、小于 95%、或更小或在這個(gè)范圍之間的任何％的在等效單位的脂肪組織中的白細(xì)胞數(shù)。在一些實(shí)施方式中，本文提供干燥或脫水的脂肪組織可以具有小于約1%、2%、 3 %,10 %,12 %,15 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%或95% (或在這個(gè)范圍之間的任何％ )(或在這個(gè)范圍之間的任何數(shù)值)的未加工的脂肪組織或使用離心法例如切除的組織在固定角度的離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)的方法或其他常規(guī)制備方法制備的等效單位的脂肪組織中的紅細(xì)胞。例如，在一些實(shí)施方式中，本文公開的系統(tǒng)所生產(chǎn)的脂肪組織移植物包含小于約75%、小于 80%、小于85%、小于90%、小于95%、甚至更小或在這個(gè)范圍之間的任何％的在等效單位的脂肪組織中的紅細(xì)胞數(shù)。在一些實(shí)施方式中，本文所公開的干燥或脫水的脂肪組織移植物具有小于約1 %、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,12% ,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%, 50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%或95% (或在這個(gè)范圍之間的任何％ )(或在這個(gè)范圍之間的任何數(shù)字)的未加工的脂肪組織或由常規(guī)的離心方法例如切除的組織在固定角度的離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)的方法制備的等效單位的脂肪組織中的脂質(zhì)。例如，在一些實(shí)施方式中，本文所公開的干燥或脫水的脂肪組織移植物包含小于約75%、小于80%、小于85%、小于90%、小于95%、甚至更小或在此之間的任何％的在未加工的等效單位的脂肪組織中存在的游離脂肪含量的百分比。在一些實(shí)施方式中，干燥的或脫水的脂肪組織由在如下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的包括過濾器和分離器的裝置中提供未加工的脂肪組織而獲得。該過濾器可以將裝置劃分為兩個(gè)內(nèi)部室，從而限定第一室和第二室或子系統(tǒng)。將脂肪組織引入到裝置的第一室或子系統(tǒng)，優(yōu)選地不進(jìn)入裝置的第二室。該過濾器具有多個(gè)允許自由流動(dòng)的液體，如，水、腫脹液、清洗液 (如乳酸林格氏液、生理鹽水、PLASMALTYE )、游離脂質(zhì)、油、血細(xì)胞、從脂肪組織裂解的細(xì)胞以及血液成分進(jìn)入第二室，但孔徑是使得保留非分解的脂肪組織和組織片段的小孔。 第二室可以包括在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的由脂質(zhì)吸走和/或液體吸走(例如，從第一室中吸引液體的網(wǎng)絡(luò)狀設(shè)計(jì))材料制成的分離器。在優(yōu)選實(shí)施方式中，分離器是由多孔性材料制成，其中分離器的小孔大于過濾器的小孔。第一室內(nèi)未加工的脂肪組織用生理清洗液沖洗或清洗。在優(yōu)選實(shí)施方式中，生理清洗液無菌引入該裝置。在一些實(shí)施方式中，清洗液引入第一室。在一些實(shí)施方式中，清洗液引入第二室，并通過過濾器進(jìn)入第二室，從而與其中的脂肪組織接觸。在一些實(shí)施方式中，清洗液引入到第一室和第二室。在一些實(shí)施方式中，為了便于從第一室的脂肪組織中清洗和分離游離脂質(zhì)、紅細(xì)胞、白細(xì)胞和腫脹液，攪動(dòng)(例如，顛倒、擠壓或輕輕搖動(dòng)裝置)脂肪組織和清洗液。在其他實(shí)施方式中，第一室的脂肪組織與在未攪動(dòng)的情況下允許從裝置的第一室排出或流出的清洗液接觸，例如通過重力或芯吸力(wicking force)。在一些實(shí)施方式中，用來沖洗脂肪組織的清洗液的體積可以大于脂肪組織的體積。僅通過舉例的方式，在一些實(shí)施方式中，大于或等于約Iml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、 8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、 400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、650ml、700ml、750ml、800ml、850ml、900ml、950ml、1000ml、1100ml、1500ml、2000ml或在這些體積之間的任何量的可以用于沖洗未加工的脂肪
組織的清洗液。在清洗或沖洗步驟中，液體，例如清洗液、游離脂質(zhì)、油、血細(xì)胞、來自脂肪組織的裂解細(xì)胞和血液成分通過裝置的第一室和第二室之間的過濾器的小孔。因此，第二室變成充滿液體。在第二室的分離器可以起到吸入和保留從第一室進(jìn)入第二室的液體的作用，例如，起到毛細(xì)管的作用。水、腫脹液、血液和來自第一室的貯藏在脂肪組織中的游離脂質(zhì)的運(yùn)動(dòng)使干燥的脂肪組織燥和脫水。液體通過端口從第二室中去除。在一些實(shí)施方法中，利用泵和真空將液體從第二室中去除。在一些實(shí)施方式中，允許液體從端口排出脫離第二室。參照?qǐng)D2-圖13在下面進(jìn)一步詳細(xì)討論制造干燥或脫水的脂肪組織以及補(bǔ)充或強(qiáng)化的脂肪組織移植物的示例性裝置。在一些實(shí)施方式中，添加清洗液和從第二室去除內(nèi)容物的步驟被重復(fù)1次、2次、3 次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或以上?？梢詫⒏稍锘蛎撍闹窘M織從第一室去除(優(yōu)選無菌)，并且直接給予受試者。 在一些實(shí)施方式中，在給予受試者之前，干燥或脫水的脂肪組織經(jīng)過進(jìn)一步加工(例如，通過在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的添加劑的添加)。補(bǔ)充后的脂肪組織移植物本文所述是生產(chǎn)補(bǔ)充、增強(qiáng)或強(qiáng)化的脂肪組織移植物的方法和系統(tǒng)，例如，其中移植物是未加工的脂肪組織或干燥或脫水的脂肪組織。例如，在本文所述的某些方法中，以額外的脂肪來源再生細(xì)胞或脂肪來源干細(xì)胞，例如，脂肪消化物或包含再生細(xì)胞或干細(xì)胞的脂肪來源細(xì)胞濃縮群補(bǔ)充強(qiáng)化或補(bǔ)充的脂肪組織移植物。優(yōu)選地，額外的脂肪來源再生細(xì)胞或脂肪來源干細(xì)胞從同一受試者中獲得。在一些實(shí)施方式中，額外的脂肪來源再生細(xì)胞或脂肪來源干細(xì)胞可以從不同受試者中獲得。通過本文所述的一些方法，例如，消化后的脂肪組織提取細(xì)胞(lipoaspirate) (“脂肪消化物”)直接應(yīng)用到未加工的脂肪組織、干燥的脂肪組織、脫水的脂肪組織或未加工的脂肪組織基質(zhì)上，未加工的脂肪組織、干燥的脂肪組織、脫水的脂肪組織或未加工的脂肪組織基質(zhì)用作過濾器或篩子保留脂肪消化物中存在的成分(例如，脂肪來源再生細(xì)胞， 如包括脂肪來源干細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞群)。通過這種加工，在未經(jīng)過額外的可能是繁瑣的，費(fèi)時(shí)費(fèi)力的，并且可能對(duì)細(xì)胞生活力有影響的純化或分離步驟的情況下，可以快速制備已經(jīng)以脂肪來源再生細(xì)胞(例如，包含脂肪來源干細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞群)濃縮、補(bǔ)充或強(qiáng)化的脂肪組織移植物、植入物或脂肪移植物。通過本文所述的方法中的一些方法，例如，通過包含再生細(xì)胞或干細(xì)胞的脂肪來源細(xì)胞濃縮群直接應(yīng)用到未加工的脂肪組織、干燥的脂肪組織、脫水的脂肪組織或未加工的脂肪組織基質(zhì)和未加工的脂肪組織、干燥的脂肪組織、脫水的脂肪組織。與分離、純化和濃縮脂肪來源再生細(xì)胞的現(xiàn)有的方法相比，本文公開的一些方法使用未加工的脂肪組織、干燥的脂肪組織或脫水的脂肪組織的完整的基質(zhì)，輕輕地過濾以及在原位，即在基質(zhì)本身，濃縮脂肪來源再生細(xì)胞，這樣做避免由離心法、膜、凝膠或梯度過濾以及脂肪消化物的其他機(jī)械操作帶來的細(xì)胞損傷。此外，本文所述的方法促進(jìn)遍及脂肪組織移植物的外源性脂肪來源再生細(xì)胞(例如，包括脂肪來源干細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞和/ 或祖細(xì)胞的細(xì)胞群)的平均或?qū)嵸|(zhì)上完全的分布。
本文中所使用的“再生細(xì)胞組合物”或“脂肪消化物(lipo-digestate) ”是指組織例如脂肪組織經(jīng)過清洗并且至少經(jīng)過部分分解之后在大量的液體中代表性地存在的細(xì)胞成分。例如，在一些實(shí)施方式中，再生細(xì)胞組合物分或脂肪消化物可以包含細(xì)胞溶液，該細(xì)胞溶液包括包含脂肪來源再生細(xì)胞，例如干細(xì)胞的脂肪來源細(xì)胞群。在一些實(shí)施方式中，再生細(xì)胞成分可以包含多種不同類型的再生細(xì)胞，包括ADSCs、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、分化或去分化的脂肪細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、單能和多能祖細(xì)胞和前體細(xì)胞(及其子代)和淋巴細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，再生細(xì)胞成分包括僅一個(gè)、僅兩個(gè)、僅三個(gè)、僅四個(gè)或更多類型的再生細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，再生細(xì)胞成分和脂肪消化物可以還包含一個(gè)或更多的可能是存在于組織片段中的污染物，如膠原蛋白。在一些實(shí)施方式中，脂質(zhì)體消化物或再生細(xì)胞溶液實(shí)質(zhì)上不存在完整的脂肪組織片段。本文所使用的“干細(xì)胞”，是指具有分化成各種其他類型的細(xì)胞的潛力，執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)特定功能，并具有自我更新能力的多能再生細(xì)胞。本文公開的干細(xì)胞中的一些可以是多能性的。本文所使用的“祖細(xì)胞”，是指具有分化成不止一個(gè)細(xì)胞類型的潛力的多能再生細(xì)胞。本文所使用的“祖細(xì)胞”還指具有分化成僅一個(gè)細(xì)胞類型的潛力，執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)特定的功能以及具有有限的或沒有自我更新能力的單能再生細(xì)胞。尤其，本文所使用的“內(nèi)皮祖細(xì)胞”是指具有分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛力的多能或單能細(xì)胞。本文所使用的“前體細(xì)胞”，是指具有分化成一種細(xì)胞類型的潛力的單能再生細(xì)胞。前體細(xì)胞及其子代可以保持廣泛的增殖能力，例如，淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，其可以在適宜條件下增殖。本文所使用的“干細(xì)胞數(shù)量”或“干細(xì)胞頻率”是指在克隆形成分析中觀察到的克隆數(shù)，在克隆形成分析中脂肪來源細(xì)胞(ADC)以低細(xì)胞密度(< 10，000細(xì)胞/孔)鋪板并且生長在支持MSC生長的生長培養(yǎng)基上(例如，輔以10%小牛血清、5%馬血清和抗生素/ 抗菌劑的DMEM/F12培養(yǎng)基)。培養(yǎng)物可以用蘇木精染色，染色之后，細(xì)胞可以生長兩個(gè)星期。超過50個(gè)細(xì)胞的克隆算作CFU-F。干細(xì)胞頻率是按照鋪板的每100個(gè)有核細(xì)胞中觀察到的CFU-F數(shù)量計(jì)算(例如；在以1，000個(gè)有核的ADC細(xì)胞起始的平板上計(jì)數(shù)的15個(gè)克隆計(jì)算出干細(xì)胞頻率為1.5% )，干細(xì)胞的數(shù)量是按照干細(xì)胞頻率乘以獲得的有核的ADC 細(xì)胞總數(shù)計(jì)算。高百分比的從ADC細(xì)胞生長的CFU-F表達(dá)骨髓來源干細(xì)胞(Barry等人， 1999)也表達(dá)的細(xì)胞表面分子⑶105。⑶105也由脂肪組織來源干細(xì)胞(Zuk等人，2002) 表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，脂肪組織可以根據(jù)本文所述的方法經(jīng)過加工來獲得脂肪消化物和/或脂肪來源細(xì)胞的濃縮群，其中細(xì)胞的至少0. 2%,0. 3%,0. 4%,0. 5%,0. 6%,0. %、 0. 8%,0. 9%U. 0%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11 %>12%U3%U4%,
30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%, 97^^98^^99%或100%是干細(xì)胞或脂肪消化物的其他類型的再生細(xì)胞或濃縮的脂肪來源細(xì)胞群。優(yōu)選地，在具有封閉的液體/組織通道以避免任何與外部環(huán)境的觸接和消除來自環(huán)境的污染的可能性的無菌的封閉的系統(tǒng)中，脂肪組織經(jīng)過加工來生產(chǎn)脂肪消化物或再生細(xì)胞溶液。現(xiàn)有技術(shù)中已知用于加工脂肪組織和生產(chǎn)脂肪消化物的裝置。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，脂肪組織經(jīng)過加工生產(chǎn)脂肪消化物，同時(shí)在一些實(shí)施方式中，使用例如在第7390484 號(hào)美國專利中所述的以引用的方式全部明確并入本文中的裝置保持完全封閉的系統(tǒng)。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，脂肪組織加工程序不包括離心、淘洗或任何用于濃縮包括脂肪來源再生細(xì)胞的細(xì)胞群的其他機(jī)械方法，這些方法引起或有可能導(dǎo)致在再生細(xì)胞組合物/脂肪消化物中的再生細(xì)胞生活力下降。在一些實(shí)施方式中，獲得脂肪消化物的過程包括從用于生產(chǎn)脂肪消化物或濃縮的脂肪來源細(xì)胞群的部分或單位脂肪組織中去除或耗盡成熟的充滿脂肪的脂肪細(xì)胞組合物的組織。在一些實(shí)施方式中，脂肪組織經(jīng)過一系列的清洗和分解步驟，其中該組織經(jīng)過第一次沖洗以減少游離脂質(zhì)的存在(從破裂的脂肪細(xì)胞釋放的)和外周血成分(在組織收獲過程中從切斷的血管釋放的)。例如，在一些實(shí)施方式中，脂肪組織與等滲鹽水，如磷酸鹽緩沖生理鹽水或其他生理溶液混合，(例如，巴克斯特公司PLASMALYTE ,雅培研究室諾莫索@( NORMOSO ),或乳酸鹽林格溶液)。然后，清洗后的組織可以分解成游離的完整的脂肪細(xì)胞和來自結(jié)締組織基質(zhì)的其他細(xì)胞群。在某些實(shí)施方式中，整個(gè)脂肪細(xì)胞成分或非再生細(xì)胞成分是從脂肪組織的再生細(xì)胞成分中分離的。在其他實(shí)施方式中，只有脂肪成分的一部分或多部分是從再生細(xì)胞中分離的。完整的脂肪組織片段可以通過幾種方法，包括但不僅限于過濾、傾析或沉淀等從游離脂質(zhì)和細(xì)胞中分離。優(yōu)選地，消化后的組織未經(jīng)過離心或淘洗。在一些實(shí)施方式中，用來生產(chǎn)脂肪消化物的脂肪組織完全被分解，而在其他實(shí)施方式中，其只有部分被分解。完整的脂肪組織片段，例如，來自未加工或清洗的脂肪組織的，可以使用包括機(jī)械力(切碎或剪切力)，單一或組合的蛋白水解酶如膠原蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶，第5952215號(hào)美國專利公開的裂解酶HI和胃蛋白酶或機(jī)械和酶法的結(jié)合的任何常規(guī)技術(shù)或方法進(jìn)行分解?？梢杂糜诜纸庵窘M織的利用膠原蛋白酶的另外的方法由第 5830714 號(hào)和第 5952215 號(hào)美國專利以及 Williams, S. K.，S. McKenney 等人(1995 年)“用于脂肪組織分解的膠原蛋白酶多選擇和純化(Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion)”細(xì)胞移植(Cell Transplant)4(3) 281-9公開。在一些實(shí)施方式中，如Twentyman，P. R.和J. Μ. Yuhas (1980) “細(xì)菌的中性蛋白酶用于分解小鼠腫瘤和多細(xì)胞腫瘤球狀體的用途(Use of bacterial neutral protease for disaggregation of mouse tumours and multicellular tumor spheroids)"Cancer Lett 9(3) :225-8所公開的，代替膠原蛋白酶或除膠原蛋白酶外，中性蛋白酶可以用于分解組織。在一些實(shí)施方式中，如Russell，S. W.，W. F. Doe等人(1976)“在實(shí)體鼠新生物中的炎癥細(xì)胞.組成的炎癥細(xì)胞的腫瘤分解以及識(shí)別anflammatory cells in solid murine neoplasms. Tumor disaggregation and identification of constituent inflammatory cells) "Int J Cancerl8(3) :322-30所公開的，用酶的組合物，例如膠原蛋白酶和胰蛋白酶的組合物分解脂肪組織。在一些實(shí)施方式中，如在Engelholm，S. Α.，Μ. Spang-Thomsen， 等人(1985) “通過結(jié)合機(jī)械和酶方法分解人類實(shí)體瘤(Disaggregation of human solid tumours by combined mechanical and enzymatic methods)" Br J Cancer 51(1) :93-8 公開的，利用酶例如胰蛋白酶和機(jī)械離解的結(jié)合可以分解脂肪組織。在一些實(shí)施方式中，脂肪組織的一部分經(jīng)過完全分解以分離來自成熟的脂肪細(xì)胞
14和結(jié)締組織的脂肪來源再生細(xì)胞(例如，脂肪來源干細(xì)胞)。在一些實(shí)施方式中，脂肪組織的一部分僅經(jīng)過部分分解。例如，可以用一種或多種酶進(jìn)行部分分解，從脂肪組織的至少部分中相對(duì)于否則酶將留在其上以完全降解該份脂肪組織的大量時(shí)間及早地去除該一種或多種酶。這樣的過程可能需要更少的加工時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，脂肪組織的部分或單位脂肪組織用無菌緩沖生理鹽水沖洗和在足以提供適當(dāng)分解的膠原蛋白酶濃度、溫度和時(shí)間下與膠原蛋白酶孵育。優(yōu)選地，用于分解的酶由有關(guān)當(dāng)局批準(zhǔn)供人類使用(例如，美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration))，并且沒有微生物和污染物，如內(nèi)毒素。適合的膠原蛋白酶制劑包括重組和非重組膠原蛋白酶。重組膠原蛋白酶可以從F.霍夫曼羅氏有限公司，印第安納州印第安納波利斯(F.Hoffmann-La Roche Ltd, Indianapolis, Ind)和/或發(fā)展生物制作公司，紐約布魯克(Adyance Biofactures Corp.，Lynbrook，N. Y.)獲得。非重組膠原蛋白酶也可以如第6475764號(hào)美國專利公開的方法獲得。例如，在一些實(shí)施方式中，脂肪組織用從約0. 5 μ g/ml至約100 μ g/ml、例如， 10 μ g/ml至約50 μ g/ml的膠原蛋白酶溶液處理，并在從約30°C至約38°C孵育約20分鐘至約60分鐘。根據(jù)膠原蛋白酶的來源，這些參數(shù)會(huì)不同，通過實(shí)驗(yàn)研究得以優(yōu)化，以驗(yàn)證該系統(tǒng)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間表內(nèi)在提取所需的細(xì)胞群方面是有效地。例如，在一些實(shí)施方式中，組織與包括膠原蛋白酶的溶液在約37°C，孵育10-15分鐘。在分解之后，可以清洗/沖洗脂肪消化物以除去分解過程中的添加劑和/或副產(chǎn)品，例如，膠原蛋白酶和/或其他酶分解劑以及新釋放出的游離脂質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，在使脂肪消化物滲透入未加工的干燥或脫水的脂肪組織的條件下，脂肪消化物可以應(yīng)用于未加工的干燥的或脫水的脂肪組織的部分。例如，在一些實(shí)施方式，脂肪消化物可以重懸，在未加工的脂肪組織、干燥的脂肪組織或脫水的脂肪組織的部分之上(或下)分層和利用重力脂肪消化物經(jīng)由未加工的脂肪組織(或干燥的或脫水的脂肪組織)得以過濾。在一些實(shí)施方式中，脂肪消化物經(jīng)未加工的脂肪組織被泵送，例如使用蠕動(dòng)泵，真空等。在一些實(shí)施方式中，將脂肪消化物添加到未加工的脂肪組織以產(chǎn)生混合物，經(jīng)過機(jī)械或手動(dòng)攪動(dòng)或搖動(dòng)混合物。由于脂肪消化物經(jīng)由未加工的脂肪組織過濾或與未加工的脂肪組織混合，脂肪來源再生細(xì)胞可以由結(jié)締組織基質(zhì)結(jié)合，生理鹽水和其它液體流過組織，從而產(chǎn)生以脂肪來源再生細(xì)胞(例如包括干細(xì)胞的脂肪來源再生細(xì)胞)補(bǔ)充或加強(qiáng)的脂肪移植物或植入物。在一些實(shí)施方式中，例如，生理鹽水、成熟的脂肪細(xì)胞、紅細(xì)胞等的流動(dòng)得以去除到廢物箱。用于產(chǎn)生補(bǔ)充的脂肪組織移植物的系統(tǒng)和裝置在下面更詳細(xì)討論，該方法的實(shí)施方式在圖1所示的示意圖中得以描述。圖1顯示用于制備補(bǔ)充的脂肪組織移植物的示例性途徑的示意圖。在第一步中， 通過進(jìn)口向封閉/無菌的容器(例如，可折疊的柔性袋或如本文其他地方描述的剛性容器) 中提供單位脂肪組織。如本文所述，脂肪組織在容器內(nèi)經(jīng)沖洗/清洗以及消化同時(shí)保持封閉的系統(tǒng)。在圖1所示的實(shí)施方式中，第一個(gè)容器具有進(jìn)口和出口。如圖1所示的第一個(gè)容器具有進(jìn)口和出口，然而，技術(shù)人員將理解本文所述的裝置可以包括多個(gè)，即，1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10，或更多的進(jìn)口和出口。優(yōu)選地，進(jìn)口和出口配置為無菌添加和/或去除第一個(gè)容器中的內(nèi)容物(例如，組織、添加劑、溶液等)。在圖1公開的實(shí)施方式中，在第二容器(例如，可折疊的柔性袋或如本文其他地方所述的剛性容器)中提供第二脂肪組織單元或第一脂肪組織單元的部分。在圖1所示的實(shí)施方式中，第二個(gè)容器有一個(gè)進(jìn)口或多個(gè)進(jìn)口，以及一個(gè)出口或多個(gè)出口。第二個(gè)容器的進(jìn)口配置為將內(nèi)容物(例如，脂肪消化物或脂肪來源細(xì)胞濃縮群)添加到容器中，優(yōu)選地，同時(shí)保持封閉的無菌液體通道。出口配置為從第二容器去除內(nèi)容物，例如，多余的清洗液、游離脂質(zhì)脂、血液等。如圖1所示的實(shí)施方式，在消化之后，脂肪消化物和非分解的脂肪組織片段和游離脂質(zhì)在第一個(gè)容器內(nèi)形成不同層。允許脂肪消化物層通過密閉容器的出口離開(例如， 通過如圖1所示的泵或真空)以及，例如，通過保持封閉的系統(tǒng)的導(dǎo)管進(jìn)入到包含單獨(dú)的未加工或清洗的干燥或脫水的脂肪組織的容器中。在使脂肪消化物或在脂肪消化物或脂肪來源細(xì)胞濃縮群中分離的脂肪來源再生細(xì)胞滲透入脂肪組織的條件下，來自第一容器的脂肪消化物與未加工的，干燥或脫水的脂肪組織混合。在圖1中，再生細(xì)胞經(jīng)由未加工的或干燥的脂肪組織泵送以產(chǎn)生補(bǔ)充的脂肪組織移植物。在一些實(shí)施方式中，任何多余的脂肪消化物或濃縮的脂肪來源細(xì)胞溶液通過在第二容器中設(shè)置無菌環(huán)在第二個(gè)容器中經(jīng)由未加工的、干燥或脫水的脂肪組織循環(huán)，其中多余的再生細(xì)胞溶液或脂肪消化物經(jīng)由離開端口(出口)排入通向儲(chǔ)藏脂肪組織的容器的進(jìn)入端口(進(jìn)口)的導(dǎo)管。應(yīng)當(dāng)理解在制造本文所述的強(qiáng)化或補(bǔ)充的脂肪組織移植物中，用于生產(chǎn)脂肪消化物或濃縮的脂肪來源細(xì)胞溶液，并用于作為脂肪組織移植物的基本成分或基礎(chǔ)的各單位脂肪組織或各脂肪組織的部分的體積可以是相等的，或者他們可以是不同的。例如，用于制造脂肪消化物的脂肪組織的體積可以比其他單位脂肪組織的體積多至少大于或等于約10%、 20 % ,30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,70 % ,80 % ,90 % UOO % UlO % ,120 % ,130 % ,140 % ,150 %, 160% ,170% ,180% ,190%,200,210%,220%,230%,240%,250%,260%,270%,280%, 290%、300%，或這個(gè)范圍之間任何數(shù)。在一些實(shí)施方式中，用于制造脂肪消化物的脂肪組織的體積比其他單位脂肪組織的體積少至少大于或等于約lO^JO^JO^dO^jO^、 60 %,70 %,80 %,90 %U00 %U10 %U20 %U30 %U40 %U50 %U60 %,170 %,180 190%、200、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、300%，或在此范圍之間的任何數(shù)。在一些實(shí)施方式中，脂肪消化物移植物組織的比例為0.25 1， 0.5 1,0. 75 1,1 1,1. 25 1,1. 5 1,1. 75 1 或 2 1，或在這個(gè)范圍之間的何任數(shù)。優(yōu)選地，脂肪消化物移植物組織的比例小于約1 1，如0.5 1或0.25 1。在一些實(shí)施方式中，部分加工的脂肪組織(例如，消化的脂源細(xì)胞 (Iipoaspirate)或再生細(xì)胞溶液)，和/或部分未加工的脂肪組織、干燥的脂肪組織、脫水的脂肪組織和/或本文所述的以脂肪來源再生細(xì)胞的補(bǔ)充的脂肪組織移植物可以與添加齊U，例如其他細(xì)胞、組織、組織碎片、脫礦物質(zhì)骨、或因子或試劑，例如裂解脂肪細(xì)胞和/或紅細(xì)胞添加劑組合，強(qiáng)化，補(bǔ)充，增強(qiáng)或混合。例如，在一些實(shí)施方式，加工的脂肪組織的部分，和/或未加工的脂肪組織(或干燥的或脫水的脂肪組織)的部分，和/或本文所述的以脂肪來源再生細(xì)胞補(bǔ)充的脂肪組織移植物可以與生長因子添加劑如胰島素或藥物例如西厄格列酮(thiaglitazone)類藥物、抗生素、生物活性或惰性化合物例如凝固酶、細(xì)胞重團(tuán)聚抑制劑、可吸收塑料支架或旨在增強(qiáng)細(xì)胞群的遞送、功效、耐受性或功能的其他添加劑組合，補(bǔ)充或混合。
在某些實(shí)施方式中，未加工的脂肪組織、干燥的脂肪組織、脫水的脂肪組織，脂肪消化物和/或補(bǔ)充的脂肪組織移植物可以以一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞分化劑添加劑，例如細(xì)胞因子和生長因子補(bǔ)充。在一些實(shí)施方式中，將一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞分化劑，例如細(xì)胞因子和生長因子，即來自脂肪組織移植物的不同的成分分別地提供給接受脂肪組織移植的受試者。例如， 在一些實(shí)施方式中，組合物以血管生成(anigiogenic)劑或因子補(bǔ)充。在一些實(shí)施方式中， 將作為添加劑的血管生成因子提供給本文所述的未加工的脂肪組織、干燥的脂肪組織、脫水的脂肪組織、脂肪消化物和/或補(bǔ)充的脂肪移植物。如本文所使用，術(shù)語“血管生成”是指通過從現(xiàn)有的血管和組織生成新的血管的過程(Folkman，19%)。本文中所使用的“血管生成因子”或“血管生成蛋白”是指任何能夠促進(jìn)來自現(xiàn)有的血管的新血管生長(“血管生成”)的已知的蛋白質(zhì)、肽或其他試劑。用在本發(fā)明中適合的血管生成因子包括，但不僅限于，胎盤生長因子(Luttun等人，2002)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Aharinejad等人，1995)， 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Buschmarm等人，2003年)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A、 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E (Mints 等人，2002)，神經(jīng)黏連因子(Wang 等人， 2003 年)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，F(xiàn)GF-2 (bFGF)、FGF-3、FGF4、FGF-5、FGF-6 (Botta 等人，2000)，血管生成素1，血管生成素2 (Sundberg等人，2002)，促紅細(xì)胞生成素(Ribatti等人，2003)，BMP-2、BMP4、BMP-7 (Carano 和 FiIvaroff，2003 年)，TGF-β (Xiong 等人，2002 年)、IGF-I (Shigematsu等人，1999)、骨橋蛋白(Asou 等人，2001)，多效蛋白(Pleiotropin) (Beecken 等人，2000)，激活素(Lamouille 等人，200 ，內(nèi)皮素 1 (Bagnato 和 Spinella， 2003年)及其組合。血管生成因子可以單獨(dú)起作用，或與另一個(gè)組合起作用。在組合時(shí)，血管生成因子還可以協(xié)同作用，即因子的并用效果大于各個(gè)因子分別作用的效果的總和?！把苌梢蜃印被颉把苌傻鞍住边€包括此類因子的功能類似物。功能類似物包括，例如，因子的功能部分。功能類似物還包括與因子的受體結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體，因此，在促進(jìn)血管生成中模仿因子的活性。產(chǎn)生這種抗獨(dú)特型抗體的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的并且得以描述，例如在W097/23510中，其內(nèi)容以引用的方式全部明確并入本文中。本文公開的實(shí)施方式中有用的血管生成因子，可以或從任何合適的來源生產(chǎn)或獲得。例如，因子可以從它們的天然來源純化，或合成生產(chǎn)或通過重組表達(dá)。因子可作為蛋白質(zhì)組合物、以編碼因子的表達(dá)質(zhì)粒的形式或與本文公開的成分混合形式給予受試者。合適的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建是眾所周知的。構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的合適的載體，包括例如腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺伴隨病毒載體、RNA載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)、慢病毒載體和轉(zhuǎn)座子。在一些實(shí)施方式中，為美容、組織或治療目的的來源，以改變、增強(qiáng)或補(bǔ)充組合物的功能這樣一種方式，加工的脂肪組織，如脂肪消化物或再生細(xì)胞溶液的細(xì)胞，未加工的脂肪組織，干燥的脂肪組織，脫水的脂肪組織的細(xì)胞，或本文所述的補(bǔ)充的脂肪組織移植物的細(xì)胞，也可以通過DNA插入或通過放置于細(xì)胞培養(yǎng)中得以修飾。例如，Mosca, J. D.， J. K. Hendricks等(2000年)“間質(zhì)干細(xì)胞作為基因傳遞載體(Mesenchymal stem cells as vehicle for gene delivery) "Clin Orthop (379Suppl) :S71_90 所公開的，干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，Walther，W.和U. Mein(2000). “用于基因轉(zhuǎn)化的病毒載體在人類疾病治療中它們的用途的綜論(Viral vectors for gene transfer -.a review of their use in the treatment of human disease) "Drugs 60(2) :249-71,以及 Athanasopoulos，T.，S. Fabb 等人(2000) “基于腺伴隨病毒的基因
17治療載體對(duì)獲得性或遺傳性疾病的特性和應(yīng)用(綜論)(Gene therapy vectors based on adeno-associated virus characteristics and applications to acquired and inherited disease (review)) "Int J MoI Med 6(4) :363-75所公開的，可以包括病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，更具體，腺伴隨病毒基因轉(zhuǎn)化技術(shù)。如Muramatsu，Τ.，A. Nakamura,等人(1998) “體內(nèi)電穿孔將非病毒基因轉(zhuǎn)化到活動(dòng)物的組織中的強(qiáng)大并且方便的方法(綜論)(In vivo electroporation -.a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissue of living animals (Review)) ” Int J MoI Med 1 (1) :55-62 所公開的，基于非病毒的技術(shù)也可以得以進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施方式中，加工的組織的細(xì)胞沒有經(jīng)過培養(yǎng)。更優(yōu)選地，加工的組織的細(xì)胞保持在封閉的無菌的系統(tǒng)中直到使用他們，例如，直到它們被裝載在遞送裝置中或與未加工的或干燥的或脫水的脂肪組織組合或直接遞送到受試者中。脂肪組織移植物給予除了獲得細(xì)胞和/或組織的受試者以外的受試者的實(shí)施方式中，可以將一個(gè)或多個(gè)免疫抑制劑添加劑給予接受移植物的受試者以減少，優(yōu)選地，預(yù)防移植排斥。適合本文所公開的方法的免疫抑制劑的例子包括抑制T-cell/B-cell共刺激途徑的試劑，如干擾T細(xì)胞和B細(xì)胞通過CTLA4與B7途徑耦合的試劑，如公布號(hào)為 20020182211的美國專利所公開的。其他例子包括環(huán)孢霉素、霉酚酸酯(myophenylate mofetil)、雷帕霉素(rapamicin)、抗胸腺細(xì)胞球蛋白。通過本文公開的方法生產(chǎn)的補(bǔ)充的脂肪組織移植物可以直接給予受試者。本文中所使用的術(shù)語“給予”、“引入”、“遞送”、“放置”和“移植”互換使用，并且是指通過導(dǎo)致植入物或脂肪移植在所需位點(diǎn)至少部分定位的方法或途徑，將本文所公開的組合物例如補(bǔ)充的脂肪移植物放置入受試者中。在一些實(shí)施方式中，在給藥前沒有從系統(tǒng)中去除或沒有暴露在產(chǎn)生補(bǔ)充的脂肪組織移植物的系統(tǒng)或裝置的外部環(huán)境中的情況下，補(bǔ)充的脂肪組織移植物(例如，補(bǔ)充脂肪來源再生細(xì)胞的脂肪移植物)可以給予受試者。提供封閉的系統(tǒng)降低給予受試者的物質(zhì)的污染的可能性。因此，加工脂肪組織和產(chǎn)生補(bǔ)充的脂肪組織移植物同時(shí)保持封閉的系統(tǒng)提供超過現(xiàn)有方法的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榛钚约?xì)胞群更可能是無菌的。在這樣的實(shí)施方式中，脂肪消化物或補(bǔ)充的脂肪組織移植物暴露到外部環(huán)境或從系統(tǒng)中去除的唯一時(shí)間是將補(bǔ)充的細(xì)胞或移植物移入應(yīng)用裝置以及給予受試者時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，應(yīng)用裝置也可以是封閉的系統(tǒng)的一部分。因此，在一些實(shí)施方式中，脂肪消化物或補(bǔ)充的脂肪組織移植物沒有經(jīng)過用于培養(yǎng)的加工或冷凍保存。在一些實(shí)施方式中，將未加工的組織、干燥的脂肪組織、脫水的脂肪組織、脂肪消化物和/或補(bǔ)充的脂肪組織移植物的至少部分得以儲(chǔ)存供以后植入/注入。例如，本文所公開的組合物(即未加工的組織、干燥的脂肪組織、脫水的脂肪組織、脂肪消化物、濃縮的細(xì)胞脂肪來源的細(xì)胞群和/或補(bǔ)充的脂肪組織移植物)可以劃分成一個(gè)以上等份或單位使得為以后的應(yīng)用組合物的部分得以保留而將該部分直接應(yīng)用到病人。為通過例如皮下技術(shù)放置入受試者，在加工結(jié)束后，補(bǔ)充或強(qiáng)化的脂肪組織移植物可以裝載入傳遞裝置，如注射器、支架、可吸收膠囊或植入物。換句話說，通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何手段，可以將補(bǔ)充、增強(qiáng)或強(qiáng)化的脂肪移植物或植入物放置入病人中， 例如，可以將它們引入真皮(皮下)中，引入組織間隔中，或引入組織(如乳房、臀部等)中或其他位置。優(yōu)選地，裝載發(fā)生同時(shí)保持封閉的系統(tǒng)。優(yōu)選的實(shí)施方式，包括由針、導(dǎo)管放置，或通過聯(lián)合添加劑的直接外科植入，例如預(yù)成型的基質(zhì)或可吸收的乳房形膠囊。
本文所用的術(shù)語“受試者”包括溫血?jiǎng)游铮瑑?yōu)選包括人類的哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試者是靈長類動(dòng)物。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試者是人。用于生產(chǎn)干燥的脂肪組織移植物和補(bǔ)充的脂肪組織移植物的裝置如上所述，本文所提供的是用于制造干燥或脫水的脂肪組織和補(bǔ)充或強(qiáng)化的脂肪組織移植物的裝置和/或系統(tǒng)，借助于圖2所示的是用于生產(chǎn)適合以脂肪來源再生細(xì)胞補(bǔ)充的脂肪組織移植物的示例性系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括柔性收集容器200，例如，具有將該袋分隔成第一內(nèi)部室280和第二個(gè)內(nèi)部室四0的濾網(wǎng)層210的醫(yī)療級(jí)收集袋。在一些實(shí)施方式中，過濾器可以包含允許內(nèi)容物例如，成熟的脂肪細(xì)胞、紅細(xì)胞、生理鹽水，從第一內(nèi)部室通過到第二內(nèi)部室的多個(gè)開口或小孔，優(yōu)選地過濾器的小孔大于約30μπι。例如，在一些實(shí)施方式中，過濾器的多個(gè)開口可以約大于，小于或等于30 μ m、35 μ m、40 μ m、50 μ m、60 μ m、 70 μ m、80 μ m、90 μ m、100 μ m, 110 μ m、120 μ m、130 μ m、140 μ m、150 μ m、160 μ m、170 μ m、 180 μ m、190 μ m、200 μ m、210 μ m、220 μ m、230 μ m、240 μ m、250 μ m、260 μ m、270 μ m、280 μ m、 290 μ m、以及300 μ m或此范圍之間的任何數(shù)。例如，在一些實(shí)施方式中，過濾器210的多個(gè)開口可以在約30 μ m至500 μ m之間(例如，約60 μ m-300 μ m、如74-約265 μ m)。在一些實(shí)施方式中，第一內(nèi)部室280包括兩個(gè)端口 220，230。在一些實(shí)施方式中， 第二內(nèi)部室290包括一個(gè)端口 M0。在一些實(shí)施方式中，柔性收集容器200包括用于清洗或沖洗液的清洗容器250，清洗容器250經(jīng)由端口 220可操作地連接到內(nèi)部收集室280使經(jīng)由封閉液體通道從容器250到內(nèi)部室觀0的溶液通過成為可能。在一些實(shí)施方式中，240 端口可操作地連接到廢物袋260，內(nèi)容物，例如紅細(xì)胞、生理鹽水和成熟的脂肪細(xì)胞通過廢物袋260從內(nèi)部室四0中去除。在一些實(shí)施方式中，將脂肪組織經(jīng)由端口 220添加到柔性收集室200。在一些實(shí)施方式中，將沖洗液，例如乳酸林格溶液，經(jīng)由端口 230添加到第一內(nèi)部室。然后例如，在機(jī)械搖臂或其他攪動(dòng)裝置上攪動(dòng)或搖動(dòng)柔性收集容器。將紅細(xì)胞、多余的沖洗液、裂解的細(xì)胞以及成熟的脂肪細(xì)胞和脂質(zhì)從室280存在的組織中去除。在一些實(shí)施方式中，系統(tǒng)配置為允許將脂肪消化物無菌添加到儲(chǔ)存沖洗后的脂肪組織的內(nèi)部室觀0中。例如，柔性收集容器200可以包含額外的提供至內(nèi)部室觀0的無菌進(jìn)入通道的端口，經(jīng)由該端口脂肪消化物可以得以定位。圖3至圖13顯示本文所公開的用于生產(chǎn)優(yōu)化的脂肪組織移植物的系統(tǒng)的其他實(shí)施方式。圖3和圖4顯示系統(tǒng)300的示例性構(gòu)造，系統(tǒng)300提供了控制脂肪組織移植物的水合的封閉的無菌的過程，例如將干燥或脫水的脂肪組織裝箱。例如，由于液體從移植的組織中的再吸收或吸收進(jìn)入人體，植入后常見的與制備的脂肪組織植入物相關(guān)的問題涉及植入物行為的不可預(yù)測(cè)性。正如下面所討論的，系統(tǒng)300提供了具有與常規(guī)獲得的脂肪組織移植物相比，通過產(chǎn)生較干的移植物，減少這種變異性的能力的控制器。此外，這個(gè)較干的脂肪組織移植物或植入物可以選擇地以脂肪消化物(或包括再生細(xì)胞的濃縮的脂肪來源細(xì)胞群)補(bǔ)充，或直接給予受試者。圖3和圖4顯示用于制備較干的或脫水的脂肪組織的系統(tǒng)300的一個(gè)實(shí)施方式的構(gòu)造。系統(tǒng)300包括密封起來形成系統(tǒng)300的外層的第一外殼310和第二外殼340 (共同地以及可替換稱作“外殼(outer shells) ”或“外殼(outer shell) ”)。圖5顯示系統(tǒng)300使用的示例性外殼310(或340)。正如下面所討論的，外殼310，340可貼附，連接或密封起來形成柔性可折疊的袋。圖8顯示可用于制造系統(tǒng)300的示例性封口 311的細(xì)節(jié)。第一外殼 310和第二外殼340可以由現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何醫(yī)療級(jí)柔性材料，例如醫(yī)療級(jí)的USP類 VI或醫(yī)療級(jí)乙基乙烯基乙酸酯(EVA)制成。在一些實(shí)施方式中，形成第一外殼和第二外殼的柔性材料可以由可以與自身結(jié)合的材料制成。在其他實(shí)施方式中，形成第一外殼和第二外殼的柔性材料可以是任何可以與自身結(jié)合以及能夠捕獲和/或密封系統(tǒng)或子系統(tǒng)中存在的任何其他材料的材料。外殼也可以由可以承受低溫保存的材料制成。外殼也可以由透明或彩色的耐高壓加熱的材料、生物相容性的材料，耐體液的材料和/或可滅菌例如輻射、 環(huán)氧乙烷或干熱的材料制成。僅通過舉例的方式，材料可以是醫(yī)療級(jí)EVA。在優(yōu)選實(shí)施方式中，材料可以是可結(jié)合自身以及捕獲其他材料的材料，例如，系統(tǒng)中存在的過濾器。通過本文進(jìn)一步描述的過程，例如射頻焊接法可以完成結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，如圖3至圖13所示的系統(tǒng)300中， 外殼可以由沿外殼周邊的雙熱封口而封口密封起來。外殼或任何子系統(tǒng)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的膠粘劑密封?？梢钥紤]包括它們的作用機(jī)制的要使用的粘合劑的類型。例如， 可以使用通過損失溶劑硬化的粘合劑、通過失水硬化的粘合劑、通過冷卻硬化的粘合劑、通過化學(xué)反應(yīng)硬化的粘合劑、不硬化粘合劑-壓敏膠粘合劑。可以考慮例如通過物理吸附的粘附、化學(xué)結(jié)合的粘附、粘附靜電理論、機(jī)械連鎖、通過相互擴(kuò)散的附著力、弱邊界層和壓力敏感粘附等機(jī)制。將要連接的表面也必須得到處理，如表面形貌，表面熱力學(xué)和表面化學(xué)分析。為最佳的密封要連接的某些表面可能還需要特別的預(yù)處理。例如可以考慮對(duì)金屬的適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，對(duì)無機(jī)材料的預(yù)處理，對(duì)塑料的預(yù)處理和對(duì)柔性體的預(yù)處理。在一些實(shí)施方式中，產(chǎn)生的系統(tǒng)和子系統(tǒng)有利地具備使他們能夠承受壓力的機(jī)械性能。因此，必須進(jìn)行粘接接頭的球形壓力分析以及有限元分析。也必須評(píng)估粘接接頭的耐久性。例如，必須考慮減少光氧化降解的添加劑。在潮濕的環(huán)境中，對(duì)于金屬結(jié)構(gòu)接頭的行為必須予以考慮。還必須考慮水和粘合劑，水和粘合劑界面，其他液體及木材接頭。在一些實(shí)施方式中，利用常規(guī)超聲波、結(jié)合測(cè)試儀、快速掃描方法和粘附特性測(cè)量法，可能需要進(jìn)行無損檢測(cè)。膠著地結(jié)合的接頭的影響行為也可能需要進(jìn)行評(píng)估。例如，可以評(píng)估粘合齊_膠著地結(jié)合的接頭的沖擊試驗(yàn)，在高效率負(fù)載下的粘合劑的特性以及受沖擊負(fù)載的膠著地結(jié)合的接頭的變化和應(yīng)力分布。也可能希望評(píng)估粘結(jié)結(jié)合的斷裂力學(xué)。例如，能源失效標(biāo)準(zhǔn)、應(yīng)力強(qiáng)度、能量釋放率、熱力學(xué)、內(nèi)在的以及實(shí)際的粘合能量、斷裂能和耐用性的評(píng)價(jià)?？稍u(píng)估的其他因素包括疲勞、減振、連接類似和不同的材料以及粘接復(fù)合材料。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，使用射頻(RF)焊接可以密封系統(tǒng)的外殼或任何子系統(tǒng)或任何適當(dāng)組合。射頻焊接也稱為介電或高頻(HF)焊接。RF焊接是應(yīng)用無線電頻率將材料融合在一起的過程。由此產(chǎn)生的焊縫可以像原始材料一樣牢固。射頻焊接依賴于被焊接材料的某些性質(zhì)以造成在快速交變電場(chǎng)中熱的產(chǎn)生。具體來說，這個(gè)過程涉及使被連接的部分經(jīng)受在兩個(gè)金屬條之間施加的高頻率(13-lOOMHz)的電磁場(chǎng)導(dǎo)致材料加熱而融合在一起。使用這種技術(shù)，只有某些材料可焊接。聚氯乙烯(PVC)和聚氨酯是由射頻工藝焊接的最常見的熱塑性塑料。雖然可能需要特殊的條件，包括尼龍、聚酯(PET)、乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)和一些丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABQ樹脂的其他聚合物的射頻焊接是可能的。例如除了射頻功率，如果使用預(yù)熱的焊接條，尼龍和PET是可焊性的。射頻焊接可能不適合聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。然而，已經(jīng)開發(fā)了特級(jí)聚
20烯烴，它具有被射頻焊接的能力。射頻焊接的主要功能是在兩個(gè)或多個(gè)薄板材料厚度上形成接合。通過合并與焊接面臨近的刀口，這個(gè)過程可以同時(shí)焊接和切割材料。刀口充分地壓緊熱塑料以使多余的廢料被撕下，因此這個(gè)過程通常被稱為撕裂密封焊接。其他片的材料焊接到產(chǎn)品表面也是可能的。在一些實(shí)施方式中，系統(tǒng)和子系統(tǒng)也可以使用超聲波焊接密封。當(dāng)通過超聲波焊接結(jié)合材料時(shí)，所需的能量以機(jī)械振動(dòng)的形式出現(xiàn)。焊接工具(sonotrode)將焊接的部分連接，并且在縱向方向移動(dòng)它。要焊接部分保持靜態(tài)。同時(shí)，要結(jié)合的部分壓在一起。靜態(tài)和動(dòng)態(tài)力的同時(shí)作用，導(dǎo)致該部分的融合，而無需使用額外的材料。此過程可以在連接可在本文所述系統(tǒng)中使用的塑料和金屬的工業(yè)規(guī)模中使用。對(duì)塑料的超聲波焊接，在結(jié)合區(qū)域的熱升高是由機(jī)械振動(dòng)的吸收、連接區(qū)域的振動(dòng)反射以及該部分的表面摩擦而產(chǎn)生。振動(dòng)垂直地引入。在收縮區(qū)域產(chǎn)生摩擦熱，使物料局部塑料化，在很短的時(shí)間內(nèi)使兩部分之間的不溶性連接成形。前提條件是兩個(gè)被加工件具有近似相當(dāng)?shù)娜埸c(diǎn)。超聲波焊接中接頭質(zhì)量是非常均勻的，因?yàn)槟芰哭D(zhuǎn)移和釋放的內(nèi)部的熱量保持不變，并且限制在連接區(qū)域。為了獲得最佳結(jié)果，連接區(qū)域得以準(zhǔn)備以使它們適合超聲波焊接。除了塑料焊接，超聲波也可以用來鉚接本文所述的系統(tǒng)的被加工件，或?qū)⑿枰慕饘俨考度氲剿芰现?。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本文所公開的系統(tǒng)可以由除了上面所述的柔性材料以外的材料制成。例如，在一些實(shí)施方式中，本文所述的系統(tǒng)或系統(tǒng)部件可以由金屬制造。在這樣實(shí)施方式中，超聲波金屬焊接可用于連接或?qū)⑾到y(tǒng)部件彼此粘上。與其他過程不同，要焊接的部分沒有加熱到熔點(diǎn)，而是由施加壓力和高頻機(jī)械振動(dòng)連接。與塑料焊接相比，水平引入超聲波金屬焊接過程中使用的機(jī)械振動(dòng)。具體來說，在超聲波金屬焊接過程中，涉及靜力、振蕩剪切力和焊接區(qū)域的溫度適度增加的復(fù)雜的過程被引發(fā)。這些因素的大小取決于工件的厚度、其表面結(jié)構(gòu)、其機(jī)械性能。工件放置在在焊接過程中以高頻率(通常為20kHz或35kHz 或40kHz)振蕩的固定的機(jī)件之間，即鐵砧和焊接模具。最常用的振蕩頻率(工作頻率)為 20kHz。這個(gè)頻率在人耳聽的見的頻率之上，也允許的最大限度地利用能源。只需要少量的能量的焊接過程，可以使用35kHz或40kHz的工作頻率。圖3至圖13所示的示例性系統(tǒng)300包括由在外殼310和外殼340之間插入過濾材料320創(chuàng)建的第一子系統(tǒng)和第二的子系統(tǒng)或第一室和第二室。第一子系統(tǒng)或室是指由外殼 310和過濾材料320之間的區(qū)域限定，第二子系統(tǒng)或室是由過濾材料320和外殼340之間的區(qū)域限定。在某些實(shí)施方式中，沿系統(tǒng)300周邊的雙熱封口捕獲過濾材料320使得在系統(tǒng) 300內(nèi)形成兩個(gè)不同的子系統(tǒng)或室。過濾材料可以包括多個(gè)開口，理想地能使或允許某些內(nèi)容物的大部分，例如，液體、腫脹液、紅細(xì)胞、清洗液(如生理鹽水，乳酸林格氏液等)、細(xì)胞碎片通過以及能使或允許某些內(nèi)容物的大部分，例如，成熟的脂肪細(xì)胞、再生細(xì)胞、干細(xì)胞、 祖細(xì)胞和結(jié)締組織的保留。通過和保留的成分將由過濾材料的開口的大小來決定，也就是說，一般比開口小的成分將通過，比開口大的成分將予以保留。因此，過濾材料可基于感興趣的成分的大小選擇。可以理解這取決于系統(tǒng)的條件，例如，壓力、空氣流量、粘度等，將通過的比過濾材料的開口小的成分的數(shù)量或百分比，和將保留的比開口大的成分的數(shù)量或百分可以有所不同。優(yōu)選地，過濾材料具有允許內(nèi)部或子系統(tǒng)之間的液體傳遞的多個(gè)小孔。小孔使插入在一個(gè)子系統(tǒng)中的組合物(或其成分)擴(kuò)散到另一個(gè)子系統(tǒng)中，或反之亦然。優(yōu)選地，小孔位于任何可使用的過濾器的表面的大幅區(qū)域。示例性過濾器如圖6所示。任何允許多余的液體、紅血細(xì)胞或細(xì)胞碎片的過濾器可以在系統(tǒng)300中使用。例如，任何保留脂肪細(xì)胞、再生細(xì)胞和干細(xì)胞，或結(jié)締組織的過濾可以得以使用。一些實(shí)施方式提供了系統(tǒng)300，其中過濾材料320的小孔可以在從約1 μ m左右到約750 μ m范圍內(nèi)， 例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、 210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、 400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、 590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740 或 750 μ m 或在這之間的任何數(shù)字或范圍。優(yōu)選地，過濾材料的多個(gè)開口或小孔為大于40μπ 。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，過濾材料320的多個(gè)開口可以為74 μ m。在其他實(shí)施方式中，多個(gè)開口的范圍可以從約73至約264 μ m。如圖3至圖13所示，在一些實(shí)施方式中，第二子系統(tǒng)或室，S卩，以上所述的過濾材料320和外殼340之間的區(qū)域可進(jìn)一步分為兩個(gè)子系統(tǒng)，使得形成第三子系統(tǒng)或室。例如， 在過濾材料320和外殼340之間插入分離器330，如分離篩、網(wǎng)眼或過濾器。示例性的包括分離篩(screen)的分離器如圖7所示。第二和第三的子系統(tǒng)或室可以包含來自第一個(gè)子系統(tǒng)的溶液、廢水、廢物，碎片和其他不需要的物質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，第二和第三的子系統(tǒng)或室是部分彼此不同的。在一些實(shí)施方式中，第二和第三的子系統(tǒng)或室是完全彼此不同的。例如，在一些實(shí)施方式中，分離器330，例如，分離篩具有自由度，或在第三子系統(tǒng)中完全自由活動(dòng)以致形成與第二子系統(tǒng)不是完全分開的第三子系統(tǒng)。在其他實(shí)施方式中，第二和第三子系統(tǒng)彼此是完全不同的，其中使用任何現(xiàn)有技術(shù)中已知的或本文所述的連接機(jī)制， 例如，粘合連接、射頻焊接、超聲波焊接、分離器，例如，分離篩在外層310和340之間捕獲。 技術(shù)人員將容易理解可以用來粘上系統(tǒng)300的不同層，例如，第一和第二的外殼，過濾器和分離器的幾種方法可以選擇以確保最佳的密封強(qiáng)度。在一些實(shí)施方式中，分離器330 (例如，分離篩)配置為使過濾材料320和外殼340 之間的接觸最小化。最小化接觸防止在組織加工(例如，當(dāng)在袋內(nèi)真空發(fā)展時(shí))過程中過濾材料320和外殼340彼此粘附。因此，分離篩330在過濾材料320和外殼340之間創(chuàng)建空間。在某些實(shí)施方式中，分離器可以包括在外殼340和過濾器320之間創(chuàng)建空間的肋材、 框架和其他裝置。在其他實(shí)施方式中，外殼340的面向過濾材料320的一側(cè)可以具有某種構(gòu)造以創(chuàng)建必要的空間，從而避免明顯的分離器的需要。系統(tǒng)的過濾器和外殼之間的空間的創(chuàng)建產(chǎn)生在袋內(nèi)從脂肪組織拉、吸引或吸走多余的液體到第二和/或第三子系統(tǒng)的力。 然后多余的液體可以被引導(dǎo)入廢物箱。優(yōu)選地，由分離器創(chuàng)建的空間，例如，分離篩330，和 /或用于產(chǎn)生分離器的材料也得以設(shè)計(jì)、配置或選擇為吸走脂肪組織中存在的脂質(zhì)，從而幫助從第一子系統(tǒng)或室的組織中去除脂質(zhì)和液體，進(jìn)一步干燥或脫水組織。在某些實(shí)施方式中，分離器330是由多孔性物質(zhì)制成和/或由包括多個(gè)開口或小孔。在某些實(shí)施方式中，分離器330的多個(gè)小孔可以為約300至約3000 μ m或在此范圍之間的任何數(shù)，如約500至約2000 μ m。優(yōu)選地，多個(gè)開口或小孔具有大于或等于約300 μ m、 400 μ m、500 μ m、600 μ m、700 μ m、800 μ m、900 μ m、1000 μ m、1100 μ m、1200 μ m、1300 μ m、 1400 μm、1400 μm、1500 μm、1600 μm、1700 μ m、1800 μm、1900 μ m、2000 μm、2100 μ m、2200 μ m、2300 μ m、2400 μ m、2500 μ m、2600 μ m、2700 μ m、2800 μ m、2900 μ m、3000 μ m、或在
這個(gè)范圍之間的任何數(shù)的直徑。在一個(gè)實(shí)施方式中，多個(gè)開口為約ΙΟΟΟμπι。在一些實(shí)施方式中，分離器是由具有開口面積大于或等于約10%、12%、14%、16%、1%、20%、22%、 24%,26%,28%,30%,32%, 35%,36%,38%,40%,42%,44%,46%,48%,50%,52%, 討％、56%、58%、60%、62%、65%或在此范圍內(nèi)的任何％的多孔材料制成。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，大尺寸的小孔允許材料從第一室更快轉(zhuǎn)移到或排入第二室中，分離器的孔徑可以調(diào)整以平衡吸走和/或排出或過濾性能。在一些實(shí)施方式中，液體和脂質(zhì)吸附到或填充多孔分離器的開口。申請(qǐng)人取得了驚人的發(fā)現(xiàn)，在一些實(shí)施方式，包含比過濾材料的小孔大的小孔的分離器促進(jìn)從脂肪組織和系統(tǒng)的第一室中去除液體。因此，在一些實(shí)施方式，分離器， 例如，分離篩330是一種多孔性物質(zhì)，其中，小孔具有比如上所述的過濾材料320大的直徑或尺寸。在一些實(shí)施方式中，分離器包括捕獲或吸走脂質(zhì)和/或液體的生物相容性材料。 例如，分離器，可以由聚酯、尼龍、人造絲、硝酸纖維素和醋酸纖維素制成。在一些實(shí)施方式中，分離器是由柔性材料制成，以及在一些實(shí)施方式，分離器由硬質(zhì)材料制成。優(yōu)選地，分離器由聚酯網(wǎng)，例如，具有ΙΟΟΟμπι的孔徑的聚酯網(wǎng)制成。圖3至圖13所示，系統(tǒng)300可以包括一個(gè)或多個(gè)允許將材料添加到系統(tǒng)或從系統(tǒng)中去除材料的端口。例如，如圖3、圖4、圖8和圖9所示的系統(tǒng)300有3個(gè)獨(dú)立的端口。端口 400和端口 500是與第一個(gè)子系統(tǒng)連通，例如，外殼310和過濾材料320之間的區(qū)域。端口 600與第二和/或第三子系統(tǒng)，例如，過濾材料320和分離篩330之間的區(qū)域和/或分離篩330和外殼340之間的區(qū)域連通。然而，在一些實(shí)施方式中，該系統(tǒng)可以包括只有一個(gè)端口，或只有兩個(gè)端口，例如，一個(gè)進(jìn)口和一個(gè)出口。在其他實(shí)施方式中，該系統(tǒng)可以包括多于三個(gè)端口，例如，4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多的端口。一般情況下，端口包括至少一個(gè)從外界延伸到系統(tǒng)或子系統(tǒng)的內(nèi)部或反之亦然的孔。該孔具有沿接頭處的氣密和水密封口。如下文進(jìn)一步描述的，在一些實(shí)施方式中，端口配置為與一個(gè)或多個(gè)連接器、導(dǎo)管、端口組件、適配器、帽或注射器連接。端口可以設(shè)置添加各種液體，例如清洗和沖洗液以及去除此類液體和污水的進(jìn)入點(diǎn)。優(yōu)選地，端口可以密封(例如，用閥)。在一些實(shí)施方式中，端口可以用夾子手動(dòng)密封。 在一些實(shí)施方式中，端口可以用帽密封。在一些實(shí)施方式中，端口包括自密封的閥，例如，提供液體或內(nèi)容物的單向流動(dòng)，但不是從系統(tǒng)內(nèi)室流出的變形的閥。在其他實(shí)施方式中，變形的閥提供雙向流動(dòng)。變形的閥可以由現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何變形的材料，如橡膠、氯丁橡膠、有機(jī)硅、聚氨酯等制成。在一些實(shí)施方式中，端口包括魯爾激活閥。在一些實(shí)施方式中， 端口位于當(dāng)豎直支撐系統(tǒng)時(shí)，一個(gè)或多個(gè)端口定位于下方使得液體和污水出口在與重力、 吸力或壓力的協(xié)助下排出的這樣的系統(tǒng)中。本發(fā)明的系統(tǒng)300也可以使用其他端口，例如， 排氣孔，向系統(tǒng)或子系統(tǒng)等添加材料或氣體的端口。系統(tǒng)或子系統(tǒng)上的端口可以配置為直接或間接(即通過適配器)與用來從源頭身體吸取脂肪物質(zhì)使得脂肪組織直接厭氧輸送到系統(tǒng)中的注射器或?qū)Ч荜P(guān)聯(lián)或連接。同樣， 導(dǎo)管或注射器可能連接到用于精制的組織的厭氧移植的端口。因此，在一些實(shí)施方式中，系統(tǒng)或子系統(tǒng)上的端口配置為直接或間接與一次性或可重復(fù)使用的注射器連接。例如，在一些實(shí)施方式中，端口配置為直接或間接與Icc注射器、2cc注射器、5cc注射器、IOcc注射器、20cc注射器、50cc注射器、60cc注射器、IOOcc注射器、250cc注射器等連接。在一些實(shí)施方式中，端口配置為直接或間接與具有大直流噴嘴的注射器例如Toomey注射器連接。在一些實(shí)施方式中，系統(tǒng)300包括組織進(jìn)入口組件700，以方便無菌遞送到第一室或子系統(tǒng)或從第一室或子系統(tǒng)去除內(nèi)容物(例如，脂肪組織)(參見例如，圖9)。示例性組織進(jìn)入口組件700在圖10和11更詳細(xì)地顯示。在一些實(shí)施方式中，組織進(jìn)入口組件包括大圓柱形內(nèi)孔開口 710。內(nèi)孔710的大尺寸方便遞送和去除組織進(jìn)入第一室?？勺冃蔚乃芰祥y720可提供防止材料通過開口 710進(jìn)入端口主體730的屏障?？勺冃蔚乃芰祥y720可配置為打開并且允許內(nèi)容物通過孔流入組織進(jìn)入口的主體730，通過插入其中的注射器尖端通向系統(tǒng)的第一室(未顯示)?？勺冃蔚乃芰祥y720在從閥上去除注射器尖端的情況下返回到關(guān)閉的默認(rèn)狀態(tài)，從而在不使用時(shí)封閉端口和阻塞任何內(nèi)容物(例如，組織或液體) 流出組織進(jìn)入口的主體。在一些實(shí)施方式，當(dāng)該端口不使用時(shí)，組織進(jìn)入口組件配置為連接帽740以提供額外的密封。示例性帽740的更詳細(xì)說明在圖12中顯示。在一些實(shí)施方式中，組織進(jìn)入口組件是從系統(tǒng)300上可拆卸的。在一些實(shí)施方式中，組織進(jìn)入口組件粘上或連接到系統(tǒng)300，例如通過如UV粘合劑等粘合劑。在一些實(shí)施中，組織進(jìn)入口組件可以配置為與適配器或連接器互相連接。在一些實(shí)施方式中，適配器或連接器配置為將注射器尖端連接到系統(tǒng)的端口。如上所述，通過舉例的方式，適配器如組織端口組件可以是整體的或可從端口拆卸的。在一些實(shí)施方式中，適配器或連接器包括魯爾連接器。在一些實(shí)施方式中，適配器或連接器包括包含可變形的閥的移動(dòng)適配器。在一些實(shí)施方式中，系統(tǒng)的端口可以包括，或配置為連接到不只一個(gè)流動(dòng)通道的組件，例如，Y形連接器等上。在一些實(shí)施方式中，Y形連接器配置為允許根據(jù)需要通過夾緊 Y形連接器的各自的腔或流動(dòng)通道阻塞一個(gè)或兩個(gè)流動(dòng)通道。在一些實(shí)施方式中，Y形連接器包括位于Y形連接器的公共以及各自的流動(dòng)通道的接合點(diǎn)的開關(guān)，該開關(guān)可以調(diào)整以使能根據(jù)需要同時(shí)流過每個(gè)各自的流道，一個(gè)流道，或者阻塞兩個(gè)流道。在一些實(shí)施方式中，該系統(tǒng)的端口，可以連接到導(dǎo)管或管，以使能液體溝通一個(gè)或多個(gè)系統(tǒng)或子系統(tǒng)，同時(shí)保持封閉的通道。例如，在一些實(shí)施方式中，系統(tǒng)300可以選擇包括一個(gè)廢物袋(未顯示)、廢物容器(未顯示)、廢導(dǎo)管(未顯示)和/或廢物箱(未顯示)。 在某些實(shí)施方式中，所有的子系統(tǒng)都彼此液體溝通。在其他實(shí)施方式中，子系統(tǒng)都不彼此液體溝通。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，一個(gè)子系統(tǒng)與其他兩個(gè)子系統(tǒng)封離，其中兩個(gè)子系統(tǒng)彼此液體溝通。優(yōu)選地，考慮到系統(tǒng)為任何尺寸或形狀和適應(yīng)各自不同的體積的，包括子系統(tǒng)的整個(gè)系統(tǒng)是柔性的?？蛇x擇地，整個(gè)系統(tǒng)、子系統(tǒng)和相關(guān)部件可以是剛性的?；蛘撸恍┳酉到y(tǒng)和相關(guān)部件可以是柔性，而其他子系統(tǒng)及相關(guān)部件可以是剛性的。圖13說明，包括與其他系統(tǒng)和子系統(tǒng)的液體連接的系統(tǒng)300-1的系統(tǒng)800的示例性實(shí)施方式。如圖13所示，端口 400-1和500-1可以分別連接到清洗液源810-1和廢物袋 820-1。系統(tǒng)300-1可以與類似的系統(tǒng)300-2連接，同時(shí)保持封閉的通道。脂肪組織是引入本文以上所述的系統(tǒng)300-1和300-2的第一室，例如，分別通過組織進(jìn)入/去除端口 600-1 和600-2。系統(tǒng)300-2的脂肪組織用于產(chǎn)生如上所述的干燥或脫水移植物。系統(tǒng)300-1的脂肪組織經(jīng)加工產(chǎn)生脂肪消化物或包括再生細(xì)胞的濃縮的脂肪來源細(xì)胞群。端口 500-1或替代端口(未顯示)可以連接到溶液源，例如，配置為將清洗液和/或酶無菌引入用于組織沖洗和消化的系統(tǒng)300-1的第二室的810-1。端口 400-1可以連接到廢物袋820-1。第一室300-1的脂肪消化物，通過連接端口 600-1和600-2同時(shí)保持封閉的系統(tǒng)的導(dǎo)管(未顯示)，可以無菌轉(zhuǎn)移到系統(tǒng)300-2的第一室內(nèi)的干燥或脫水的脂肪組織。本文所公開的系統(tǒng)可以產(chǎn)生與來由如離心和/或傳統(tǒng)的重力分離方法已加工的自同一受試者的同一位點(diǎn)的相同量的脂肪組織相比具有顯著降低的不良物質(zhì)，如紅細(xì)胞、 白細(xì)胞和脂質(zhì)的脂肪組織移植物和植入物。在一些實(shí)施方式中，使用本文公開的系統(tǒng)生產(chǎn)的脂肪組織移植物具有與從相同受試者相同位點(diǎn)已切除的并用離心的方法，例如，其中切除的組織是在一個(gè)固定角度離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)制備的等效單位的脂肪組織中存在的相比，至少約議、2乂、3乂、4乂、5乂、6乂、7乂、8乂、9乂、1(^(或在這個(gè)范圍之間任何數(shù))的較少的白血細(xì)胞。例如，在一些實(shí)施方式中，在本文所公開的系統(tǒng)中生產(chǎn)的脂肪組織移植物含有低于來自同一個(gè)體的等效單位脂肪組織中的白血細(xì)胞數(shù)量的75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或更少，或在此之間的任何％。在一些實(shí)施方式中，使用本文公開的系統(tǒng)生產(chǎn)的脂肪組織移植物具有與從相同受試者相同位點(diǎn)已切除的并用離心的方法，例如，其中切除的組織是在一個(gè)固定角度離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)制備的等效單位的脂肪組織中存在的相比，少至少約1X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、 9X、IOX(或在這個(gè)范圍之間任何數(shù))的紅細(xì)胞。例如，在一些實(shí)施方式中，在本文所公開的系統(tǒng)中生產(chǎn)的脂肪組織移植物含有低于來自同一個(gè)體的等效單位脂肪組織中的紅細(xì)胞數(shù)量的75 %、少于80 %、少于85 %、少于90 %、少于95 %或更少，或在此之間的任何％。在一些實(shí)施方式中，使用本文公開的系統(tǒng)生產(chǎn)的脂肪組織移植物具有與從相同受試者相同位點(diǎn)已切除的并用離心的方法，例如，其中切除的組織是在一個(gè)固定角度離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)制備的等效單位的脂肪組織中存在的相比，少至少約1X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、 9X、IOX(或在這個(gè)范圍之間任何數(shù))的脂質(zhì)。例如，在一些實(shí)施方式中，在本文所公開的系統(tǒng)中生產(chǎn)的脂肪組織移植物含有低于來自同一個(gè)體的等效單位脂肪組織中的脂質(zhì)數(shù)量的 75 %、少于80 %、少于85 %、少于90 %、少于95 %或更少，或在此之間的任何％。除了生產(chǎn)具有較少的不良成分的脂肪組織移植物的能力外，由本文公開的系統(tǒng)產(chǎn)生的移植物還可以展示出促進(jìn)與脂肪來源再生細(xì)胞的補(bǔ)充和/或植入物的保留的水合特性。具體來說，如本文所述制備的脂肪組織移植物的水合狀態(tài)比分離自同一受試者同一位點(diǎn)并且單獨(dú)使用重量分離法制備的等效單位脂肪組織移植物小的水合。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，然而，在一些實(shí)施方式中，可以設(shè)計(jì)具有不是由兩個(gè)不同的外殼密封在一起組成的而是一個(gè)無縫袋的柔性袋的系統(tǒng)。過濾器可密封，連接或粘貼在無縫袋內(nèi)，在袋的內(nèi)部限定第一個(gè)和第二個(gè)子系統(tǒng)或室。圖14顯示生產(chǎn)的補(bǔ)充、增強(qiáng)或強(qiáng)化的脂肪移植物或脂肪組織植入物的示例性的裝置100。圖14A顯示了包括至少兩個(gè)室20，30的罐10的透視圖。室20可用于從未加工的組織生產(chǎn)脂肪消化物。第二室30可用于接收和存儲(chǔ)未加工的脂肪組織以用作在產(chǎn)生補(bǔ)充的脂肪組織移植物中的脂肪移植物。在圖14中顯示的實(shí)施方式中，每個(gè)室20，30具有配置為接收未加工的脂肪組織的組織進(jìn)入端口 40，50。然而，應(yīng)當(dāng)理解在一些實(shí)施方式中，罐10僅具有一個(gè)組織進(jìn)入端口。 在一些實(shí)施方式中，組織進(jìn)入端口 40，50配置為可操作連接到插管(未顯示)，使得在抽脂術(shù)中脂肪來源細(xì)胞直接進(jìn)入到室20，30。例如，組織進(jìn)入端口 40，50可以經(jīng)由管子與插管(未顯示)連接限定組織排放管。在一些實(shí)施方式中，導(dǎo)管可以是整體的、一次性的抽脂手術(shù)插管，管子可以是柔性管子。插管可以標(biāo)注插入到受試者中從受試者中去除脂肪組織的大小。系統(tǒng)中所使用的管子可以能夠承受與抽吸輔助抽脂相關(guān)的負(fù)壓以減少倒塌的可能性。抽吸裝置(未顯示)，如注射器或電真空，除其他方面外，可以與罐10連接，并且配置為提供足夠的負(fù)壓以從受試者中吸出組織。罐10的室20，30可以物理上相互分離，使得室20 (例如，含有脂肪消化物的室) 的內(nèi)容物流動(dòng)到其他室30(例如，含脂肪移植物的室)受到控制。在一些實(shí)施方式中，室是在液體連接中，例如，通過可以封離的端口以確保只在需要的時(shí)候內(nèi)容物從一個(gè)室流動(dòng)到其他室。例如，在一些實(shí)施方式中，內(nèi)容物通過導(dǎo)管從一個(gè)室20流動(dòng)到另一個(gè)室30發(fā)生。 可選的導(dǎo)管可以包括一個(gè)或多個(gè)夾子(未顯示)，以控制系統(tǒng)的各個(gè)部件之間的物質(zhì)流動(dòng)。 夾子可以用來通過有效密封系統(tǒng)的不同區(qū)域而維持系統(tǒng)無菌?？蛇x擇地，可選的導(dǎo)管可以包括一個(gè)或多個(gè)控制通過系統(tǒng)的物質(zhì)流動(dòng)的閥。該閥可以為機(jī)電擠壓閥、氣動(dòng)閥、液壓閥或機(jī)械閥。在一些實(shí)施方式中，閥可以由可以與杠桿連接的控制系統(tǒng)激活或驅(qū)動(dòng)。杠桿可以手動(dòng)操縱和/或自動(dòng)操縱，例如，通過加工裝置在預(yù)定的激活條件下激活閥。在某些自動(dòng)化的實(shí)施方式中，閥的激活可以是部分自動(dòng)化的以及部分受制于用戶的喜好，使得這樣的過程可以是優(yōu)化的。在其他的實(shí)施方式中，某些閥可手動(dòng)地激活以及其他閥通過加工裝置自動(dòng)地激活。閥也可與一個(gè)或多個(gè)泵，如蠕動(dòng)泵或容積泵(未顯示)一起使用。導(dǎo)管和/或閥也可以包括能夠在流過該系統(tǒng)的各種液體組合物和液體水平之中區(qū)分的傳感器，如光學(xué)傳感器、超聲波傳感器、壓力傳感器等。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或兩個(gè)室可以包含一個(gè)或多個(gè)用于去除廢物(例如生理鹽水、成熟的脂肪細(xì)胞、紅細(xì)胞等)，添加成分(例如清洗液、酶、細(xì)胞等)或用于空氣進(jìn)入或放出的端口 60。在一些實(shí)施方式中，室30可以包括端口或配置為無菌去除補(bǔ)充的脂肪移植物的出口 70。出口 70結(jié)構(gòu)可以在適當(dāng)?shù)臈l件下傳遞來自室30的組合物(例如，補(bǔ)充的脂肪移植)到受試者。例如，在一些實(shí)施方式中，注射器可以用來取回組合物，并且出口 70 在不影響系統(tǒng)或組合物的無菌的情況下能夠容納注射器針頭。在另外的實(shí)施方式中，出口可以與配置為給予但不取回組合物的裝置連接，如施加正壓給予組合物的導(dǎo)管，以通過導(dǎo)管轉(zhuǎn)移組合物。因此，出口 70可以配置為允許室30包含的組合物傳遞到導(dǎo)管(未顯示)。 在其他實(shí)施方式中，出口 70可以包含或以封閉的系統(tǒng)方式連接到給予組合物的裝置，如注射器的針頭或通過施加正壓給予組合物的導(dǎo)管。在一些實(shí)施方式中，罐10的一個(gè)或兩個(gè)室20，30可配置為無菌接收溶液和試劑， 如清洗液(生理鹽水等)、分解劑或其他試劑或添加劑。該裝置可以配置為以無菌的方式保持他們的內(nèi)容物的容器，例如，可折疊的袋，如用在臨床環(huán)境中的IV袋。這些容器可以具有與一個(gè)或兩個(gè)室20，30相連接的導(dǎo)管。例如，可以將器件配置為保持沖洗或清洗劑(如 PBS,PLASMALYTE 、NORMOSO 或乳酸林格氏液)可以無菌傳遞到室20，30這樣的容器。在一些實(shí)施方式中，可以將裝置100配置為保持分解劑與罐10連接以遞送分解劑到室20內(nèi)部的這樣的容器。通過任何現(xiàn)有技術(shù)公認(rèn)的方式，包括施加到容器的外面的重力流壓力，或放置一個(gè)正排量泵到導(dǎo)管上，溶液和試劑可以遞送到罐的室20，30的內(nèi)部。在自動(dòng)化實(shí)施方式中，加工裝置在由用戶最初輸入的信息的基礎(chǔ)上計(jì)算各種參數(shù)，例如，鹽水的量和時(shí)間，或用于清洗所需的循環(huán)的時(shí)間和數(shù)量，以及分解劑的濃度或量和分解所需的時(shí)間
26(例如，正在加工的組織的量)。可選擇地，數(shù)量、時(shí)間等可以由用戶手動(dòng)操縱。在一些實(shí)施方式中，裝置配置為攪動(dòng)或搖動(dòng)罐的一個(gè)或兩個(gè)室。例如，在一些實(shí)施方式中，裝置包括在分解過程中配置為攪動(dòng)室20的內(nèi)容物的軌道運(yùn)動(dòng)平臺(tái)80。罐10的部件可以由與生物液體或組織非反應(yīng)活性的以及與在加工生物液體和組織中使用的試劑非反應(yīng)活性的材料制成。此外，制成各種部件的材料應(yīng)能承受滅菌，如通過高壓滅菌和輻射包括但不限于或Y射線輻射。在一些實(shí)施方式中，罐是由一次性材料制成。在一些實(shí)施方式中，罐由非一次性材料制成，其可以不只一次使用。通過舉例的方式， 管子和導(dǎo)管柄可以由任何合適的材料，如聚乙烯制成。導(dǎo)管可以是由不銹鋼制成。例如， 在一些實(shí)施方式中，罐是由丙烯酸聚碳酸酯、ABS、乙烯-醋酸乙烯，苯乙烯-丁二烯共聚物 (SBC)制成。優(yōu)選地，該裝置的液體通道是無發(fā)熱原的，即適合血液用途，沒有疾病傳輸危險(xiǎn)。在一些實(shí)施方式中，罐10由使用戶可以直觀地判斷存在室中的組織的近似量的材料制成。在一些實(shí)施方式中，該裝置包括一個(gè)或多個(gè)溫度控制裝置(未顯示)將其放置以調(diào)整系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)室20，30內(nèi)所含的物質(zhì)的溫度。溫度控制裝置可以是加熱器，冷卻器或兩者，即，它可以能在加熱器和冷卻器之間切換。溫度裝置可以調(diào)整通過裝置100的任何物質(zhì)的溫度，包括組織、分解劑、再懸浮劑、沖洗劑、清洗劑或添加劑。例如，加熱脂肪組織有利于分解而冷卻再生細(xì)胞輸出有望保持生活力。另外，如果需要預(yù)熱試劑以獲得最佳的組織加工，溫度裝置的作用將是保持預(yù)先確定的溫度，而不是增加或減少的溫度。在一些實(shí)施方式中，裝置100可以得以自動(dòng)化。在一些實(shí)施方式中，裝置100可以包括加工裝置(例如，微處理器或個(gè)人計(jì)算機(jī))和基于用戶輸入提供系統(tǒng)控制邏輯以運(yùn)行以及自動(dòng)化一個(gè)或多個(gè)加工步驟得相關(guān)的軟件程序。在某些實(shí)施方式中，通過存在在加工裝置中軟件，系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)方面可以是用戶可編程的。加工裝置可以具有一個(gè)或多個(gè)在只讀存儲(chǔ)器(ROM)中的預(yù)編程的軟件程序。例如，加工裝置中可以為加工血液定做的具有預(yù)編程的軟件，加工脂肪組織獲得少量的再生細(xì)胞的另一程序和加工脂肪組織獲得大量的再生細(xì)胞的另一個(gè)程序。加工裝置也可以具有預(yù)編程的軟件，其根據(jù)用戶輸入的相關(guān)信息，如所需的再生細(xì)胞的數(shù)量以及各種后加工操作等，給用戶提供適當(dāng)?shù)膮?shù)以優(yōu)化加工。在一些實(shí)施方式中，該軟件可以使步驟自動(dòng)化如通過控制系統(tǒng)的泵和閥，控制液體和組織沿特定導(dǎo)管通道進(jìn)入和外出；控制正確的順序和/或激活方向；用壓力傳感器檢測(cè)堵塞；混合機(jī)制，測(cè)量利用體積機(jī)制將沿著一個(gè)特定通道移動(dòng)的組織和/或液體的量；利用加熱控制裝置保持各個(gè)組合物的溫度；用時(shí)間和軟件機(jī)制整合分解過程。下面的例子用于展示這項(xiàng)技術(shù)可以得以應(yīng)用的特定的狀態(tài)和情況，并不是為了限制本發(fā)明的范圍和公開的內(nèi)容中所包含的權(quán)利要求。許多出版物和專利數(shù)已在上文中引用。每個(gè)出版物和專利以引用的方式全部并入本文中。下面的示例比較使用本文公開的系統(tǒng)獲得的脂肪組織移植物與由重力分離和離心生產(chǎn)的等效單位的脂肪組織移植物的純度和水合。實(shí)施例1從診所辦公室收集從10個(gè)人類受試者(N= 10)，通過吸脂(N = 5)、激光(N = 3) 或抽脂(Body-jet)收獲(N = 2)的方法吸出的脂肪組織。所述吸出的組織樣本被隨機(jī)分為四組⑴對(duì)照；⑵重力分離；⑶離心；⑷純移植* (PUREGRAFT )組織移植物制品。直接對(duì)對(duì)照樣品進(jìn)行了分析，沒有進(jìn)一步處理。在重力分離組中的樣品在60mL注射器放置 10分鐘。丟棄樣品的液體部分，對(duì)剩余的脂肪組織進(jìn)行分析。對(duì)于離心組，樣品裝入放置在 IEC固定角度轉(zhuǎn)子離心機(jī)內(nèi)的加帽的IOml注射器中以3000rpm(約1200g)離心3分鐘。在脂肪組織的頂部的游離的脂質(zhì)通過抽吸被去除，離心后下層物質(zhì)(infranatant)排出，對(duì)剩余的移植物組織進(jìn)行分析。PUREGRAFT 組樣品在本文上述的系統(tǒng)300(PUreGraftTM)中清洗。簡單地說，將組織引入如上所述的系統(tǒng)300的第一室。該組織用2X150ml乳酸林格氏液清洗。多余的液體和脂質(zhì)被允許從系統(tǒng)的第二室排出。干燥的組織通過組織進(jìn)入端口移出并用于結(jié)果分析。來自四組中的每個(gè)組的移植物組織隨后于15ml錐形管中一式三份，在400g下離心5分鐘，以將移植物分成四個(gè)成分游離脂質(zhì)、脂肪組織、液體和包含紅細(xì)胞和白細(xì)胞的細(xì)胞片狀沉淀物(pellet)。記錄并且按照總移植物組織的百分比計(jì)算脂質(zhì)層和液體層的量。每個(gè)樣品的脂質(zhì)層和液體層的量得以測(cè)量，并用于計(jì)算不同制品的液體含量和脂質(zhì)含量。如圖15所示，使用本文描述的方法和系統(tǒng)(PureGraft)制備的脂肪組織，當(dāng)與未加工的脂肪組織(對(duì)照)或由傳統(tǒng)的重力法(重力)加工的脂肪組織相比時(shí)，具有顯著降低的含水量。具體地，使用本發(fā)明的系統(tǒng)制備的組織的平均液體含量為9. 3士0.9%。這顯著(P <0. 001)低于重力分離制備的組織1 士 1.8%)。如圖16所示，使用本文所述的方法和系統(tǒng)(PureGraft)制備的脂肪組織具有比未加工的脂肪組織(對(duì)照)、由傳統(tǒng)的重力方法制備的脂肪組織(重力)和由傳統(tǒng)的離心法制備的脂肪組織(離心)顯著降低的脂質(zhì)的百分含量(V/V)。具體來說，與對(duì)照(未處理)組織(11.5 士 1.5%，P<0. 001)、重力分離 (8. 9士 1.3% P <0.001)以及離心(9. 6士 1.8%，p< 0.001)相比，使用本發(fā)明的系統(tǒng)制備的樣品中殘留的游離脂質(zhì)的水平平均為0. 8士0. 3%游離脂質(zhì)。需要注意的是，在開始制備移植物的過程中觀察到的游離脂質(zhì)去除之后，測(cè)量在由離心制備的移植物中觀察到的游離脂質(zhì)含量(移植物量的平均9.6%)。也就是說，將移植物分離成其多個(gè)組成部分后明顯的游離脂質(zhì)是新釋放的。這表明，離心制備的移植材料包含受損的脂肪細(xì)胞，所述脂肪細(xì)胞在將第二個(gè)離心應(yīng)用于將移植物分離成它的四個(gè)組成部分的過程中釋放它們的脂質(zhì)。將相同的第二個(gè)離心步驟應(yīng)用到本發(fā)明的系統(tǒng)制備的移植物釋放明顯較少的游離脂質(zhì)(與9. 6% 相比0.8%的量)的事實(shí)表明在本發(fā)明的系統(tǒng)中制備的移植物包含較少的受損的脂肪細(xì)胞。為評(píng)估移植物的純度，來自每個(gè)組織移植物的樣品從管中移出，通過用庫爾特計(jì)數(shù)器(Coulter counter)計(jì)數(shù)每克組織的紅細(xì)胞和白細(xì)胞來分析血液內(nèi)容物。所得數(shù)據(jù)與對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化，表示為每克未加工的移植物組織的RBC或WBC含量的相對(duì)百分比。所有數(shù)據(jù)均表示為平均士標(biāo)準(zhǔn)誤差均值(SEM)。研究者t檢驗(yàn)用來比較每個(gè)移植物的制備方法之間的差異。如圖17所示的數(shù)據(jù)表明，與未加工的脂肪組織(對(duì)照)、由傳統(tǒng)的重力制備方法制備的脂肪組織(重力)和由傳統(tǒng)的離心法(離心)制備的脂肪組織相比，使用本文所公開的方法和系統(tǒng)(PureGraft)制備的脂肪組織具有每克組織顯著少的紅血細(xì)胞(紅細(xì)胞(RBC))。因此，使用本發(fā)明的系統(tǒng)的制備從移植物去除98. 1 士0. 01%的紅細(xì)胞，而在重力分離和離心分別去除47. 8 士 7. 0%和53. 2 士 5. 4%的紅細(xì)胞。同樣，通過重力白細(xì)胞含量減少了 58. 7 士 13. 7 %，通過離心白細(xì)胞含量減少了 69. 7 士 5. 2%以及使用本發(fā)明的系統(tǒng)白細(xì)胞含量減少了 96. 80士0.01%。
水、脂質(zhì)/成熟的脂肪細(xì)胞和血細(xì)胞的存在能導(dǎo)致移植體積隨著時(shí)間的損失。在圖15-圖17中顯示的數(shù)據(jù)表明本文所述的系統(tǒng)對(duì)干燥或脫水的脂肪組織移植物或植入物的制備是有用的。下面的實(shí)施例描述通過本文所述的方法生產(chǎn)脂肪組織植入物或以脂肪來源再生細(xì)胞補(bǔ)充的移植物。實(shí)施例2需要或想要乳房植入物的患者經(jīng)鑒定或選擇。從患者中移出單位脂肪組織，并且將單位脂肪組織提供給脂肪來源干細(xì)胞加工單元，優(yōu)選地，該單元保持封閉的、無菌液體/ 組織通道。例如，插管(cannula)連接到脂肪來源干細(xì)胞加工單元的組織收集容器或室(例如，柔性袋)，同時(shí)保持無菌的液體/組織通道。抽脂術(shù)通過已建立的技術(shù)進(jìn)行，從受試者中移出脂肪組織，并且被移出的未加工的脂肪組織被引入到組織收集容器/室。脂肪組織的第一部分用PBS沖洗，直到基本上所有的生理鹽水、紅細(xì)胞、成熟的脂肪細(xì)胞得以去除(例如，連續(xù)清洗直到該組織不再是看得見的紅色)，以及將清洗污水-廢物，例如生理鹽水、紅血細(xì)胞、成熟的脂肪細(xì)胞通過連接到組織收集容器或室同時(shí)保持封閉的無菌液體/組織通道的端口而無菌去除。在一些實(shí)施方式中，廢物端口由管道(conduit)連接到廢物收集容器，所述廢物收集容器可配置為連接到真空源，管道(conduit)和/或廢物收集容器可以包含一個(gè)或多個(gè)閥。然后沖洗后的脂肪組織的第一部分可以存儲(chǔ)在組織收集容器/室或轉(zhuǎn)移到進(jìn)一步加工的儲(chǔ)存容器或室。如上所述，在第二室中單位脂肪組織的第二部分用磷酸緩沖液(PBQ沖洗直到所述組織不再是看得見的紅色。可選擇地，如上所述由抽脂術(shù)獲得的脂肪組織經(jīng)沖洗和清洗，然后分割成第一和第二部分。第一部分被保留作為用于添加脂肪來源再生細(xì)胞的基質(zhì)使用，并且第二部分是用來產(chǎn)生如下的脂肪來源再生細(xì)胞的懸浮液。包括膠原蛋白酶的酶溶液無菌添加到所述組織的第二部分，同時(shí)保持封閉的無菌液體/組織通道。所述組織在 37°C經(jīng)振蕩培養(yǎng)約1小時(shí)。允許混合物沉淀，以致脂肪消化物/脂肪來源再生細(xì)胞溶液與未消化的脂肪組織和脂質(zhì)物理分離。產(chǎn)生的脂肪消化物從脂肪組織的第二部分通過管道 (conduit)移出，同時(shí)保持封閉的、無菌的液體/組織通道。然后，分離的脂肪消化物通過管道(conduit)被泵送，所述管道通過封閉的通路與第一室相連。所述脂肪消化物在第一室的未加工的脂肪組織的第一部分之上或穿過所述第一部分被泵送。所述脂肪消化物的非細(xì)胞成分流過未加工的脂肪組織的第一部分進(jìn)入廢物容器中，同時(shí)保持封閉的無菌液體/組織通道。利用重力或真空源脂肪消化物可以通過未加工的脂肪組織的第一部分得到過濾。在一些實(shí)施方式中，所述脂肪消化物可以在未加工的脂肪組織的第一部分的上面得以分層，所述脂肪消化物中存在的脂肪來源再生細(xì)胞利用離心可以被迫進(jìn)入未加工的脂肪組織的第一部分的基質(zhì)中(例如，在100、200、300、400、 500、600、700或800g下旋轉(zhuǎn)桶離心)。所述脂肪消化物的脂肪來源再生細(xì)胞由結(jié)締組織片段結(jié)合，產(chǎn)生以脂肪來源再生細(xì)胞補(bǔ)充的脂肪移植物。然后補(bǔ)充或強(qiáng)化的脂肪移植物可以以或不以具有人類乳房的形狀的可吸收的外殼或膠囊材料提供給受試者。實(shí)施例3制備如實(shí)施例1所述的以脂肪來源再生細(xì)胞補(bǔ)充的脂肪移植物。以脂肪來源再生細(xì)胞補(bǔ)充的脂肪移植物給予受試者的面部、臀部、胸部或小腿(calves)，或糾正任何軟組織缺陷。實(shí)施例4需要或想要脂肪移植物的患者經(jīng)鑒定或選擇。從如本文所述的或本領(lǐng)域已知的患者去除單位脂肪組織。為了優(yōu)化移植物，系統(tǒng)300經(jīng)定向并且連接到系統(tǒng)的廢物袋(未顯示)放在地板上。脂肪組織通過組織進(jìn)入端口 600引入系統(tǒng)300，所述組織進(jìn)入端口 600 提供外部環(huán)境和第一個(gè)子系統(tǒng)內(nèi)部之間的傳遞?？梢允褂肨oomey或其他本領(lǐng)域工人的注射器通過該端口注入脂源細(xì)胞(lipoaspirate)。這可以重復(fù)直到已經(jīng)添加的組織所需的量-注意不要超過第一個(gè)子系統(tǒng)的最大量。一旦脂源細(xì)胞已添加，排放管上的彈簧節(jié)流夾 (未顯示)關(guān)閉。通過打開輪固定夾(wheel clamp)(未顯示)經(jīng)由端口或經(jīng)由無菌IV管將清洗和/或沖洗溶液如乳酸林格溶液或生理鹽水引入系統(tǒng)300。添加的清洗或沖洗溶液的量可以變化。通常，將足夠的清洗液引入系統(tǒng)以致將第一個(gè)子系統(tǒng)中的脂源細(xì)胞的大多數(shù)或其他組織淹沒。添加150ml清洗液，如乳酸林格溶液。接著，關(guān)閉所述輪固定夾，并且在短的時(shí)間內(nèi)如15秒手動(dòng)搖動(dòng)。搖動(dòng)可以以倒置、旋轉(zhuǎn)、振動(dòng)等形式，該系統(tǒng)由外部工具， 如振動(dòng)平臺(tái)或定軌振蕩器等搖動(dòng)。所述組織經(jīng)過徹底清洗后(如通過觀察或預(yù)確定的時(shí)間間隔確定)，打開排水夾管閥(未顯示)或端口，在重力下，廢水通過過濾材料320和分離篩330。所述廢水允許排出一段時(shí)間，例如，3分鐘。所述循環(huán)可以重復(fù)多次。該循環(huán)可以重復(fù)共四次的清洗。在最后的清洗循環(huán)后，廢物應(yīng)允許排出5至10分鐘。一般來說，廢液的最大排出發(fā)生在排水約10分鐘后。因此，基本上沒有血、腫脹液和游離脂質(zhì)的更干燥的清洗后的脂肪移植物得以產(chǎn)生，沒有對(duì)機(jī)械設(shè)備的要求在封閉的無菌系統(tǒng)中易于操作。此夕卜，這個(gè)過程可以在像20分鐘這樣少的時(shí)間內(nèi)完成，并且外科醫(yī)生可以通過改變時(shí)間的長短控制所需的水合水平，在最后一步該系統(tǒng)允許排放。如果需要富集通過使用系統(tǒng)300獲得的具有脂肪來源再生細(xì)胞(ADRCs)的脂肪移植物，通過本文所述的或現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法(如使用CELUTI 系統(tǒng))獲得的 ADRC，可以通過靠近乳酸鈉林格袋的端口添加，并且用乳酸鈉林格溶液或其他合適的溶液驅(qū)趕5秒或者5秒以上。如本文所述，然后所述系統(tǒng)可以搖動(dòng)，例如15秒，然后將ADRC增強(qiáng)的脂肪移植物根據(jù)需要可以注入或放回至患者中。等同本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到或者能夠確定使用僅僅常規(guī)實(shí)驗(yàn)，許多本文所述的發(fā)明的具體實(shí)施方式
的等同。這樣的等同意圖為由下列權(quán)利要求包括。
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權(quán)利要求
1.用于制備用于脂肪組織移植物的組織的裝置，其包含具有第一室和第二室的柔性可折疊袋，所述第一室和第二室由包括小孔的過濾器來限定；位于所述第二室內(nèi)的分離器；連接到柔性可折疊袋的進(jìn)口，其中，所述進(jìn)口配置為允許將脂肪組織無菌引入所述第一室；以及連接到柔性可折疊袋的出口，其中，所述出口配置為從所述第二室中無菌去除液體和細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述分離器為在所述第二室中自由浮動(dòng)的多孔結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述分離器為在所述第二室中限定第三室的多孔結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述袋包含由雙熱封口連接的第一外殼和第二外殼。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述過濾器由雙熱封口連接到第一外殼和第二外殼。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述分離器包含脂質(zhì)芯吸材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其中，所述脂質(zhì)芯吸材料為聚酯網(wǎng)篩。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述分離器包含大于所述過濾器的小孔的多個(gè)小孔。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其中，所述第二過濾器的孔徑是所述過濾器的孔徑的約5、6、7、8、9或10倍或者大于所述過濾器孔徑的約5、6、7、8、9或10倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述過濾器的孔徑大于或等于約 30 μ m0
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述過濾器的孔徑為在約30μ m至約200 μ m之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述分離器包含小孔，并且其中所述分離器的孔徑為在約300 μ m至2000 μ m之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述進(jìn)口配置為與適配器可拆連接，所述適配器配置為與注射筒的尖端可拆連接。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的裝置，其中，所述進(jìn)口配置為允許物質(zhì)進(jìn)入所述端口，但不允許物質(zhì)從所述端口排出。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，其中，所述進(jìn)口包括可變形的塑料閥。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的裝置，其中，所述注射筒是60mL導(dǎo)管注射筒。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述進(jìn)口配置為與插管連接，同時(shí)保持無菌液體/組織通道。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的裝置，進(jìn)一步包含第二裝置，所述第二裝置包含與所述裝置連接的脂肪來源再生細(xì)胞的分離裝置。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的裝置，其中，所述第二裝置包含權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的裝置。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的裝置，其中，所述第二裝置通過管道與權(quán)利要求1-17所述的裝置連接，所述管道配置為將自所述第二裝置分離的脂肪來源再生細(xì)胞轉(zhuǎn)移到權(quán)利要求 1-17所述的裝置的第一室中。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的裝置，其中，所述管道包含Y形連接。
22.脂肪組織移植物的制造方法，其包括(a)獲得未加工的脂肪組織的第一部分；(b)將所述未加工的脂肪組織的第一部分引入權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的第一裝置的第一室中；(c)通過添加生理清洗溶液到第一室沖洗所述未加工的脂肪組織的第一部分；以及(d)從所述第一裝置的第二室去除液體從而干燥脂肪組織，其中所述液體選自由水、生理清洗液、血液和游離脂質(zhì)或它們的任意組合所組成的組中。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述生理溶液選自由乳酸林格氏液、哈特曼氏溶液、生理鹽水和PLASMALYTE 溶液所組成的組中。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述(c)的干燥的脂肪組織被脫水到小于引入步驟前所述未加工的脂肪組織的第一部分的液體含量的約1/2、1/3或1/4倍。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述(c)的干燥的脂肪組織被脫水到小于引入步驟前所述未加工的脂肪組織的第一部分的液體含量的約1/3。
26.根據(jù)權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括從脂肪組織的第二部分分離脂肪來源再生細(xì)胞群以及將(d)的脫水的脂肪組織與分離的脂肪來源再生細(xì)胞群在允許所述分離的脂肪來源再生細(xì)胞群滲入所述(d)的脫水的脂肪組織中的條件下相接觸。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中，所述分離的脂肪來源再生細(xì)胞群在接觸所述 (c)的脫水的脂肪組織之前沒有經(jīng)過離心。
28.根據(jù)權(quán)利要求沈-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述分離的脂肪來源再生細(xì)胞群在權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的第二裝置中，通過與帶有膠原蛋白酶的所述第二裝置的第一室中存在的脂肪組織在釋放所述細(xì)胞的條件下接觸得以制備。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中，所述接觸步驟在與所述第一裝置連接的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的第二裝置中進(jìn)行。
全文摘要
本文公開了用于將來自細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃縮到未加工的組織(例如脂肪組織)中的方法和系統(tǒng)。本文還公開了優(yōu)化組織和細(xì)胞富集的移植物的水合的系統(tǒng)。
文檔編號(hào)A61F2/02GK102458302SQ201080029915
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月1日
發(fā)明者盧卡斯·福爾納斯, 阿爾文·彼得森 申請(qǐng)人:再生醫(yī)療技術(shù)公司