一種豬體細(xì)胞核移植融合方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及克隆技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種豬體細(xì)胞核移植融合方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1997年克隆羊--"Dolly"出生，開(kāi)啟了動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)的新篇章。隨后多 種哺乳動(dòng)物如牛、小鼠、山羊、豬、兔等被相繼克隆成功。體細(xì)胞核移植技術(shù)即克隆技術(shù)，通 常是通過(guò)顯微操作的方法將受體卵母細(xì)胞的細(xì)胞核去除，然后將供體細(xì)胞注入到已去核的 卵母細(xì)胞內(nèi)，形成一個(gè)新的重構(gòu)胚，再通過(guò)融合技術(shù)將重構(gòu)胚的供體細(xì)胞核導(dǎo)入到去核卵 母細(xì)胞胞質(zhì)中，使移入的核在受體胞質(zhì)的作用下激活發(fā)生發(fā)育程序重編，使得重構(gòu)胚能與 正常受精胚一樣細(xì)胞分裂、分化，經(jīng)過(guò)手術(shù)移植到代孕母體內(nèi)發(fā)育成一個(gè)新的個(gè)體，其獲得 的個(gè)體與親本具有相同遺傳性狀。從第一例克隆豬的nishi，2002)誕生至今已有13年，但 是整體效率依然沒(méi)有突破只有1% -2%。如何提高整體的克隆效率，許多實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了大 量的研究，包括提高卵母細(xì)胞質(zhì)量、融合激活方法與參數(shù)研究、供體細(xì)胞處理、胚胎處理、移 植方法等。
[0003] 將供體細(xì)胞的細(xì)胞核導(dǎo)入到卵母細(xì)胞質(zhì)中，運(yùn)個(gè)過(guò)程稱(chēng)之為融合。如果沒(méi)有細(xì)胞 融合技術(shù)，著名的克隆羊一"Dolly"可能就無(wú)法誕生。最早使用的融合技術(shù)是使用滅活的 仙臺(tái)病毒（HVJ) (McGrath and Solter，1983)介導(dǎo)細(xì)胞融合，獲得了成功，但是效果很不穩(wěn) 定而且毒性大。Willadsen等（1986)在利用胚胎細(xì)胞克隆羊試驗(yàn)中采用的是直流電介導(dǎo) 融合的方法，簡(jiǎn)便而且高效，電融合技術(shù)也是從運(yùn)個(gè)時(shí)候開(kāi)始發(fā)展起來(lái)的，其原理是通過(guò)電 流的刺激使緊密接觸的細(xì)胞膜憐脂雙分子層發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而形成細(xì)胞間的孔道，隨著 孔道逐漸擴(kuò)大使胞質(zhì)交融在一起?？寺⊙?Dolly"就是運(yùn)用電融合技術(shù)，目前已經(jīng)成為動(dòng) 物克隆中普遍采用的融合方法。若融合率越高，操作速度越快，單位時(shí)間生產(chǎn)的胚胎數(shù)就越 多，體細(xì)胞核移植效率也就相應(yīng)的提高了。
[0004] 然而，由于技術(shù)操作上的差異、融合激活參數(shù)、供體細(xì)胞類(lèi)型和操作人員熟練程度 等因素導(dǎo)致融合率不穩(wěn)定，是影響克隆效率的因素之一。由于是在體視顯微鏡下直接操作， 受到視野范圍大小的影響，在保證可W看見(jiàn)體細(xì)胞的情況下盡可能多操作一些。在實(shí)際操 作過(guò)程中普遍的操作是：將一批重構(gòu)胚5~10個(gè)成一條直線放入融合槽內(nèi)后（圖1)，使供 體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行后即施加直流電脈沖誘導(dǎo)融合。一次性操作數(shù)量 較少，會(huì)影響到整體的融合速度。特別對(duì)于豬而言，每次需要移植300左右的重構(gòu)胚，才能 有效維持豬的妊娠。一次性操作運(yùn)么多胚胎，體外融合速度就成了很重要的影響因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，為了克服現(xiàn)有豬體細(xì)胞核移植融合操作過(guò)程中， 一次性操作數(shù)量少，整體融合速度慢的缺點(diǎn)，提供一種豬體細(xì)胞核移植融合方法。
[0006] 本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問(wèn)題，通過(guò)W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)：
[0007] 一種豬體細(xì)胞核移植融合方法，包含如下步驟：
[0008] SI.將構(gòu)建好的重構(gòu)胚放入融合液中平衡，然后用融合液洗涂，再放入鋪滿融合液 的融合槽中；
[0009] S2.撥動(dòng)重構(gòu)胚，使供體細(xì)胞與受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行放置，同時(shí)使重構(gòu) 胚在融合槽中成非直線排列；
[0010] S3.用細(xì)胞融合儀施加直流電脈沖誘導(dǎo)融合并同時(shí)激活，
[0011] S4.接著用胚胎培養(yǎng)液洗涂，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再在體視顯微鏡下判定融合 情況。
[0012] 本發(fā)明的方法在進(jìn)行融合操作時(shí)，使供體細(xì)胞與受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行 同時(shí)使重構(gòu)胚在融合槽中成曲線排列（圖2)，然后施加直流電脈沖誘導(dǎo)融合，在同樣的視 野下可W增加一次性操作的數(shù)量，提高整體融合速度而不會(huì)影響克隆胚胎的后期發(fā)育。 陽(yáng)01；3] 優(yōu)選地，S1.所述的融合液的含有0. 25mol/L甘露醇（MannitoD、0.1 mmol/L 化(：12'2&0、0.1111111〇1/11邑(：12.6&0、0.5111111〇1/14-徑乙基贓嗦乙橫酸化6陽(yáng)巧、0.01%聚 乙締醇（PVA) (w/v)。
[0014] 優(yōu)選地，S1.中平衡所用的時(shí)間為1~5min，用融合液洗涂的次數(shù)為2~5次。
[0015] 優(yōu)選地，S2.所述的非直線排列為曲線排列。
[0016] 優(yōu)選地，S3.中所述的細(xì)胞融合儀的型號(hào)為化S-150B融合儀。
[0017] 優(yōu)選地，S3.中所述的直流電脈沖80-100v/mm，80-100 y S，脈沖次數(shù)為2~3次。
[0018] 優(yōu)選地，S4.中所述的胚胎培養(yǎng)液為PZM-3培養(yǎng)液。
[0019] 優(yōu)選地，S4.中置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的條件為39°C，5% C02,飽和濕度，培養(yǎng)地。
[0020] 有益效果：（1)本發(fā)明克服了現(xiàn)有豬體細(xì)胞核移植操融合操作過(guò)程中，一次性操 作數(shù)量少，整體融合速度慢的缺點(diǎn)，提供了一種新的豬體細(xì)胞核移植融合方法；（2)本發(fā)明 所述的豬體細(xì)胞核移植融合方法一次性可W操作融合15~20個(gè)重構(gòu)胚，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù) 一次性只能操作5~10個(gè)重構(gòu)胚而言，大幅度提升了融合效率。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為重構(gòu)胚呈直線排列的豬體細(xì)胞核移植融合方法圖。
[0022] 圖2為重構(gòu)胚呈曲線排列的豬體細(xì)胞核移植融合方法圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] W下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例對(duì)本發(fā)明不做任何形式的限 定。
[0024] 實(shí)驗(yàn)研究所用試劑未經(jīng)特殊說(shuō)明均購(gòu)自SIGMA公司。胎牛血清（GIBC0)，生理鹽 水（紫光古漢集團(tuán)衡陽(yáng)制藥有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材為Corning公司產(chǎn)品；卵母細(xì) 胞成熟及細(xì)胞、胚胎培養(yǎng)耗材為NUNC公司產(chǎn)品。洗卵液為DPBS+PVA液，操作液為無(wú)巧的 H-NCSU-23，卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液為添加體積分?jǐn)?shù)10%豬卵泡液的TCM-199液，胚胎培養(yǎng)液 為PZM-3。按照常規(guī)的體細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建克隆胚胎。 陽(yáng)〇2引實(shí)施例1
[0026] 1、卵母細(xì)胞收集及體外成熟培養(yǎng)
[0027] 豬卵巢采至廣州天河屠宰場(chǎng)，用剪刀去除輸卵管等組織后將卵巢置于含抗生素的 37 °C生理鹽水中，用保溫瓶化內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用含抗生素