專利名稱：腫大細胞病毒vsocs基因缺失減毒活疫苗及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種腫大細胞病毒KSO^基因缺失減毒活疫 苗及其制備方法和應用。
背景技術：
我國是世界海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)大國，養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量居世界第一。但是，隨著養(yǎng)殖品種 的增多和養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，各種養(yǎng)殖品種每年發(fā)病率均在50%以上，而死亡率高達20%以 上，直接造成的經(jīng)濟損失每年超過百億元人民幣。病害已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的主 要障礙。腫大細胞病毒是新近出現(xiàn)的對魚類具有重大危害作用的惡性傳染病的病原，分 子流行病學研究發(fā)現(xiàn)，有50多種的海水魚類和近10種的淡水魚類是這種病毒的攜帶者。 腫大細胞病毒對世界各國，特別是東亞、東南亞及澳大利亞等國家和地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)構 成巨大威脅，每年都能造成重大經(jīng)濟損失。目前，腫大細胞病毒的主要毒株有流行于于中 國大陸的鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)、斜帶石斑魚虹彩病毒(0SGIV)、大黃魚虹彩病毒 (LYCIV)、大菱鲆紅體病虹彩病毒(TRBIV)、斑石鯛虹彩病毒(SKIV)；流行于日本的真鯛虹彩 病毒(RSIV)、石斑魚昏睡病虹彩病毒(GSDIV)、非洲燈籠魚虹彩病毒(ALIV)和閃電麗魚虹 彩病毒(DGIV)；流行于韓國的條石鯛虹彩病毒(RBIV)、牙鲆虹彩病毒(FLIV)、大菱鲆虹彩 病毒(TBIV)；流行于中國臺灣的真鯛虹彩病毒和臺灣石斑魚虹彩病毒(TGIV)；出現(xiàn)在新加 坡的鯔魚和虎斑虹彩病毒及流行于澳大利亞的巨鱈銀鱸虹彩病毒(MCIV)和麗麗魚虹彩病 毒(DGIV)等。腫大細胞病毒的宿主覆蓋了眾多具有重大經(jīng)濟價值的養(yǎng)殖魚類，對腫大細胞 病毒所引發(fā)的系列魚病的控制成為有關國家的共識。開展免疫防治是控制腫大細胞病毒流行和危害的有效手段。國際上，日本借助 RSIV的高敏感細胞系GF (石鱸鰭條細胞系)研制的RSIV全細胞滅活疫苗成功實現(xiàn)了商業(yè) 化生產(chǎn)，已經(jīng)比較廣泛地應用于真鯛等海水養(yǎng)殖魚類。RSIV滅活苗也曾經(jīng)出口到我國廣 東及海南等沿海養(yǎng)殖區(qū)，在一些名貴海水養(yǎng)殖魚類(石斑魚，真鯛)中有所應用，總體效果不 錯。但由于價格偏貴(注射免疫，約1元/尾)，注射免疫耗時耗力等不利因素的影響，日本 進口的RSIV滅活苗在我國的應用比較有限。此外，由于滅活疫苗存在免疫期短、保護力低、 用量大以及通常需要加入佐劑，并缺乏自然感染的局部免疫保護的因素限制了該類疫苗的 發(fā)展。因此，開發(fā)新型的漁用基因工程疫苗成為當前水產(chǎn)病害控制的首要問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種腫大細胞病毒基因缺失活疫苗， 該疫苗可以通過水體浸泡的方法用于魚類腫大細胞病毒的預防，大大降低水產(chǎn)業(yè)病毒性疾 病的發(fā)病率和操作成本。本發(fā)明的另一個目的是提供上述腫大細胞病毒疫苗的制備方法，該制備方法簡單，成本低，有利于大規(guī)模推廣應用。本發(fā)明的另一個目的是提供上述腫大細胞病毒疫苗在魚類腫大細胞病毒預防中 的應用。本發(fā)明的上述目的通過以下方案予以實現(xiàn)
一種腫大細胞病毒KSO^基因缺失減毒活疫苗，該疫苗是通過在魚類細胞中通過基因 工程技術將外源GFP基因替代腫大細胞病毒的KS0^基因而得到的重組KS0C1S基因缺失病 毒，收獲病毒液并稀釋后得到的。上述腫大細胞病毒減毒活疫苗的制備方法，其具體步驟如下
(1)重組KSOC1S基因缺失病毒轉(zhuǎn)移載體的構建(圖1):通過PCR擴增KSOC1S基因在ISKNV 基因組上下游各約IOOObp的DNA片段，分別插入同一個克隆載體pUC18中；通過雙酶切真 核表達載體PEGFP-C3，獲得含CMV啟動子的綠色熒光蛋白GFP真核表達框，插入上述pUC18 載體的KSO^基因上下游片段之間，該克隆載體為KSO^基因缺失病毒轉(zhuǎn)移載體；
(2)細胞的制備將魚類細胞系經(jīng)酶消化分散后，進行細胞培養(yǎng)成片，用于接種腫大細 胞病毒；
(3)重組vsocs基因缺失病毒的接種和培養(yǎng)上述魚類細胞培養(yǎng)成片后，吸出培養(yǎng)瓶中 的培養(yǎng)基，然后加入重組vsocs基因缺失病毒液，進行病毒吸附；病毒吸附結束后，吸出感 染上清，加入細胞維持液，再次進行細胞培養(yǎng)，至細胞出現(xiàn)明顯病變?yōu)橹梗?br> (4)重組KSO^基因缺失病毒液的收集、稀釋和保存將上述病變的細胞經(jīng)三次凍融 后，收獲病毒液，經(jīng)0. 22 μ m濾器過濾后，稀釋于PBS溶液中，分裝并保存于-80°C冰箱中，即 得腫大病毒KSO^基因缺失減毒活疫苗成品；
(5)減毒活疫苗的使用將上述重組KSOC1S基因缺失病毒液以1:2，000-1100, 000的 不同濃度稀釋于水體中，即可通過浸泡感染的途徑對魚體進行免疫。上述步驟(1)中，病毒缺失基因為vsocs基因(如ISKNV 0RF103及其同源基因)。上述步驟(2)中，消化時可用胰酶，細胞培養(yǎng)成片時可采用DMEM完全培養(yǎng)液中 27°C培養(yǎng)。上述步驟(3)中，病毒吸附可以選擇在27°C的溫度下吸附1小時，細胞維持液可選 擇采用添加有10%FBS的DMEM。本發(fā)明的FBS (胎牛血清)和DMEM均為本領域通用試劑，市
佳口。上述步驟(4)中，用于稀釋病毒滅活液的鹽類緩沖液可以選擇無菌磷酸鹽緩沖液， 稀釋倍數(shù)為10倍。上述步驟(5)中，稀釋后的病毒液與浸泡水體的體積比為1 2，000-1 100，000。
魚體浸泡免疫時間為2、h，帶浸泡免疫后的魚體即可放回養(yǎng)殖池。本發(fā)明的腫大細胞病毒疫苗可用于預防海魚類、淡水魚類的腫大細胞病毒感染。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1.本發(fā)明的腫大細胞病毒疫苗對魚類預防腫大細胞病毒感染的保護作用可達80%；
2.本發(fā)明的疫苗本身不含對人類有害的成分，對注射疫苗的魚類可以安全食用；
3.疫苗本身對魚類生長沒有影響，在保證水環(huán)境和飼料的情況下，被注射有疫苗的魚 類生長狀況良好；
4.避免了傳統(tǒng)減毒疫苗的返祖而重新獲得毒力；5.免疫力持續(xù)時間長達半年以上；
6.可通過水體浸泡免疫，操作簡單、節(jié)省各種人工費用；
7.本發(fā)明的疫苗制備方法簡單，所用試劑成本低，有利于大規(guī)模推廣；
8.本發(fā)明的疫苗本身不易失效，普通冰箱4°C放置一周仍有效。


圖1為重組vSOCS基因的轉(zhuǎn)移載體構建流程；
圖2為減毒活疫苗組、陰性對照組和病毒組三組魚在免疫期間的死亡情況。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步具體說明。應理解，這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1 腫大細胞病毒重組轉(zhuǎn)移載體的構建
本實施例的選取ISKNV基因作為研究對象，利用病毒在細胞內(nèi)復制過程中的同
源重組原理，將外源GFP基因替代KSOC1S基因，從而獲得重組KSOC1S基因缺失的ISKNV。本實施例腫大細胞病毒重組轉(zhuǎn)移載體的構建，包括如下步驟
(1)通過PCR擴增KSOC1S基因在ISKNV基因組上下游各約IOOObp的DNA片段，分別插 入同一個克隆載體PUC18中；
(2)通過雙酶切真核表達載體PEGFP-C3，獲得含CMV啟動子的綠色熒光蛋白GFP真核 表達框，插入上述PUC18載體的MOM基因上下游片段之間，該克隆載體為MOM基因缺失 病毒轉(zhuǎn)移載體。實施例2腫大細胞病毒減毒活疫苗的制備
本實施例的生物材料選擇鱖魚，病毒選擇重組vsocs基因缺失ISKNV病毒。本實施例腫大細胞病毒疫苗的制備方法，包括如下步驟
(1)細胞的制備將鱖仔魚細胞系(MMF-1)用胰酶消化分散，加入DMEM完全培養(yǎng)液在 27°C培養(yǎng)成片，用于接種重組Ksoa基因缺失ISKNV病毒；
(2)病毒接種和培養(yǎng)將上述MMF-I細胞培養(yǎng)成片后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，然后加 入實施例1所述的重組Ksoa基因缺失病毒液，置27°C約1 h進行病毒吸附。后吸出感染 上清，加入細胞維持液(含10% FBS的DMEM)，再置于27°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約72 h，至細 胞出現(xiàn)明顯病變?yōu)橹梗?br> (3)病毒收集、滅活和稀釋病變的細胞經(jīng)三次凍融后，經(jīng)0.22 μ m濾器過濾后，以1:20 體積比稀釋于無菌磷酸鹽緩沖溶液中，分裝并保存于-80°C冰箱中；
(4)疫苗制備將上述重組KSOC1S基因缺失病毒液以1:2，OOiTl100,000的不同濃度 稀釋于水體中，即可通過浸泡感染的途徑對魚體進行免疫。本實施例所用試劑均為本領域技術人員通用試劑。實施例3腫大細胞病毒減毒活疫苗水體浸泡免疫鱖魚用于預防ISKNV感染
用實施例2制備所得腫大細胞病毒減毒活疫苗通過浸泡免疫方法進行預防ISKNV感染試驗。1. 試驗魚及其飼養(yǎng)條件鱖魚購自廣東南海某養(yǎng)殖場，暫養(yǎng)于本實驗室的魚池中，平均規(guī)格約125 g，水溫保持 在25 27 °C，空氣動力泵自動充氣，循環(huán)水系統(tǒng)即時將魚池中的廢物吸出，日常投喂鮮活餌 料魚，一天投喂一次，免疫前鱖魚在飼養(yǎng)池中最少暫養(yǎng)2周以上。2.免疫
減毒活疫苗組隨即選擇15尾鱖魚，實施例1所得腫大細胞病毒疫苗以1:2，000體積 比(最終的TCID5tl為5 X IO6)稀釋于30L水體內(nèi)，浸泡鱖魚2h ；
陰性對照組隨即選擇15尾鱖魚，取同上述相等體積的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋 于30L水體內(nèi)，浸泡鱖魚2h;
將兩組處理后的鱖魚放養(yǎng)在3. 5 X 1. 0X0. 5 m3的中等水泥魚池中。3.攻毒
免疫3周后，取ISKNV病毒懸以TCID5tl終濃度為5 X 106/ml稀釋于30L水體內(nèi)，浸泡存 活的鱖魚2h。免疫和感染期間繼續(xù)投喂鮮活餌料魚，池水溫度穩(wěn)定在25 27°C。每日不定時觀 察，死魚及時清理，印片法檢測死亡魚類的脾臟腫大情況。4.疫苗和對照組處理后，再感染ISKNV病毒，鱖魚的死亡情況如表1所示。表1攻毒后三組魚的死亡情況
傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV，Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)是一 種主要的造成魚類大量死亡的病毒，感染后1(Γ12天死亡率為9(Γ100%，目前國內(nèi)外尚無有 效抑制ISKNV的藥物，通常養(yǎng)殖者采用生石灰、硫酸銅、次氯酸鹽、碘鹽或投放抗生素等方 法，通過改變水體環(huán)境抑制病毒生長，但是該病毒生命力非常頑強，無法起到預防作用，尤 其在水溫3(T37°C時更有大規(guī)模的爆發(fā)，傳統(tǒng)的抗生素對該病毒也不起作用。
但是從表1可以看出，感染了 ISKNV后，對照組的鱖魚在第7天開始死亡，尤其是 在感染后的8、天集中死亡，感染后的12天全部死亡。在而滅活疫苗組注射了本發(fā)明方法 制備的腫大細胞病毒疫苗，明顯地推遲了病毒的發(fā)病時間，在感染后的第10天鱖魚開始死 亡2尾，1(Γ14天再死亡1尾，在感染后的21天中，僅有2尾魚發(fā)病死亡。由此可以看出本 發(fā)明腫大細胞病毒疫苗其預防腫大細胞病毒感染的保護作用可達到80% (圖2)。
權利要求
一種腫大細胞病毒vsocs基因缺失減毒活疫苗，其特征在于該疫苗是利用基因工程原理將綠色熒光蛋白GFP報告基因替代腫大細胞病毒vsocs基因，構建并分離、純化獲得重組vsocs基因缺失病毒，將其作為腫大細胞病毒減毒活疫苗，該減毒活疫苗通過水體浸泡感染而使宿主魚體產(chǎn)生免疫。
2.權利要求1所述腫大細胞病毒KSOM基因缺失減毒活疫苗的制備方法，其特征在于 該制備方法包括如下步驟(1)重組KSOC1S基因缺失病毒轉(zhuǎn)移載體的構建通過PCR擴增KSOC1S基因在ISKNV基 因組上下游各約IOOObp的DNA片段，分別插入同一個克隆載體pUC18中；通過雙酶切真核 表達載體PEGFP-C3，獲得含CMV啟動子的綠色熒光蛋白GFP真核表達框，插入上述pUC18載 體的KSO^基因上下游片段之間，該克隆載體為KSO^基因缺失病毒轉(zhuǎn)移載體；(2)重組Ksoa基因缺失病毒的同源重組鱖魚仔魚細胞先通過瞬時轉(zhuǎn)染Ksoa基因 缺失病毒轉(zhuǎn)移載體5h后，再感染病毒lh，根據(jù)病毒復制的同源重組原理，72-96h預期獲得 GFP基因替代KSOC1S基因的重組KSOC1S基因缺失病毒；(3)重組KSO^基因缺失病毒的分離和純化通過熒光顯微鏡觀察并挑取發(fā)生病變且 表達GFP蛋白的細胞，通過有限稀釋法獲得單克隆化的重組KSO^基因缺失病毒；(4)腫大細胞病毒基因缺失減毒活疫苗的制備上述單克隆化的重組KS0^基因缺 失病毒，通過感染MFF-I細胞，擴大培養(yǎng)；將病變的細胞經(jīng)三次凍融后，收獲病毒液，經(jīng) 0. 22 μ m濾器過濾后，稀釋于PBS溶液中，分裝并保存于-80°C冰箱中，即得腫大病毒ksom 基因缺失減毒活疫苗成品；(5)水體浸泡感染體系以不同稀釋度的重組KSO^基因缺失病毒，通過水體浸泡感染 鱖魚2、h，記錄感染鱖3周內(nèi)的發(fā)病情況和死亡率，評定重組KSO^基因缺失病毒作為腫 大細胞病毒的基因工程活疫苗的可行性，將暫養(yǎng)3周的重組KSO^基因缺失病毒感染鱖再 次進行攻毒實驗，記錄感染鱖4周內(nèi)的存活率和保護率。
3.根據(jù)權利要求2所述腫大細胞病毒KSOM基因缺失減毒活疫苗的制備方法，其特征 在于所述步驟(1)中，所述KSO^基因作為腫大細胞病毒減毒活疫苗的基因缺失對象。
4.根據(jù)權利要求2所述腫大細胞病毒KSOM基因缺失減毒活疫苗的制備方法，其特征 在于所述步驟(1)中，通過PCR擴增MOM基因上下游約IOOObp的片段作為重組轉(zhuǎn)移載體 的組成部分。
5.根據(jù)權利要求2所述腫大細胞病毒KSOM基因缺失減毒活疫苗的制備方法，其特征 在于所述步驟(2)中，先瞬時KS0^基因缺失病毒轉(zhuǎn)移載體4 6h后，再感染病毒。
6.根據(jù)權利要求2所述腫大細胞病毒KSOM基因缺失減毒活疫苗的制備方法，其特征 在于所述步驟(2)中，利用GFP基因替代KSOC1S基因的重組KSOC1S基因缺失病毒。
7.根據(jù)權利要求2所述腫大細胞病毒KSOM基因缺失減毒活疫苗的制備方法，其特征 在于所述步驟(3)中，通過有限稀釋法獲得單克隆化的重組KSO^基因缺失病毒。
8.根據(jù)權利要求2所述腫大細胞病毒KSOM基因缺失減毒活疫苗的制備方法，其特征 在于所述步驟(4)中，單克隆化的重組MOM基因缺失病毒，稀釋于PBS溶液中即得腫大病 毒KSOC1S基因缺失減毒活疫苗成品。
9.根據(jù)權利要求2所述腫大細胞病毒KSOM基因缺失減毒活疫苗的制備方法，其特征 在于所述步驟(5)中，水體浸泡重組MOM基因缺失病毒感染鱖魚2、h，作為疫苗免疫途徑和免疫時間。
10.權利要求1所述腫大細胞病毒KSOM基因缺失減毒活疫苗在預防魚類腫大細胞病 毒感染中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了腫大細胞病毒vsocs基因缺失減毒活疫苗及其制備方法和應用。本發(fā)明減毒活疫苗是利用基因工程原理將綠色熒光蛋白GFP報告基因替代腫大細胞病毒vsocs基因，構建重組轉(zhuǎn)移載體，同源重組后，經(jīng)分離、純化，獲得重組vsocs基因缺失的腫大細胞病毒，將其作為腫大細胞病毒基因工程疫苗。本發(fā)明減毒活疫苗具有免疫力強、用量少、成本低、可聯(lián)合使用、同時啟動細胞免疫和體液免疫、保護時間長、不需添加佐劑的優(yōu)點，通過水體浸泡感染即可使宿主魚體產(chǎn)生免疫，不僅彌補了傳統(tǒng)腫大細胞病毒滅活疫苗、弱毒疫苗或基因工程亞單位疫苗的不足，還有利于大規(guī)模推廣應用。
文檔編號C12N7/02GK101926990SQ201010288560
公開日2010年12月29日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權日2010年9月21日
發(fā)明者何建國, 劉 東, 張穎芬, 楊麗詩, 翁少萍, 賈坤同, 郭長軍, 陽曉波, 黃志堅 申請人:中山大學