本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域,涉及治療糖尿病藥物篩選的技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的斑馬魚模型。
背景技術(shù):
糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性代謝性疾病。其發(fā)病原因主要是機體不能分泌足夠的胰島素或者胰島素的下游靶器官組織發(fā)生了胰島素抵抗,不能有效地降低血糖,從而引起血糖升高,糖尿病發(fā)病和進(jìn)一步的各種嚴(yán)重的并發(fā)癥。來自全球的研究數(shù)據(jù)顯示,2013年全世界糖尿病患病人數(shù)估計達(dá)到3.82億,我國糖尿病患病人數(shù)約達(dá)1.139億,已成為糖尿病第一大國。糖尿病已經(jīng)發(fā)展成為危害人類健康、社會和經(jīng)濟發(fā)展的全球性問題,大力發(fā)展糖尿病基礎(chǔ)研究和促進(jìn)其研究成果向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化,已成為世界各國的迫切需要。
作為機體內(nèi)唯一產(chǎn)生和分泌胰島素的細(xì)胞,胰島β細(xì)胞的功能和數(shù)量在糖尿病的發(fā)病過程中起著決定性的作用。目前,利用高通量篩選(High-Throughput Screening,HTS)促進(jìn)胰島β細(xì)胞數(shù)目和功能的藥物,是一種治療糖尿病非常有前景的方案?,F(xiàn)在的研究主要集中于促進(jìn)胰島β細(xì)胞增生的藥物篩選,然而,應(yīng)用β細(xì)胞系或原代細(xì)胞體外篩選除了會造成與體外環(huán)境相關(guān)的假象外,也不能篩得間接促進(jìn)(通過影響其它胰腺細(xì)胞或其它器官)β細(xì)胞增生的化合物。而斑馬魚因為其透明、占地小、較低廉的飼養(yǎng)費用成為理想的高通量篩選的動物模型。Didier Y.R.Stainier研究組利用基于熒光的泛素化細(xì)胞周期指標(biāo)(fucci)技術(shù),創(chuàng)建了可以標(biāo)記分裂期的β細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚,并利用該體系進(jìn)行了高內(nèi)涵篩選(High Content Screening,HCS),得到20種可以在體促進(jìn)β細(xì)胞增殖的小分子。這些分子雖然結(jié)構(gòu)迥異,但主要調(diào)節(jié)三個特異的信號途徑:血清素,視黃酸和糖皮質(zhì)激素。
然而,關(guān)于促胰島β細(xì)胞功能的新藥篩選方面的研究目前仍處于空白狀態(tài),最主要的原因是缺乏一個可以在體便捷可行地甚至自動化地評價胰島β細(xì)胞功能的動物模型。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足,本發(fā)明的目的是提供一種在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的斑馬魚模型,從而可以在體觀測胰島β細(xì)胞的功能。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的斑馬魚模型的構(gòu)建方法。
為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的。
一種在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的斑馬魚模型,斑馬魚BAC_CH211_69I14(BACPAC Resources Center)包含基因preproinsulin(ins)的全部序列,斑馬魚BAC_CH211_69I14上ins基因的編碼序列替換為熒光蛋白序列,熒光信號均特異性地表達(dá)在胰島β細(xì)胞中,可以指示活體內(nèi)胰島β細(xì)胞鈣離子信號變化。
優(yōu)選地,所述熒光蛋白序列為紅色熒光蛋白Rcamp1.07;所述紅色熒光蛋白Rcamp1.07是一種特異性指示鈣離子濃度的紅色熒光蛋白。
優(yōu)選地,利用RecE/RecT同源重組技術(shù)把BAC_CH211_69I14上ins基因的編碼序列替換為Rcamp1.07的序列。
一種上述的在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的斑馬魚模型的構(gòu)建方法,包括以下步驟:
S1.獲取斑馬魚胰島素ins完整基因序列和構(gòu)建PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒;
S2.轉(zhuǎn)基因斑馬魚的創(chuàng)建;
S3.轉(zhuǎn)基因斑馬魚的鑒定。
優(yōu)選地,利用RecE/RecT同源重組技術(shù)把BAC_CH211_69I14上ins基因的編碼序列替換為紅色熒光蛋白Rcamp1.07的序列,將Rcamp1.07及其前后的ins調(diào)節(jié)序列進(jìn)一步通過同源重組亞克隆到含有兩個I-SceI大范圍核酸酶酶切位點的質(zhì)粒中,最終將上述得到的質(zhì)粒與大范圍核酸酶I-SceI共同注射到斑馬魚胚胎處于單細(xì)胞階段的受精卵中,篩選出在胰島β細(xì)胞表達(dá)Rcamp1.07熒光蛋白并且具有種系傳遞的F0代陽性斑馬魚,根據(jù)Rcamp1.07的熒光信號的強度,選擇表達(dá)量較強的Tg(ins:Rcamp1.07)魚系進(jìn)行大量繁殖。
優(yōu)選地,上述的在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的斑馬魚模型的構(gòu)建方法,所述的獲取斑馬魚胰島素ins完整基因序列和構(gòu)建PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒,包括以下步驟:
S1.獲取斑馬魚胰島素ins完整基因序列;
S2.把紅色熒光蛋白Rcamp1.07蛋白編碼序列克隆到R6K中間載體上;
S3.設(shè)計分別包含ins蛋白編碼序列起始ATG上游同源序列和下游同源序列的引物對,PCR擴增Rcam1.07-frt-kana-frt序列,然后轉(zhuǎn)染到含有RecE/RecT同源重組系統(tǒng)和BAC_ins的大腸桿菌中,利用卡那霉素篩選Rcamp1.07-frt-kana-frt基因成功插入到BAC_ins載體ins啟動子下游的克隆BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt;
S4.設(shè)計分別包含ins基因最上游同源序列和最下游同源序列的引物對,擴增兩端攜帶I-SceI酶切位點的PNPC2載體片段,該PNPC2載體片段包含諾爾絲菌素抗性基因cloNAT,轉(zhuǎn)染到含有RecE/RecT同源重組系統(tǒng)和BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的大腸桿菌中,利用諾爾絲菌素篩選出生成PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt重組質(zhì)粒的大腸桿菌克??;
S5.轉(zhuǎn)染表達(dá)flpe的質(zhì)粒到含有PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的克隆中,催化兩個frt序列的同源重組,去掉卡那霉素抗性基因,最終得到含有質(zhì)粒PNPC2-ins-Rcamp1.07的大腸桿菌克隆。
更優(yōu)選地,上述的在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的斑馬魚模型的構(gòu)建方法,所述步驟S3的引物對為:
L:5’-ATGTTTTTGATTGACAGAGATTGTATGTGTGTGTTTGTGTCAGTGTGACCCGCCACCATGGGTTCTCATC-3’;
R:5’-CCTGTGTGCAAACAGGTGTTTCTGGCATCGGCGGTGGTCAAATCTCTTCAGGCAGATCGTCAGTCAG-3’。
更優(yōu)選地,上述的在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的斑馬魚模型的構(gòu)建方法,所述步驟S4的引物對為:
L:5’-AGTCCATTAAATAATATCTTGTAGAATTATGTTTTTAAAAAGTACCAATGCCGTAGGGATAACAGGGTAATTTAAGC-3’;
R:5’-CAACTTTTTCACAAACACTGACCAAAACAAGCTACATGTTTTAGAGGCATTAGGGATAACAGGGTAATTGCACTG-3’。
優(yōu)選地,上述的在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的斑馬魚模型的構(gòu)建方法,所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚的創(chuàng)建,包括以下步驟:
S1.將核酸內(nèi)切酶I-SceI與上述PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒共同注射到斑馬魚胚胎處于單細(xì)胞階段的受精卵中,隨機將ins-Rcamp1.07序列整合到斑馬魚的基因組中;
S2.將上述注射了PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒的F0代胚胎養(yǎng)到2天魚齡的時候,運用配備汞燈的體式鏡或者寬場熒光顯微鏡進(jìn)行篩選,將Rcamp1.07熒光信號正確定位于胰島部位的幼魚挑選出來,培養(yǎng)待其性成熟用于繁殖下一代;
S3.將成年的F0代轉(zhuǎn)基因魚與AB野生型斑馬魚雜交,產(chǎn)生的F1代在2天魚齡時用上述同樣方法篩選出在胰島中表達(dá)Rcamp1.07的陽性胚胎,選擇陽性胚胎轉(zhuǎn)基因斑馬魚F1代繼續(xù)養(yǎng)殖。
以上所述的在體篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物的斑馬魚模型在篩選促胰島β細(xì)胞功能藥物中的應(yīng)用。
更優(yōu)選地,該轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型可以指示活體內(nèi)胰島β細(xì)胞鈣離子信號變化,在寬場熒光顯微鏡下,可以在體實時觀測和指示胰島β細(xì)胞群體的功能狀態(tài);在雙光子三軸光片層熒光顯微鏡2P3A-DSLM的高分辨率下,可以觀察活體狀態(tài)下轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的單個胰島β細(xì)胞的功能狀態(tài);通過直接觀測胰島β細(xì)胞內(nèi)鈣信號變化從而直觀地評價活體中胰島β細(xì)胞的功能。
免疫熒光實驗結(jié)果表明本發(fā)明創(chuàng)建的Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因斑馬魚系中Rcamp1.07的熒光信號均特異性地表達(dá)在胰島β細(xì)胞中。在寬場顯微鏡下觀測受精后3天的Tg(ins:Rcamp1.07)幼魚,當(dāng)用20mM葡萄糖刺激時,其胰島β細(xì)胞的熒光強度明顯升高,反映了葡萄糖刺激下細(xì)胞膜去極化引起的鈣離子內(nèi)流。綜上所述,本發(fā)明成功創(chuàng)建了可以在體實時觀測和指示胰島β細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型,通過直接觀測胰島β細(xì)胞內(nèi)鈣信號變化從而直觀地評價活體中胰島β細(xì)胞的功能。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果:
1、相比于Didier Y.R.Stainier研究組創(chuàng)建的可以指示β細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)基因斑馬魚,本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型是第一個可以指示活體內(nèi)胰島β細(xì)胞功能的動物模型。
2、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以在其活體中可以實時觀測胰島β細(xì)胞內(nèi)鈣信號的變化,直觀并準(zhǔn)確地報告胰島β細(xì)胞功能狀態(tài);運用該轉(zhuǎn)基因斑馬魚系,可以在活體水平進(jìn)行便捷、自動化和高通量地分析胰島β細(xì)胞的功能特點,從而實現(xiàn)對于促進(jìn)胰島β細(xì)胞功能藥物的高通量篩選。
3、使用普通的寬場熒光顯微鏡,可以觀察活體狀態(tài)下轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的胰島β細(xì)胞群體的功能狀態(tài),即胰島β細(xì)胞群體響應(yīng)葡萄糖刺激而產(chǎn)生鈣離子信號增強及周期性波動;使用雙光子三軸光片層熒光顯微鏡2P3A-DSLM在高分辨率,可以觀察活體狀態(tài)下轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的單個胰島β細(xì)胞的功能狀態(tài),可以得到單個胰島β細(xì)胞的高時空分辨率的Ca2+信號隨時間變化的熒光曲線。
4、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型可以應(yīng)用于篩選促進(jìn)胰島β細(xì)胞功能藥物中,也可以為篩選藥物動物模型的構(gòu)建提供了方法,具有重要的現(xiàn)實意義和廣泛的應(yīng)用前景。
附圖說明
利用附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明,但附圖中的實施例不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制,對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員,在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下,還可以根據(jù)以下附圖獲得其它的附圖。
圖1為包含斑馬魚preproinsulin序列的細(xì)菌人工染色體(BAC_ins)。
圖2為RecE/RecT系統(tǒng)介導(dǎo)同源重組的發(fā)生機制。
圖3為PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜。
圖4為斑馬魚胚胎顯微注射以及轉(zhuǎn)基因斑馬魚F0代篩選的示意圖以及結(jié)果。
其中,圖a:將大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI與PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒共同注射到斑馬魚胚胎處于單細(xì)胞階段的受精卵中,每枚受精卵注射大約1nL的混合液;培養(yǎng)至2天魚齡時,在寬場熒光顯微鏡下篩選在胰島位置表達(dá)Rcamp1.07的F0代斑馬魚并培養(yǎng);
圖b:在寬場熒光顯微鏡下Rcamp1.07正確表達(dá)在胰島部位的轉(zhuǎn)基因斑馬魚F0代胚胎;
圖c:在子代F1代中遺傳了ins-Rcamp1.07轉(zhuǎn)基因的F0代斑馬魚的生殖系轉(zhuǎn)基因效率的評估。
圖5為對3天魚齡Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行整胚胰島素抗體免疫熒光染色后胰島部位的共聚焦顯微鏡成像。
其中,圖a:Rcamp1.07蛋白的紅色熒光信號;
圖b:綠色熒光信號指示用胰島素抗體標(biāo)記的胰島素的表達(dá);
圖c:對a,b兩個通道的熒光信號進(jìn)行合并;標(biāo)尺,10μm。
圖6為寬場顯微鏡下Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因斑馬魚響應(yīng)葡萄糖刺激的鈣離子信號的實時成像。
其中,圖a:蒙太奇圖為2天魚齡的Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎于3mM葡萄糖下孵育20min、再加入20mM葡萄糖刺激60min,在此期間每隔一段時間所拍攝的胰島熒光圖像,箭頭標(biāo)注了發(fā)生鈣離子內(nèi)流的胰島區(qū)域;
圖b:對a中標(biāo)注的胰島區(qū)域進(jìn)行熒光曲線分析;標(biāo)尺,50μm。
圖7為雙光子三軸光片層熒光顯微鏡下Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因斑馬魚響應(yīng)葡萄糖刺激的鈣離子信號的實時成像。
其中,圖a:雙光子三軸光片層熒光顯微鏡下在體觀測Tg(ins:Rcamp1.07)斑馬魚胰島β細(xì)胞功能的示意圖;
圖b:對3天魚齡的Tg(ins:Rcamp1.07)斑馬魚胚胎進(jìn)行活體成像和三維重構(gòu);
圖c:蒙太奇圖為對b中3天魚齡的Tg(ins:Rcamp1.07)斑馬魚胚胎加入20mM葡萄糖刺激后,在15μm和30μm兩個層面每隔20s時間間隔所拍攝的代表性圖像,箭頭標(biāo)注了3個發(fā)生鈣離子內(nèi)流的胰島β細(xì)胞;
圖d:對圖c中標(biāo)注的胰島β細(xì)胞進(jìn)行熒光曲線分析;標(biāo)尺,10μm。
具體實施方式
下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)闡述,所述實施例只用于解釋本發(fā)明,并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)分子生物學(xué)方法;所使用的材料、試劑等,如無特殊說明,為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。
實施例1:斑馬魚模型的構(gòu)建
1、PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒的構(gòu)建
1.1 斑馬魚胰島素BAC_ins完整基因序列的獲取
斑馬魚BAC_CH211_69I14(BACPAC Resources Center),包含斑馬魚preproinsulin(ins)基因的全部序列以及與其緊鄰的上下游基因(如圖1)。
1.2 斑馬魚胰島素BAC_ins基因修飾
使用RecE/RecT同源重組系統(tǒng)對斑馬魚胰島素BAC_ins基因進(jìn)行修飾,選用來自λ噬菌體的RecE/RecT同源重組系統(tǒng),RecE是一種5’-3’核酸外切酶,暴露出單鏈DNA的3’粘性末端;RecT是一種單鏈結(jié)合蛋白,它可以結(jié)合在單鏈DNA的3’粘性末端上,并介導(dǎo)其與另一條雙鏈DNA上或基因組上的同源序列發(fā)生同源重組,從而將目的基因插入和替換(如圖2)。
1.3 PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒的構(gòu)建
利用RecE/RecT同源重組技術(shù)把BAC_CH211_69I14上ins基因蛋白編碼序列替換為Rcamp1.07的序列,進(jìn)一步通過同源重組把修飾后的ins基因全序列亞克隆到含有兩個I-SceI大范圍核酸酶酶切位點的載體上,生成PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒(如圖3)。因為Rcamp1.07是一種指示Ca2+濃度的紅色熒光蛋白,與Ca2+結(jié)合后,Rcamp1.07的構(gòu)象發(fā)生變化,可以在561nm激光激發(fā)下,產(chǎn)生584nm左右的激發(fā)光譜,從而指示Ca2+濃度變化。
1.4 PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒的具體構(gòu)建過程,包括如下步驟:
S1.把Rcam1.07蛋白編碼序列克隆到R6K中間載體上,使其下游是frt-kana-frt序列,kana是編碼卡那霉素抗性蛋白。
S2.設(shè)計分別包含ins蛋白編碼序列起始ATG上游或下游同源序列的引物,PCR擴增Rcam1.07-frt-kana-frt序列,然后轉(zhuǎn)染到含有RecE/RecT同源重組系統(tǒng)和BAC_ins的大腸桿菌中,利用卡那霉素篩選Rcamp1.07-frt-kana-frt基因成功插入到BAC_ins載體ins啟動子下游的克隆BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt,所述引物為:
L:5’-ATGTTTTTGATTGACAGAGATTGTATGTGTGTGTTTGTGTCAGTGTGACCCGCCACCATGGGTTCTCATC-3’,
R:5’-CCTGTGTGCAAACAGGTGTTTCTGGCATCGGCGGTGGTCAAATCTCTTCAGGCAGATCGTCAGTCAG-3’;
S3.設(shè)計分別包含了ins基因最上游和最下游同源序列的引物,擴增兩端攜帶I-SceI酶切位點的PNPC2載體片段,包含諾爾絲菌素抗性基因cloNAT,轉(zhuǎn)染到含有RecE/RecT同源重組系統(tǒng)和BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的大腸桿菌中,利用諾爾絲菌素篩選出生成PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt重組質(zhì)粒的大腸桿菌克隆,在該克隆中PNPC2載體片段成功替換掉BAC上除了修飾后的ins基因之外的全部序列,所述引物為:
L:5’-AGTCCATTAAATAATATCTTGTAGAATTATGTTTTTAAAAAGTACCAATGCCGTAGGGATAACAGGGTAATTTAAGC-3’,
R:5’-CAACTTTTTCACAAACACTGACCAAAACAAGCTACATGTTTTAGAGGCATTAGGGATAACAGGGTAATTGCACTG-3’;
S4.轉(zhuǎn)染表達(dá)flpe的質(zhì)粒到含有PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的克隆中,催化兩個frt序列的同源重組,去掉卡那霉素抗性基因,最終得到含有質(zhì)粒PNPC2-ins-Rcamp1.07的大腸桿菌克隆。
2、轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(ins:Rcamp1.07)的創(chuàng)建
2.1 斑馬魚胚胎顯微注射
在受精卵中或其卵裂形成的胚胎細(xì)胞過程中,I-SceI可以識別質(zhì)粒PNPC2-ins-Rcamp1.07上的兩個I-SceI識別位點,切割并結(jié)合在酶切產(chǎn)物的兩個末端上,隨機將ins-Rcamp1.07序列整合到斑馬魚的基因組中。將大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI和PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒共同注射到斑馬魚的受精卵中(如圖4),受精卵處于單細(xì)胞階段;內(nèi)切酶的最終總效價為20U,質(zhì)粒的終濃度為100ng/ul。
2.2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚F0代的篩選
將注射了PNPC2-ins-Rcamp1.07質(zhì)粒的斑馬魚F0代胚胎養(yǎng)到2天魚齡,運用配備汞燈的體式鏡或者寬場熒光顯微鏡對其進(jìn)行篩選,將Rcamp1.07熒光信號正確定位于胰島部位的幼魚挑選出來,培養(yǎng)至其性成熟;將成年的F0代轉(zhuǎn)基因魚與AB野生型斑馬魚雜交,對2天魚齡的F1代篩選出在胰島中表達(dá)Rcamp1.07的陽性胚胎,使用的方法與F0代相同;選擇熒光信號最強的Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因斑馬魚F1代繼續(xù)養(yǎng)殖,并將其后代進(jìn)行大量擴增。
實施例2:轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的鑒定
為了進(jìn)一步驗證實施例1所構(gòu)建的Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因斑馬魚中胰腺β細(xì)胞被特異性地標(biāo)記了Rcamp1.07,運用斑馬魚整胚免疫熒光染色技術(shù),用胰島素抗體熒光標(biāo)記3天魚齡的Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因魚中的胰腺β細(xì)胞,觀察Rcamp1.07的信號是否準(zhǔn)確定位在胰腺β細(xì)胞當(dāng)中,結(jié)果顯示,Rcamp1.07的紅色熒光信號定位在由胰島素insulin抗體標(biāo)記出來的胰島β細(xì)胞當(dāng)中(如圖5),本發(fā)明構(gòu)建的Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因斑馬魚是準(zhǔn)確報告胰腺β細(xì)胞特性的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系β-cell-specific reporter fish。
實施例3:轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的應(yīng)用
1.轉(zhuǎn)基因斑馬魚胰島β細(xì)胞群體的應(yīng)用
試驗方法:使用普通的寬場熒光顯微鏡;
S1.將Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因魚孵育在外液E3中,使用普通的寬場熒光顯微鏡,選用561nm波長的激光照射斑馬魚整胚;找到紅色熒光信號所在的斑馬魚胰島部位,精細(xì)調(diào)節(jié)焦面,使得胰島位于顯微鏡的焦平面位置,拍攝20min的基礎(chǔ)鈣信號。
S2.往外液加入20mM葡萄糖刺激,繼續(xù)拍攝鈣信號60min;記錄活體斑馬魚內(nèi)胰島β細(xì)胞群體的鈣離子信號隨時間的變化。
E3外液的成分為:5.0mMNaCl,0.17mMKCl,0.33mM CaCl2,0.33mM MgSO4。
結(jié)果顯示:在普通的寬場熒光顯微鏡的低倍鏡(10X)視野,當(dāng)外液加入高濃度的葡萄糖刺激后,轉(zhuǎn)基因斑馬魚胰島內(nèi)Rcamp1.07的熒光信號快速增強,并且伴隨著信號強度的周期性波動(如圖6),表明轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以用來指示胰島β細(xì)胞群體的功能狀態(tài),即其可以響應(yīng)葡萄糖刺激而發(fā)生鈣離子內(nèi)流和周期性的鈣離子震蕩。
2.轉(zhuǎn)基因斑馬魚單個胰島β細(xì)胞的應(yīng)用
因為寬場熒光顯微鏡的低分辨率不能觀測單個胰島β細(xì)胞的功能狀態(tài),如果需要對單個胰島β細(xì)胞進(jìn)行觀測其功能狀態(tài),就要使用分辨率更高的熒光顯微鏡,本實驗采用了雙光子三軸光片層熒光顯微鏡(2P3A-DSLM),具體步驟如下:
S1.將Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因魚包埋在1%瓊脂糖凝膠中,并孵育在外液E3中;
S2.使用雙光子三軸光片層熒光顯微鏡,用1030nm波長的激光照射斑馬魚整胚,找到紅色熒光信號所在的斑馬魚胰島部位之后,精細(xì)調(diào)節(jié)焦面,使得胰島位于顯微鏡的焦平面位置,調(diào)節(jié)斑馬魚的成像體位,獲得能夠分辨出單個胰腺β細(xì)胞的清晰圖像,拍攝基礎(chǔ)鈣信號30s;
S3.往外液加入20mM葡萄糖刺激,繼續(xù)拍攝鈣信號90s,觀察記錄活體斑馬魚內(nèi)每個胰島β細(xì)胞的鈣離子信號的變化。
E3外液的成分為:5.0mMNaCl,0.17mMKCl,0.33mM CaCl2,0.33mM MgSO4。
結(jié)果顯示:在高倍鏡(40X)視野下,成功地得到了清晰的高空間分辨率的二維和三維的胰島圖像,得到了高時空分辨率的Ca2+信號隨時間變化的熒光曲線(如圖7)。
相比于單光子激發(fā)的寬場熒光顯微鏡系統(tǒng),2P3A-DSLM成像系統(tǒng)結(jié)合了雙光子技術(shù),故穿透深,可以實現(xiàn)對深埋在活體樣本中的胰島進(jìn)行高分辨率成像;同時因為結(jié)合了光片層照明技術(shù),可以實現(xiàn)對活體樣本進(jìn)行長時間的成像而不發(fā)生明顯的熒光漂白。因此,Tg(ins:Rcamp1.07)轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以在2P3A-DSLM高倍鏡下指示每一個胰島β細(xì)胞的功能狀態(tài),在高糖刺激下,葡萄糖在胰島β細(xì)胞內(nèi)代謝,產(chǎn)生ATP,提高ATP/ADP比例,關(guān)閉ATP依賴型的鉀離子通道,引起細(xì)胞膜去極化,從而打開電壓門控的鈣離子通道,發(fā)生鈣離子內(nèi)流和周期性的鈣離子震蕩,升高的鈣離子刺激胰島素囊泡釋放;即高糖刺激下的胞漿內(nèi)鈣離子水平的實時變化,因此鈣離子內(nèi)流和鈣離子震蕩是評價胰島β細(xì)胞功能的重要指標(biāo)。
最后應(yīng)當(dāng)說明的是,以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案,而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制,盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)地說明,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換,而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。