專利名稱：細(xì)胞移植的制作方法
細(xì)胞移植相關(guān)申請案本申請案依據(jù)35 U. S. C. § 119(e)主張2008年10月21日申請的美國臨時(shí)專利申請案USSN 61/107,023的優(yōu)先權(quán)，所述專利以引用的方式并入本文中。
背景技術(shù)：
外傷、先天性缺陷、感染和腫瘤切除繼發(fā)的軟組織損傷和畸形是造成患者發(fā)病的重要原因。目前，自體游離皮瓣(free flap)重建或局部推進(jìn)皮瓣是重大軟組織和骨缺損重建模態(tài)的主要工具(workhorse)。盡管帶蒂皮瓣(pedicled flap)和游離皮瓣重建提供了進(jìn)行重建的有力工具，但其有可能引起嚴(yán)重副作用和供體部位發(fā)病。曾經(jīng)在軟組織重建中使用自體脂肪移植，但這項(xiàng)技術(shù)是不可預(yù)測的。使用抽脂的脂肪具有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)1)極低的供體部位發(fā)病，由此提供一個(gè)安全且易于獲得的自體細(xì)胞來源；和2)這些程序相對易于進(jìn)行，同時(shí)不會出現(xiàn)缺血性并發(fā)癥以及與血管化游離皮瓣有關(guān)的早期移植失敗的問題。然而，到目前為止，游離脂肪移植受到不可預(yù)測的再吸收水平和由此引起的不規(guī)則性問題的困擾。游離脂肪移植失敗和體積減小似乎與采集時(shí)產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致膜損傷、早期缺血性改變以及營養(yǎng)缺失和移植物供血不足有關(guān)。這些應(yīng)激子導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡。接下來，在再血管化后去除死亡的細(xì)胞碎片將引起移植物再吸收。這一過程導(dǎo)致不協(xié)調(diào)且不合需要的軟組織修復(fù)結(jié)果。由于脂肪移植最初是由紐博(Neuber) 在1893年描述的，致使很少改善游離脂肪移植結(jié)果。迄今為止，有關(guān)在建立充足的血管分布之前減少初始缺血損傷的細(xì)胞的嘗試已經(jīng)取得了適度的成果。因此，只改善脂肪移植物的供血不足以顯著改善脂肪移植的結(jié)果。在脂肪移植物取得、處理和/或移植期間，防止細(xì)胞損傷也很重要。仍需要能在美容手術(shù)和重建手術(shù)中較為成功地移植脂肪組織或來源于脂肪組織的細(xì)胞(例如脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞)。在軟組織重建中轉(zhuǎn)移大量自體脂肪組織的能力將為約數(shù)百萬患者提供一個(gè)新穎的重建選擇，同時(shí)不會伴隨供體部位發(fā)病。此外，還為供體部位選擇較少的患者以及不能耐受進(jìn)行皮瓣重建所需的長時(shí)間手術(shù)的患者提供一個(gè)有利工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于可預(yù)測地成功移植脂肪組織和脂肪細(xì)胞的需求。本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)脂肪移植物中的受損細(xì)胞逐漸凋亡，并最終被接受者的身體所吸收。防止這些移植物的細(xì)胞，尤其是細(xì)胞膜損傷，將允許更成功地進(jìn)行可預(yù)測的脂肪移植。為防止移植物細(xì)胞損傷，在本發(fā)明中，在移植物取得、移植物處理(例如洗滌、存儲)和/或最終移植程序期間，將保護(hù)細(xì)胞膜免受損傷。已經(jīng)研究了各種膜穩(wěn)定劑，由此鑒別出使脂肪移植物中細(xì)胞的死亡隨時(shí)間而減少的試劑。人們發(fā)現(xiàn)，疏水性部分側(cè)接兩個(gè)親水性部分構(gòu)成的三嵌段共聚物(例如泊洛沙姆P188(P0l0Xamer P188)，如

圖1中所示)可使細(xì)胞膜穩(wěn)定，并且使脂肪移植物中細(xì)胞的死亡隨時(shí)間而減少。將這些聚合物與欲移植的脂肪組織或脂肪細(xì)胞混合， 會引起可預(yù)測且持久的脂肪移植。其它聚合物，諸如二嵌段共聚物、四嵌段共聚物和聚乙二醇，也經(jīng)過測試，并且發(fā)現(xiàn)其不能保護(hù)細(xì)胞免受損傷，或者會溶解細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供在軟組織重建或填充的脂肪移植過程中使用三嵌段共聚物，尤其P188的組合物、方法和試劑
品.ο細(xì)胞膜包括磷脂，其具有疏水性和親水性結(jié)構(gòu)域。這些磷脂形成一個(gè)連續(xù)的脂質(zhì)雙層，包圍細(xì)胞。這一脂質(zhì)雙層的完整性對于防止細(xì)胞損傷極為重要。本發(fā)明提供三嵌段共聚物的組合物，其使細(xì)胞膜密封和/或穩(wěn)定，并防止細(xì)胞受損。通常，這些聚合物與細(xì)胞的磷脂雙層相互作用，并填塞損傷細(xì)胞膜中的孔。此外，經(jīng)顯示，這些聚合物還降低膜粘度。 細(xì)胞粘度降低將使損傷的細(xì)胞變得更易溶解，而這樣又會降低受損膜上的張力。本發(fā)明還提供在脂肪組織和脂肪細(xì)胞或其它組織和細(xì)胞(例如干細(xì)胞)移植過程中使用所述組合物的方法。一方面，本發(fā)明提供三嵌段共聚物，其有助于使細(xì)胞膜密封和/或穩(wěn)定。本發(fā)明中所用聚合物優(yōu)選為生物可相容和/或生物可降解的。這種聚合物不應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞溶解。在某些實(shí)施例中，所述聚合物是非離子性聚合物。在某些實(shí)施例中，所述聚合物是聚醚。在某些實(shí)施例中，所述聚合物是聚烷基醚。在某些實(shí)施例中，所述聚合物是聚烷基醚與另一聚合物(例如聚烷基醚)的共聚物。具體說來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，泊洛沙姆可用于使細(xì)胞膜密封和穩(wěn)定。如以下化學(xué)結(jié)構(gòu)中所示，泊洛沙姆是由中央疏水性聚氧丙烯(polyoxypropylenhPOP) (也稱為聚丙二醇)鏈側(cè)接兩個(gè)親水性聚氧乙烯(polyoxyethylene，Ρ0Ε)(也稱為聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG))鏈構(gòu)成的非離子性三嵌段共聚物。在某些實(shí)施例中，優(yōu)選
將疏水性核心側(cè)接兩個(gè)親水性尾構(gòu)成的三嵌段共聚物用于脂肪移植。
權(quán)利要求
1.一種用于移植脂肪源性細(xì)胞的方法，所述方法包含 對個(gè)體投予脂肪源性細(xì)胞與三嵌段共聚物的組合物，其中所述共聚物包含側(cè)接兩個(gè)親水性尾的中央疏水性核心，且所述共聚物保護(hù)所述細(xì) 胞免受損傷并防止細(xì)胞死亡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物密封所述細(xì)胞的膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物使所述細(xì)胞的膜穩(wěn)定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脂肪源性細(xì)胞是脂肪細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脂肪源性細(xì)胞是干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脂肪源性細(xì)胞是自體細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物是聚醚。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物是聚烷基醚。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物是聚烷基醚與另ー聚烷基醚的共聚物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物是聚乙ニ醇與另ー聚合物的共聚物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述另ー聚合物的疏水性比聚乙ニ醇強(qiáng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物是聚丙ニ醇與另ー聚合物的共聚物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述另ー聚合物的親水性比聚丙ニ醇強(qiáng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物為以下形式的三嵌段共聚物聚乙ニ 醇-聚丙ニ醇-聚乙ニ醇。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物是泊洛沙姆(POLOXAMER)P188。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物是泊洛沙姆P108。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物是泊洛沙姆1107。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物的分子量范圍為約1，000g/mol到約 10，000g/mol。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物的分子量范圍為約2，000g/mol到約 10，OOOg/mol。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物的分子量范圍為約3，000g/mol到約 10，000g/mol。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物的分子量范圍為約5，000g/mol到約 10，000g/mol。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物是非離子性的。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞與聚合物的組合物進(jìn)ー步包含硫辛酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物包含每毫升細(xì)胞約Img到約20mg聚 合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物包含每毫升細(xì)胞約5mg到約15mg聚 合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物包含每毫升細(xì)胞約15mg聚合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物包含每毫升細(xì)胞約IOmg聚合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物為至少95%純。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物為至少98%純。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物為至少99%純。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體為人類。
33.一種用于移植脂肪細(xì)胞的方法，所述方法包含 對個(gè)體投予脂肪細(xì)胞與泊洛沙姆P188的組合物。
34.一種防止脂肪移植物再吸收的方法，其包含對個(gè)體投予脂肪源性細(xì)胞與三嵌段共聚物的組合物，其中所述共聚物包含側(cè)接兩個(gè)親水性尾的中央疏水性核心。
35.一種密封脂肪源性細(xì)胞的細(xì)胞膜的方法，其包含使脂肪源性細(xì)胞與足以密封所述細(xì)胞膜的量的三嵌段共聚物接觸，其中所述共聚物包含側(cè)接兩個(gè)親水性尾的中央疏水性核心。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中所述細(xì)胞是脂肪細(xì)胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞。
38.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中所述聚合物是泊洛沙姆P188。
39.一種用于移植脂肪組織的方法，所述方法包含 對個(gè)體投予脂肪組織與三嵌段共聚物的組合物，其中所述共聚物包含側(cè)接兩個(gè)親水性尾的中央疏水性核心，且所述共聚物保護(hù)所述脂肪組織的細(xì)胞免受損傷并防止細(xì)胞死亡。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述聚合物是泊洛沙姆P188。
41.一種組合物，其包含脂肪源性細(xì)胞與泊洛沙姆P188。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述脂肪源性細(xì)胞是脂肪細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述脂肪源性細(xì)胞是干細(xì)胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述脂肪源性細(xì)胞是脂肪細(xì)胞與干細(xì)胞的組I=I O
45.一種組合物，其包含泊洛沙姆P188和脂肪細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的組合物，其中脂肪細(xì)胞在所述組合物的細(xì)胞中占至少 80%。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的組合物，其中脂肪細(xì)胞在所述組合物的細(xì)胞中占至少 90%。
48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的組合物，其中脂肪細(xì)胞在所述組合物的細(xì)胞中占至少 95%。
49.一種組合物，其包含泊洛沙姆P188和脂肪組織。
50.一種鑒別適用于脂肪移植的聚合物的方法，所述方法包含以下步驟 使脂肪細(xì)胞與足夠濃度的測試聚合物接觸以使所述細(xì)胞穩(wěn)定；和分析細(xì)胞死亡或毒性。
51.一種鑒別適用于脂肪移植的聚合物的方法，所述方法包含以下步驟 使脂肪細(xì)胞與足夠濃度的測試聚合物接觸以使所述細(xì)胞穩(wěn)定；將所述細(xì)胞/聚合物組合物移植到測試動(dòng)物中；和評估所述移植的成功率。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述測試動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述測試動(dòng)物為裸小鼠。
54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述評估步驟包含評估所述移植細(xì)胞的重量、 體積、細(xì)胞死亡程度、線粒體水平、細(xì)胞凋亡標(biāo)記物、DNA含量或者瘦素或PPAR γ 2水平。
全文摘要
本發(fā)明提供用于防止脂肪移植物中細(xì)胞膜損傷的聚合物。業(yè)內(nèi)認(rèn)為，將諸如泊洛沙姆(poloxymer)P 188等三嵌段共聚物與欲移植到個(gè)體體內(nèi)的脂肪細(xì)胞或脂肪組織混合可使所述細(xì)胞的膜穩(wěn)定，由此在軟組織重建或填充中進(jìn)行較為成功的脂肪移植。所述方法還可用于成體干細(xì)胞或來源于脂肪組織的其它細(xì)胞的移植。也可將諸如硫辛酸等其它試劑添加到所述聚合物/細(xì)胞組合物中以進(jìn)行細(xì)胞移植。
文檔編號A61L31/16GK102245765SQ200980150617
公開日2011年11月16日 申請日期2009年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者威廉·G·小奧斯汀 申請人:通用醫(yī)院公司