專利名稱：新的鑒定刺激stf－1在胰島細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及生物化學(xué)內(nèi)分泌學(xué)、分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)。更具體地說，本發(fā)明涉及鑒定刺激胰島細(xì)胞內(nèi)STF-1表達(dá)的化合物的新方法。
背景技術(shù)：
血液中葡萄糖平衡需要許多神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的協(xié)同作用。胰島被認(rèn)為是哺乳動物體內(nèi)主要的“葡萄糖傳感器”。胰島包含4種細(xì)胞群，經(jīng)鑒定主要是產(chǎn)生胰島素、胰高血糖素、抑生長素或胰腺多肽的細(xì)胞。其中以產(chǎn)生胰島素的b細(xì)胞為主。血清葡萄糖的升高會刺激胰島素的分泌和產(chǎn)生，由此指令特定組織吸收葡萄糖。因此，b細(xì)胞的功能紊亂或損傷會導(dǎo)致血清葡萄糖水平升高，最終發(fā)展成為糖尿病。
遺傳連鎖分析顯示，遺傳因素極大地影響著糖尿病的易患性。例如，至少有18個(gè)基因座在一定程度上與胰島素依賴型糖尿病(IDDM)連鎖。被稱為IDDM2的一種疾病易患基因座包含了人胰島素基因，并被與胰島素啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的改變相關(guān)聯(lián)。因此，胰島素基因表達(dá)的調(diào)控過程受到干擾在一定程度上造成了糖尿病的發(fā)生。與該假設(shè)一致的是，β細(xì)胞功能受損是糖尿病非常常見的特征之非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的發(fā)生被認(rèn)為是外部影響和復(fù)雜的遺傳影響的共同結(jié)果。重要的是，人們已經(jīng)將胰島素基因座本身的等位變異體與糖尿病相關(guān)聯(lián)。這些變異體似乎包含有正常的胰島素基因，但是表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的特性被改變。
據(jù)估計(jì)，約有20,000,000之多的美國人患有非胰島素依賴型(Ⅱ型)糖尿病。疾病的發(fā)展似乎需要環(huán)境因素和某些目前還沒有完全確定的糖尿病易患性基因的共同作用，它們可能造成Ⅱ型糖尿病外周抗胰島素性，此時(shí)，組織不能應(yīng)答胰島素信號來合理使用葡萄糖?；蛘撸z傳因素可能造成這些患者體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的胰腺β細(xì)胞對葡萄糖敏感性降低。以上兩種生理狀態(tài)的最終結(jié)果都是嚴(yán)重的高血糖癥，這是糖尿病的主要特征。
對胰島素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是利用與細(xì)胞特異性葡萄糖敏感信號傳導(dǎo)分子相作用的一小段側(cè)翼DNA獲得的。對該調(diào)控機(jī)構(gòu)的確切性質(zhì)還知之甚少，但一般認(rèn)為，堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和含同源域的因子是指導(dǎo)胰島素的β細(xì)胞特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制中的關(guān)鍵。胰島特異性堿性螺旋-環(huán)-螺旋復(fù)合物與近端的E框(E-box)相互作用，后者又稱Nir,IEB1或ICE；該元件在大鼠胰島素Ⅰ基因中有兩份，但在大鼠胰島素Ⅱ基因和人胰島素基因中只有一份。
產(chǎn)胰島素細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行的瞬時(shí)試驗(yàn)表明，E框結(jié)合因子與結(jié)合附近被稱為FLAT的AT豐富序列的β細(xì)胞特異性蛋白具有協(xié)同作用，所述的序列具有特征性的同源域識別序列。數(shù)個(gè)已鑒定出的同源域蛋白已經(jīng)被證明與FLAT元件結(jié)合，其中包括Isl-1、Imx-1、cdx-3和STF-1。此外，后者與在被稱為P元件的進(jìn)化保守AT豐富序列處的主結(jié)合活性有關(guān)。Isl-l與FLAT元件弱結(jié)合而且似乎不存在于用產(chǎn)胰島素細(xì)胞提取物檢測到的FLAT結(jié)合復(fù)合體中。目前的證據(jù)證明Isl-1更重要的作用在于神經(jīng)發(fā)育方面。同源域因子Imx-1和cdx-3在異源細(xì)胞內(nèi)具有重要的與胰島素啟動子功能有關(guān)的交叉活化特性，但是對于它們的細(xì)胞分布以及在β細(xì)胞內(nèi)的FLAT結(jié)合能力仍然不清楚。而且，直接涉及這些因子在β細(xì)胞系內(nèi)的功能的信息很少。
在具有結(jié)合胰島素啟動子活性的因子中，STF-1可能是真正的胰島素啟動子功能調(diào)控者的最有希望的候選因子。在小鼠中，STF-1最早是在胚胎期第8.5天在形成胰腺的原細(xì)胞的細(xì)胞核中檢測到的，隨后立即在該區(qū)域內(nèi)最早檢測到了胰島素的表達(dá)。在隨后的胰內(nèi)分泌腺的整個(gè)發(fā)育過程中，STF-1和胰島素大量地被共表達(dá)的。此外，在來自產(chǎn)胰島素細(xì)胞系的提取物中，STF-1似乎是胰島素啟動子內(nèi)FLAT和P元件處內(nèi)源性DNA結(jié)合活性的一部分。和根據(jù)FLAT結(jié)合因子所在的預(yù)計(jì)一樣，STF-1也與E框結(jié)合因子Pan-1具有強(qiáng)協(xié)同作用。但是，DNA結(jié)合分析顯示，β細(xì)胞提取物中的其它未知因子對于測得的FLAT結(jié)合活性也有很大的貢獻(xiàn)。人們至今仍然不清楚由FLAT介導(dǎo)的胰島素啟動活性需要全部這些被測得的因子還是只需要其中一部分。
雖然STF-1最早是同時(shí)在發(fā)育中的胰腺的外分泌細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)的，但是STF-1的產(chǎn)生逐漸地局限于產(chǎn)生胰島素和抑生長素的胰島細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，STF-1的作用似乎對于保持抑生長素和胰島素基因的高水平表達(dá)至關(guān)重要。
STF-1識別胰島素啟動子上兩個(gè)已經(jīng)完全確定了的胰島特異性元件，即FLAT和P。當(dāng)STF-1與這些位置結(jié)合時(shí)，它與E47一起刺激胰島素的轉(zhuǎn)錄，后者是識別被稱為Far和Nir的兩個(gè)E框的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白。同樣，STF-1通過被稱為TSEⅠ和TSEⅡ的兩個(gè)胰島特異性元件調(diào)控胰島細(xì)胞內(nèi)抑生長素的表達(dá)。
已發(fā)現(xiàn)同源域蛋白如STF-1，通過確立細(xì)胞或細(xì)胞成份身份而在發(fā)育中起著重要作用。與它們在體內(nèi)的特異性和區(qū)別性作用相反，大多數(shù)同源域蛋白在體外表現(xiàn)出很低的并且重迭的DNA結(jié)合特異性。但是，最近的研究暗示特定的蛋白質(zhì)輔因子決定了體內(nèi)同源域DNA結(jié)合的特異性。例如在果蠅中，人們發(fā)現(xiàn)外小齒(extradenticle)(exd)減弱同源異型蛋白的活性卻不改變它們的表達(dá)方式。更確切的說，外小齒似乎通過加強(qiáng)特定同源域蛋白的DNA結(jié)合特異性來促進(jìn)靶基因的選擇。實(shí)際上，在脊椎動物中，外小齒是高度保守的，與人原癌基因Pbx1具有廣泛的序列相似形(71％)。
發(fā)育過程中細(xì)胞的譜系特異性的定型主要是由許多同源域(HOX)選擇蛋白的相對性表達(dá)決定的，所述的蛋白介導(dǎo)不同基因程序的活化作用。但是各HOX基因如何自身定向以便在不同的細(xì)胞類型中得以表達(dá)的機(jī)制還遠(yuǎn)沒有被揭示過。
脊椎動物的胰腺由內(nèi)分泌腺和外分泌腺構(gòu)成，兩者都來自十二指腸原基內(nèi)共同的祖細(xì)胞(1)。在胰腺的內(nèi)分泌部分，最早表達(dá)多種胰島激素的多能前體細(xì)胞逐步受到限制直至形成構(gòu)成郎氏成熟胰島的4個(gè)細(xì)胞亞群產(chǎn)生胰島素、抑生長素、胰高血糖素和胰多肽的細(xì)胞(2,3)。這些發(fā)育路徑的活化機(jī)制還不清楚，但是目前的證據(jù)暗示同源異型框因子STF-1(IPF-1/IDX-1)是該過程中的一個(gè)主要決定因素。實(shí)際上，發(fā)育過程需要STF-1得到了同源重組研究的支持，在該研究中，針對性地干擾STF-1/IPF-1基因造成胰腺的先天性缺失(4)。
STF-1(又稱Pdx1)的表達(dá)最早可以在胚胎期第8.5天的胰腺原基和多能前體細(xì)胞中檢測到。STF-1同時(shí)在發(fā)育中的胰腺的內(nèi)分泌和外分泌部分瞬時(shí)表達(dá)后逐漸被限制在產(chǎn)生胰島素和抑生長素的胰島細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(5,6)。在這些細(xì)胞內(nèi)，STF-1通過與胰島素和抑生長素基因各自啟動子內(nèi)的功能元件結(jié)合調(diào)控它們的表達(dá)(5,7-16)。
現(xiàn)有技術(shù)缺乏調(diào)控同源域蛋白STF-1在胰腺細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的有效手段。本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域長期以來的這一需求。
發(fā)明概述雖然STF-1是胰腺基因的一種主要調(diào)節(jié)物，但是STF-1的表達(dá)如何自身定向于胰腺細(xì)胞的機(jī)制還不清楚。本發(fā)明證明，STF-1啟動子的一段6.5kb片段足以指導(dǎo)β-半乳糖苷酶報(bào)道基因在轉(zhuǎn)基因小鼠和培養(yǎng)十二指腸細(xì)胞內(nèi)的胰島特異性表達(dá)。在該6.5kb的片段內(nèi)，位于相對于主轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-140位的一個(gè)E框?qū)TF-1啟動子活性尤其重要。該元件被STF-1胰島特異性表達(dá)所必需的上游激活劑識別。實(shí)際上，該STF-1啟動子使在胰島細(xì)胞內(nèi)STF-1定向表達(dá)的活性增加20至100倍。缺失位于-104位的近端的E框使得STF-1在HIT細(xì)胞內(nèi)完全不表達(dá)。而且，抗-USF(上游因子)抗血清抑制C1、C2和C3的形成，這表明這些蛋白質(zhì)是由USF蛋白質(zhì)形成的。
而且，還在轉(zhuǎn)錄起始位置上游600bp的一段530bp區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)STF-1增強(qiáng)子元件。包含該530bp片段的啟動子結(jié)構(gòu)物受地塞米松處理的完全抑制，但是包含遍在USF-1識別位置的基本STF-1啟動子結(jié)構(gòu)物卻不受抑制。該530bp區(qū)域在HIT-T15細(xì)胞內(nèi)的活性比在COS-7細(xì)胞內(nèi)的高5至10倍，這表明該片段具有胰島細(xì)胞特異性活性。所以，在本發(fā)明中STF-1-lacZ融合基因被用于篩選能夠增強(qiáng)胰島細(xì)胞內(nèi)STF-1表達(dá)的化合物。刺激STF-1產(chǎn)生的化合物可加強(qiáng)胰島B細(xì)胞的功能，即胰島素的產(chǎn)生。所以，利用本發(fā)明描述的方法鑒定出的化合物對于因邊緣胰島細(xì)胞功能造成不耐糖的Ⅱ型糖尿病患者尤其有用。
本發(fā)明實(shí)施方式之一提供了一種檢測誘導(dǎo)STF-1轉(zhuǎn)錄的化合物的方法。
用磷酸鈣共沉淀法分離出表達(dá)STF-1/lacZ融合基因的胰島細(xì)胞系。為了檢查各種化合物對STF-1表達(dá)的作用，目標(biāo)化合物被加入表達(dá)STF-1/lacZ融合基因的細(xì)胞中。然后利用比色分析定量檢測對照和經(jīng)處理細(xì)胞內(nèi)的lacZ活性。利用此方法，可以篩選大量的化合物并方便地鑒定出STF-1誘導(dǎo)性化合物。
本發(fā)明實(shí)施方式之二提供了一種利用STF-1體內(nèi)標(biāo)記產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞的方法。其中，綠熒光蛋白(GFP)被用作指示物。如Ogawa等在美國科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.)1995,92:11 899-11903中所述，可以在不干擾細(xì)胞的情況下測得綠熒光蛋白的表達(dá)。為了便于從動物的胰腺回收β細(xì)胞，STF-1啟動子被與編碼GFP的基因融合。給豬引入STF-1-綠熒光蛋白轉(zhuǎn)基因能夠迅速高效地從胰腺中回收產(chǎn)胰島素的細(xì)胞。簡而言之，回收豬的胰腺，然后用膠原酶處理來分散細(xì)胞。利用基于STF-1綠熒光蛋白轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)有效地回收得到產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞。純化的β細(xì)胞群可以被用于對糖尿病患者的細(xì)胞療法。
本發(fā)明的內(nèi)容之一提供了一種測定待測化合物刺激胰島細(xì)胞誘導(dǎo)STF-1轉(zhuǎn)錄的能力的方法，它包括以下步驟提供包含STF-1增強(qiáng)子(具有選自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或它們的片段的序列)、啟動子和同時(shí)受所述STF-1增強(qiáng)子和所述啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的報(bào)道基因的載體，所述的表達(dá)基因能夠使所述的宿主細(xì)胞具有一個(gè)可檢測的信號；將所述的載體轉(zhuǎn)移到所述的宿主細(xì)胞內(nèi)；在待測化合物存在下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞來測定所述待測物質(zhì)刺激所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述的可檢測信號的能力；分析所述的信號來測定所述待測化合物刺激所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述信號的能力，其中所述信號的存在表示所述待測化合物刺激胰島細(xì)胞誘導(dǎo)了STF-1的轉(zhuǎn)錄，沒有所述信號則表示所述待測化合物沒有刺激誘導(dǎo)細(xì)胞誘導(dǎo)STF-1的轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明以此為目的的優(yōu)選實(shí)施方式中，使用的報(bào)道基因是一種酶。在更好的實(shí)施方式中，該酶選自螢光素酶和β-半乳糖苷酶。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述的轉(zhuǎn)移步驟是利用用轉(zhuǎn)染或微注射法將轉(zhuǎn)基因?qū)雱游铩?br> 本發(fā)明的另一目標(biāo)中提供了體內(nèi)標(biāo)記產(chǎn)胰島素胰島細(xì)胞的方法，步驟是它包括提供包含STF-1啟動子和受所述STF-1啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的報(bào)道基因的載體，其中所述的報(bào)道基因能夠使胰島細(xì)胞具有一個(gè)可檢測的信號；將所述的載體作為轉(zhuǎn)基因引入動物胚胎；將所述的胚胎培育成具有胰島細(xì)胞的動物體；分析所述的可檢測信號來測定所述動物的胰島細(xì)胞是否表達(dá)所述的報(bào)道基因，其中信號的存在表示有產(chǎn)胰島素胰島細(xì)胞存在，而沒有信號則表示沒有產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞。
在本發(fā)明以此為目的的優(yōu)選實(shí)施方式中，報(bào)道基因產(chǎn)生熒光蛋白，而且該方法還包括一步利用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)將產(chǎn)胰島素胰島細(xì)胞與非產(chǎn)胰島素胰島細(xì)胞分選開來。
通過對本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的說明，本發(fā)明的其它內(nèi)容、特征和優(yōu)點(diǎn)將更為清楚。
附圖概述為了更詳細(xì)的理解本發(fā)明的上述特征、優(yōu)點(diǎn)和目的是如何獲得的，以下將結(jié)合附圖中表示的特定優(yōu)選實(shí)施方式更具體的說明以上概括的本發(fā)明內(nèi)容。這些附圖屬于說明書的一部分。但是必需指出，


的只是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所以不能理解成對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限定。
圖1顯示STF-1在染色體上的位置。圖1A顯示STF-1基因是由鼠5號染色體遠(yuǎn)端區(qū)域內(nèi)一同源異型框孤獨(dú)基因編碼的，該圖中顯示了STF-1(被稱為“Pdx1”)在5號染色體上相對于其它標(biāo)記的位置。右邊顯示的是厘摩標(biāo)度。左欄所示的是染色體排布所使用的標(biāo)記。STF-1在此稱為Pdx1。
圖2顯示STF-1沒有TATA，使用多轉(zhuǎn)錄起始位置。圖2A顯示了15kb的STF-1基因組克隆的圖示，同時(shí)在上方給出kb標(biāo)尺。所示的有6.5kb的5(側(cè)翼區(qū)4kb的內(nèi)含子和3kb的3(側(cè)翼。IVS表示將外顯子Ⅰ(被打上了陰影并以Ⅰ表示)和Ⅱ(被打上了陰影并以Ⅱ表示)打斷的4kb內(nèi)含子。圖2B顯示STF-1基因5’側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列。利用RNase保護(hù)法(實(shí)心箭頭)和引物的延伸(空心箭頭)制圖測得的轉(zhuǎn)錄起始位置在物理圖譜中以S1(主起始位置，以黑體表示)、S2和S3表示。bHLH/bHLH-ZIP(E框)、CTP/NF-1(CAAT)和C/EBP的潛在上游因子結(jié)合位置被加以下劃線并標(biāo)識了相對于主起始位置的位置。圖2C顯示的是利用反義STF-1RNA探針進(jìn)行的Tu6 RNA(Tu6，泳道2)或?qū)φ战湍竧RNA(酵母，泳道3)的RNase保護(hù)試驗(yàn)。左側(cè)顯示未被消化的探針(泳道1)。圖2D用反義STF-1 RNA引物對酵母(泳道4)、Tu6 mRNA(泳道5)或RIN mRNA(泳道6)進(jìn)行的引物延伸分析結(jié)果。右側(cè)顯示測序梯(GATC，泳道7至10)。RNase保護(hù)產(chǎn)物和引物延伸產(chǎn)物之間的對應(yīng)性是明顯的，還顯示了前三個(gè)起始位置S1、S2和S3(見圖2B底部)。
圖3顯示的是STF-1啟動子的6.5kb片段使得β-半乳糖苷酶報(bào)道基因的表達(dá)定向于轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島細(xì)胞。用Xga1作為生色底物對轉(zhuǎn)基因(上方)和對照(下方)同窩生子的成年胰腺的代表性低溫切片進(jìn)行了lacZ活性評定。箭頭所指為胰島細(xì)胞。
圖4顯示，STF-1啟動子內(nèi)的遠(yuǎn)端和近端元件使得STF-1的表達(dá)定向于胰島細(xì)胞。圖4A顯示與轉(zhuǎn)染到非胰島細(xì)胞(PC12,COS,HeLa)內(nèi)相比，轉(zhuǎn)染到胰島細(xì)胞(βTC3,HIT)內(nèi)后-6500 STF-1螢光素酶報(bào)道質(zhì)粒的活性。一代表性的試驗(yàn)顯示了在以共轉(zhuǎn)染的RSV-CAT對照質(zhì)粒歸一化后，STF-1啟動子相對于在其它細(xì)胞系內(nèi)的在HIT細(xì)胞內(nèi)的活性(100％)。圖4B顯示STF-1螢光素酶啟動子結(jié)構(gòu)物(STFluc)在轉(zhuǎn)染到HIT細(xì)胞內(nèi)后的代表性試驗(yàn)。結(jié)構(gòu)物根據(jù)相對于主轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(S1，見圖2A和2B)的其5’啟動子邊界來命名。圖中顯示的是細(xì)胞核因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)；主轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以實(shí)心箭頭表示。星號表示在遠(yuǎn)側(cè)3kb內(nèi)的未確定的結(jié)合活性。對每個(gè)結(jié)構(gòu)物來說，在以RSV-CAT作為內(nèi)部對照就轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了歸一化后，相對-6500STF Luc(100％)計(jì)算其活性。試驗(yàn)至少重復(fù)4次。
圖5顯示STF-1啟動子內(nèi)的近端E框結(jié)合上游因子USF。圖5A顯示用32P標(biāo)記的-182至-37(145堿基對(bp))的STF-1啟動子片段進(jìn)行的DNaseⅠ保護(hù)試驗(yàn)的結(jié)果。放射自顯影圖顯示不加提取物(泳道1和4)、加HIT或Hela細(xì)胞核提取物(分別為泳道2和3)或加重組USF-1(泳道5)時(shí)的消化圖譜。
圖5B顯示的是與以32P標(biāo)記的包含STF-1E框(-118/-95)(泳道1)的雙鏈寡核苷酸一起孵育的HIT細(xì)胞核提取物的電泳遷移率變化試驗(yàn)。如下所述在結(jié)合反應(yīng)中加入非標(biāo)記的競爭寡核苷酸(摩爾數(shù)過量50倍)STFE是野生型STF-1E框寡核苷酸；STF-E MUT表示在E框內(nèi)的-106(C/A)和-102(T/G)處有替換的突變STF-E寡核苷酸；Ins-1(P)是來自胰島素Ⅰ啟動子的P元件；Gal4表示GAL4識別位置。
左側(cè)的圖5C顯示以STF-E框?yàn)樘结?泳道1)進(jìn)行的HIT細(xì)胞核提取物的凝膠遷移試驗(yàn)的結(jié)果。如圖所述在反應(yīng)中加入U(xiǎn)SF或TFE-3抗體(泳道2和3)。復(fù)合物C1、C2和C3被標(biāo)記了出來。右側(cè)的圖5C顯示的是以STF-E探針進(jìn)行的HIT提取物(泳道1至3)的凝膠遷移試驗(yàn)的結(jié)果。圖中顯示了在結(jié)合反應(yīng)中加入U(xiǎn)SF-1和USF-2特異性抗血清。
圖6顯示，USF與-104E框的結(jié)合對于STF-1啟動子的活性十分重要。圖6A顯示E框突變對于USF結(jié)合活性的影響。用野生型(E-WT)或突變(E-MUT)STF-1E框探針進(jìn)行的HIT細(xì)胞核提取物的凝膠遷移試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)在下方顯示了野生型和突變探針從-106至-102的序列。C1-3即復(fù)合物C1、C2和C3。圖6B顯示E框突變對STF-1啟動子在HIT細(xì)胞內(nèi)活性的影響。結(jié)合圖中顯示了用野生型、突變或缺失(-118/-95)STF-1E框基元轉(zhuǎn)染的HIT細(xì)胞的代表性分析，并結(jié)合了6500bp或190bp的STF-1啟動子的試驗(yàn)結(jié)果。顯示的是在以共轉(zhuǎn)染的RSV-CAT對照質(zhì)粒就轉(zhuǎn)染效率歸一化后相對于野生型-6500STF-1 Luc結(jié)構(gòu)物(100％)的報(bào)道基因活性。試驗(yàn)至少重復(fù)3次。
圖7證明，糖皮質(zhì)素通過STF-1基因5(側(cè)翼區(qū)內(nèi)的一個(gè)胰島特異性增強(qiáng)子抑制STF-1的表達(dá)。
圖7A顯示在用地塞米松(10-7M)或?qū)φ沼靡掖济劫|(zhì)處理HIT-T15 18至24小時(shí)后STF-1啟動子的活性。將-6.2/-5.67STF Luc報(bào)道基因的活性設(shè)定為100％。所有結(jié)構(gòu)物都結(jié)合包含120堿基的5(側(cè)翼區(qū)(近端側(cè)翼區(qū))的STF-1螢光素酶載體(STF-1 Luc)進(jìn)行評價(jià)。插在STF-1 Luc報(bào)道基因內(nèi)的STF-1序列以核苷酸編號表示。例如，-6.5/-6.2STF Luc包含與近端的120堿基5(側(cè)翼區(qū)融合的-6500至-6200的STF-1序列。包含激活元件的遠(yuǎn)側(cè)區(qū)以橢圓和方框表示，基本STF-1啟動子以一矩形表示。還顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差立柱。試驗(yàn)至少重復(fù)3次。用共轉(zhuǎn)染的CMV-(gal對照質(zhì)粒將STF-1報(bào)道基因的活性全部歸一化為轉(zhuǎn)染效率。
圖7B(上方)顯示的是STF-1報(bào)道基因結(jié)構(gòu)物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HIT T15細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果。包含6500堿基的5(側(cè)翼區(qū)的-6500STF Luc的活性被設(shè)定為100％。各試驗(yàn)一式兩份，至少重復(fù)4次。圖中顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差(下方)。圖中顯示了STF-1螢光素酶報(bào)道質(zhì)粒在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞內(nèi)后的活性。啟動子活性被歸一化為CMV-(gal對照活性，以便直接比較HIT細(xì)胞內(nèi)的STF-報(bào)道基因活性。
圖7C顯示的是STF-1基因內(nèi)從-6.2kb至-5.67kb的基本胰島特異性增強(qiáng)子的核苷酸序列。HNF-3和E框結(jié)合基元是黑體的并且加有下劃線。
圖8證明，STF-1基因內(nèi)的胰島特異性增強(qiáng)子包含HNF-3(和BETA-2的結(jié)合位置。
圖8A顯示的是用來自大鼠STF-1啟動子-5870至-6100的32P標(biāo)記的STF-1探針進(jìn)行的HIT T15胰島細(xì)胞、Hela或COS-7細(xì)胞的細(xì)胞核粗提取物的DNaseⅠ保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果。NONE；不加提取物的對照反應(yīng)；HNF-3(；用重組蛋白進(jìn)行的反應(yīng)。
圖8B顯示的是來自Hela、HepG2、產(chǎn)胰高血糖素的(TC或產(chǎn)胰島素的HIT或RIN細(xì)胞系(如在各泳道上方所示)的細(xì)胞核提取物的凝膠遷移率變化試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)是用包含H元件的32P標(biāo)記的STF-1寡核苷酸探針進(jìn)行的。下方顯示了野生型(WT)和突變(MT)H元件的核苷酸序列。如泳道上所示，加入了過量100倍的非標(biāo)記的野生型或突變的競爭DNA。
圖8C顯示的是用32P標(biāo)記的-5907至-5927的STF-1H元件探針進(jìn)行的來自HIT胰島瘤(HIT NE)和原代培養(yǎng)的成年大鼠胰島細(xì)胞(ISLET NE)的細(xì)胞核粗提取物的凝膠遷移率變化試驗(yàn)。如每根泳道上方所示，在反應(yīng)中加入了HNF3(，(，或((抗血清。-；沒有加入抗血清。Ⅰ和Ⅱ分別是蛋白質(zhì)-DNA和抗體超變(supershifted)復(fù)合物。
圖8D顯示的是用以32P標(biāo)記STF-1啟動子內(nèi)從-5963至-5981的B元件探針進(jìn)行的來自HIT T15細(xì)胞的粗細(xì)胞核提取物的凝膠遷移率變化分析結(jié)果。在每根泳道上顯示在結(jié)合反應(yīng)中加入了BETA-2、E2A或STF-1抗血清。如圖所示，加入了過量100倍的非標(biāo)記的野生型(WT:5(-TCAGTGACAGATGGAGTCCT-3()或突變的(MT:5(-TCAGTGAAAGACGGAGTCCT-3()競爭DNA。泳道7中顯示了來自以BETA-2和E-47cDNA程序化的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的結(jié)合活性。泳道7的最上方是網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物原來的位置。
圖9證明，糖皮質(zhì)素通過抑制HNF-3對胰島特異性增強(qiáng)子的活性而抑制STF-1的表達(dá)。
圖9A顯示STF-1報(bào)道質(zhì)粒在HIT T15胰島瘤細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果。包含基本胰島特異性增強(qiáng)子(-6200至-5700)的-6.2/-5.7STF Luc結(jié)構(gòu)物的活性被設(shè)定為100％。在H元件和B元件內(nèi)含有點(diǎn)突變的結(jié)構(gòu)物以橢圓或方框內(nèi)加X表示，這些突變干擾HNF-3(與BETA2/E2A的結(jié)合。點(diǎn)突變與在凝膠遷移變化分析中使用的E框和H元件突變相對應(yīng)(見圖8)。
圖9B顯示在對照(-)和地塞米松處理(+)的HIT-IT15細(xì)胞內(nèi)HNF-3(過量表達(dá)對野生型(陰影立柱)和H元件突變(空白立柱)的STF-1報(bào)道基因活性的影響。以含有基本胰島特異性增強(qiáng)子(-6200至-5700)的-6.2/-5.7STF Luc結(jié)構(gòu)物在對照細(xì)胞內(nèi)的活性為100％。圖中顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差立柱。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次。
圖9C顯示提高HNF-3(效應(yīng)質(zhì)粒的水平對野生型STF-1(-6500STF-1 LUC)報(bào)道質(zhì)粒在HIT-IT15細(xì)胞內(nèi)活性的影響。在各立柱下標(biāo)明了HNF-3(效應(yīng)質(zhì)粒的量，以(g為單位。利用空載CMV表達(dá)載體進(jìn)行補(bǔ)足以保持效應(yīng)質(zhì)粒的總量在各試驗(yàn)中保持不變。圖中標(biāo)明了對照(ETOH)和地塞米松(DEX)處理的細(xì)胞。
詳細(xì)說明本發(fā)明證明，在胰腺的形態(tài)發(fā)生和體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)定中起作用的一種同源域蛋白STF-1是由位于鼠5號染色體上的一“孤單”同源異型框基因編碼的。當(dāng)來自STF-1基因的一段6.5kb的5’側(cè)區(qū)基因組片段與β-半乳糖苷酶報(bào)道基因融合時(shí)，它在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)表現(xiàn)出胰島特異性活性。STF-1啟動子內(nèi)兩個(gè)獨(dú)特的元件為胰島限制性表達(dá)所必需位于-3至-6.5kb之間的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子序列和位于-104處的近端E框序列，后者主要被由堿性螺旋環(huán)螺旋(bHLH)/亮氨酸拉鏈(ZIP)細(xì)胞核因子USF識別。由于-104E框內(nèi)的點(diǎn)突變干擾USF的結(jié)合從而降低了STF-1啟動子的活性，所以，本發(fā)明證明，USF是將STF-1表達(dá)定向于胰島細(xì)胞的調(diào)控機(jī)構(gòu)中的重要組成部分。而且，我們還發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)素強(qiáng)效抑制STF-1的表達(dá)，這是通過抑制識別兩個(gè)內(nèi)胚層因子HNF-3(和BETA2/E47的遠(yuǎn)端胰島特異性增強(qiáng)子的活性。由此，抑制HNF-3(或BETA2/E47結(jié)合的增強(qiáng)子內(nèi)的突變將干擾STF-1啟動子的活性。-HNF-3(表達(dá)載體恢復(fù)經(jīng)糖皮質(zhì)素處理的細(xì)胞內(nèi)STF-1增強(qiáng)子活性的能力證明，HNF-3(的確是STF-1表達(dá)中重要的調(diào)節(jié)物。
本發(fā)明目的之一是提供測試誘導(dǎo)STF-1轉(zhuǎn)錄的化合物的方法。用磷酸鈣共沉淀法來分離表達(dá)STF-1/lacz融合基因的胰島細(xì)胞系。為了檢測各種化合物對STF-1表達(dá)的作用，目標(biāo)化合物被加入到STF-1/lacZ表達(dá)細(xì)胞中。用比色試驗(yàn)定量檢測對照和經(jīng)處理細(xì)胞內(nèi)的LacZ活性。利用此方法，可以對大量的化合物進(jìn)行篩選并方便地鑒定出STF-1誘導(dǎo)性化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供用STF-1啟動子體內(nèi)標(biāo)記產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞的方法。此處，綠熒光蛋白(GFP)被用作目測指示物。如Ogawa等在美國科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.)1995,92:11899-11903中所述，可以在不干擾細(xì)胞的情況下測得綠熒光蛋白的表達(dá)。為了便于從動物的胰腺回收β細(xì)胞，將STF-1啟動子與編碼GFP的基因融合。給豬引入STF-1-綠熒光蛋白轉(zhuǎn)基因能夠迅速高效地從胰腺中回收產(chǎn)胰島素的細(xì)胞。簡而言之，回收豬的胰腺，然后用膠原酶處理來分散細(xì)胞。利用基于STF-1綠熒光蛋白轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)能夠有效地回收得到產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞。純化的β細(xì)胞群可以被用于對糖尿病患者的細(xì)胞療法。
本發(fā)明的內(nèi)容之一提供了一種測定待測化合物刺激胰島細(xì)胞誘導(dǎo)STF-1轉(zhuǎn)錄的能力的方法，它包括以下步驟提供包含STF-1增強(qiáng)子(具有選自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或它們的片段的序列)、啟動子和同時(shí)受所述STF-1增強(qiáng)子和所述啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的報(bào)道基因的載體，所述的報(bào)道基因能夠使所述的宿主細(xì)胞具有可檢測的信號；將所述的載體轉(zhuǎn)移到所述的宿主細(xì)胞內(nèi)；在待測化合物存在下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞來測定所述待測物質(zhì)刺激所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述的可檢測信號的能力；分析所述的信號，測定所述待測化合物刺激所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述信號的能力，其中所述信號的存在表示所述待測化合物刺激胰島細(xì)胞誘導(dǎo)了STF-1的轉(zhuǎn)錄，沒有所述信號則表示所述待測化合物沒有刺激胰島細(xì)胞誘導(dǎo)STF-1的轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明以此為目的的優(yōu)選實(shí)施方式中，使用的報(bào)道基因是一種酶。在更好的實(shí)施方式中，該酶選自螢光素酶和β-半乳糖苷酶。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述的轉(zhuǎn)移步驟是利用將轉(zhuǎn)基因?qū)雱游锏霓D(zhuǎn)染或微注射法。
本發(fā)明的另一目的提供了體內(nèi)標(biāo)記產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞的方法，它包括提供包含STF-1啟動子和受所述STF-1啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的報(bào)道基因的載體，其中所述的報(bào)道基因能夠使胰島細(xì)胞具有一個(gè)可檢測的信號；將所述的載體作為轉(zhuǎn)基因引入動物胚胎；將所述的胚胎培育成具有胰島細(xì)胞的動物體；分析所述的可檢測信號來測定所述動物的胰島細(xì)胞是否表達(dá)所述的報(bào)道基因，其中信號的存在表示有產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞存在，而沒有信號則表示沒有產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞。
在本發(fā)明以此為目的的優(yōu)選實(shí)施方式中，報(bào)道基因產(chǎn)生熒光蛋白，而且還包括一步利用熒光激活細(xì)胞合類術(shù)(FACS)將產(chǎn)胰島素胰島細(xì)胞與非產(chǎn)胰島素胰島細(xì)胞分選開來。
人基因組含有4個(gè)基因簇，被稱為Hox或同源異型選擇者基因，它們是胚胎發(fā)生過程中中軸體圖式形成(axial body pattern formation)的關(guān)鍵決定子(Krumlauf,1994，細(xì)胞(Cell)78:191-201)。4個(gè)基因簇各含13個(gè)基因，一個(gè)基因簇內(nèi)的一個(gè)特定基因通常與另三族中的成員之一具有特別高的同源性。這樣的相關(guān)基因被稱為共生同源基因；因此，HoxA1、HoxB1、HoxC1和HoxD1都是密切相關(guān)的共生同源基因，各自位于不同染色體的不同Hox基因簇內(nèi)。HoxB復(fù)合物在17號染色體的長臂上，例如，已經(jīng)鑒定出了HoxB1至HoxB9。
胰島素基因的葡萄糖依賴性調(diào)節(jié)作用似乎是與葡萄糖介導(dǎo)的胰島素分泌增加相伴發(fā)生的。部分原因可能是細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。此外，葡萄糖應(yīng)答性胰島素啟動子的功能可能至少在一定程度上通過FLAT結(jié)合蛋白的活性來調(diào)節(jié)。HoxBl3以高親和性和功能上十分重要的胰島素啟動子的FLAT元件結(jié)合。此外，HoxBl3和胰島素ICE/Nir元件-結(jié)合因子Pan-1在一同加入時(shí)強(qiáng)效活化胰島素啟動子。這與以下發(fā)現(xiàn)是一致的，即FLAT和Nir元件在產(chǎn)胰島素細(xì)胞內(nèi)以協(xié)同方式發(fā)揮作用。總之，以上信息表明，鈣依賴性信號發(fā)生路徑可能調(diào)控著HoxB13的功能。
本發(fā)明可能用到本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。在文獻(xiàn)中對這些技術(shù)有祥盡的說明?？蓞⒁娎鏜aniatis,Fritsch & Sambrook“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(1982)”(“Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)”)；“DNA克隆實(shí)踐方法”(“DNA Cloning:A Practical Approach”)第Ⅰ卷和第Ⅱ卷(D.N.Glover編輯，1985)；“寡核苷酸合成法”(“OligonucleotideSynthesis”)(M.J.Gait編輯，1984)；“核酸雜交”(“Nucleic AcidHybridization”)(B.D.Hames & S.J.Higgins編輯，1985)；“轉(zhuǎn)錄和翻譯”(“Transcription and Translation”)(B.D.Hames & S.J.Higgins編輯，1984)；“動物細(xì)胞培養(yǎng)”(“Animal Cell Culture”)(R.I.Freshney編輯，1986)；“固定化細(xì)胞和酶”(“Immobilized Cells and Enzymes”)(IRL出版社，1986)；B.Perbal，“分子克隆的實(shí)踐指導(dǎo)”(“A Practical Guide To Molecular Cloning”)1984。
所以，本文中出現(xiàn)的下列術(shù)語具有以下定義。
“載體”指質(zhì)粒、噬菌體或粘粒之類的復(fù)制子，在上面可以連接其它DNA片段，從而使連接上去的片段得以復(fù)制。
“DNA分子”指單鏈或雙鏈螺旋形式的多聚脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)。它只涉及分子的初級和次級結(jié)構(gòu)，不限定任何一種三級形式。所以，它包括除了線性DNA分子(例如限制性片段)內(nèi)之外，病毒、質(zhì)粒和染色體內(nèi)的雙鏈DNA。本文在論述結(jié)構(gòu)時(shí)，按照常規(guī)只給出從5’至3’端的非轉(zhuǎn)錄DNA序列(即序列與mRNA一樣的鏈)。
“復(fù)制起始點(diǎn)”指參與DNA合成的那些DNA序列。
DNA“編碼序列”是處于正確的調(diào)控序列調(diào)控下時(shí)在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的雙鏈DNA序列。編碼序列的邊界由位于5’(氨基)末端的起始密碼子和位于3’(羧基)末端的翻譯中止密碼子確定。編碼序列可以包括但不限于原核序列、來自真核mRNA的cDNA、來自真核(例如哺乳動物的)DNA的基因組DNA和合成DNA序列。聚腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄中止信號通常位于編碼區(qū)的3’末端。
轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列和翻譯調(diào)控序列是DNA調(diào)控序列，例如啟動子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號、終止子等，它們?yōu)榫幋a序列在宿主細(xì)胞的表達(dá)所需。
“啟動子序列”是能夠在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合RNA聚合酶并引發(fā)下游(3’方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。為了定義本發(fā)明，啟動子序列在其3’末端以轉(zhuǎn)錄起始位置為界，向上游(5’方向)延伸，直至將引發(fā)高于背景的可測水平的轉(zhuǎn)錄所需的最小數(shù)量的堿基或元件包含在內(nèi)。在啟動子序列內(nèi)有轉(zhuǎn)錄起始位置(一般用核酸酶S1通過物理圖譜來確定)，以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白質(zhì)結(jié)合域(共有序列)。真核啟動子常常但不總是包含“TATA”框和“CAT”框。原核啟動子除了-10和-35共有序列之外還包含Shine-Dalgarno序列。
“表達(dá)調(diào)控序列”是控制和調(diào)節(jié)其它DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。當(dāng)RNA聚合物酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，后者再被翻譯成由編碼序列編碼的蛋白質(zhì)時(shí)，編碼序列即“受到轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的調(diào)控”。
“信號序列”可以被包含在編碼序列之前。該序列編碼一段位于多肽的N末端的信號肽，它與宿主細(xì)胞進(jìn)行交流，將多肽導(dǎo)向細(xì)胞的表面，或者將多肽分泌到介質(zhì)中，而且，該信號肽在蛋白質(zhì)離開細(xì)胞之前被宿主細(xì)胞切除。信號肽被發(fā)現(xiàn)與許多原核和真核生物特有的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。
“寡核苷酸”，例如在指本發(fā)明的探針時(shí)，其定義為包含兩個(gè)或兩個(gè)以上核糖核苷酸的分子，最好有8個(gè)以上。其確切大小取決于許多因素，這些因素又取決于寡核苷酸的最終功能和用途。
“引物”在此指以天然形式存在(象在純化的限制性消化產(chǎn)物中那樣)或者以合成法生成的這樣一段寡核苷酸，它在處于誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物合成的條件下時(shí)，能夠作為合成起始位點(diǎn)，所述的引物延伸產(chǎn)物是與一段核酸鏈互補(bǔ)的，所述的條件即在核苷酸和例如DNA聚合酶的誘導(dǎo)劑的存在下并且處于合適的溫度和pH下。引物即可以是單鏈也可以是雙鏈，但是必須足夠長，以便在誘導(dǎo)劑的存在下引發(fā)所需的延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度取決于許多因素，其中包括溫度、引物來源和所用的方法。例如，對于診斷用途來說，根據(jù)目標(biāo)序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物一般包含15至25個(gè)或更多個(gè)核苷酸，雖然它也可能包含少于上述數(shù)量的核苷酸。
本文中的引物經(jīng)選擇與不同的目標(biāo)DNA序列鏈“基本上”互補(bǔ)。這意味著引物必須具有足夠的互補(bǔ)性來與它們對應(yīng)的鏈雜交。所以，引物序列不必反映出模板的確切序列。例如，非互補(bǔ)性核苷酸片段可以連接在引物的5’末端，而引物的其余序列與模板鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的。或者，非互補(bǔ)性堿基或更長的序列可以插在引物中間，只要引物序列與模板序列具有足夠的互補(bǔ)性或者與它雜交，并由此形成合成延伸產(chǎn)物所需的模板。
“限制性內(nèi)切酶”和“限制性酶”都指細(xì)菌酶，都在或接近一段特定核苷酸序列處切斷雙鏈DNA。
當(dāng)外源或異源DNA被引入到細(xì)胞內(nèi)部后，則細(xì)胞被所述的DNA“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化DNA可能也可能不被整合(共價(jià)連接)到細(xì)胞的基因組內(nèi)。在例如原核細(xì)胞、酵母和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化DNA可能保持在例如質(zhì)粒的游離元件上。就真核生物而言，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是指轉(zhuǎn)化DNA整合到染色體內(nèi)從而通過染色體復(fù)制被子代細(xì)胞繼承的細(xì)胞。真核細(xì)胞能夠建立由包含轉(zhuǎn)化DNA的子代細(xì)胞群構(gòu)成的細(xì)胞系或克隆證明了這種穩(wěn)定性?！翱寺　笔怯蓡蝹€(gè)細(xì)胞或共同的祖先通過有絲分裂得到的一群細(xì)胞。“細(xì)胞系”是能夠在體外穩(wěn)定繁殖許多代的原代細(xì)胞的克隆。
當(dāng)確定長度的DNA序列上有至少約75％的核苷酸相互匹配(至少約80％更好，至少約90或95％則最好)，則兩段DNA序列“基本同源”?；就吹男蛄锌梢岳每稍谛蛄行畔熘蝎@得的標(biāo)準(zhǔn)軟件通過序列比較來鑒定，或者在就具體系統(tǒng)而言的嚴(yán)謹(jǐn)條件下的Southern雜交實(shí)驗(yàn)來鑒定。確定合適的雜交條件是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。參見例如Maniatis等，見上文；DNA克隆，第Ⅰ和第Ⅱ卷，見上文；核酸雜交，見上文。
DNA結(jié)構(gòu)物的“異源”區(qū)是一段大DNA分子內(nèi)的一段可鑒定DNA片段，后者并不天然地與所述的大分子相關(guān)聯(lián)。所以，當(dāng)異源區(qū)編碼哺乳動物基因時(shí)，該基因兩側(cè)的DNA通常不是在哺乳動物基因組來源生物內(nèi)位于該基因組DNA兩側(cè)的DNA。在另一實(shí)例中，編碼序列是一種結(jié)構(gòu)物，其中的編碼序列本身并不天然存在(例如cDNA，其基因組編碼序列包含內(nèi)含子，或者是具有不同于天然基因的密碼子的合成序列)。等位變異或天然突變都不產(chǎn)生上述DNA異源區(qū)。
此類研究最常用的標(biāo)記是放射性元素、酶、在接觸紫外光時(shí)會發(fā)熒光的化學(xué)物質(zhì)等。大量熒光物質(zhì)是已知的，可以用作標(biāo)記。其中包括例如熒光素、羅丹明、auramine、Texas紅、AMCA藍(lán)和螢光黃。一種特殊的檢測材料是在山羊中制備并與熒光素通過異硫氰酸酯共價(jià)結(jié)合的的抗兔抗體。
同樣，也可以使用酶標(biāo)記，而且可以用目前使用的比色法、分光光度法、熒光分光光度法、電流分析法或氣體分析法中的任何一種來檢測。酶通過與碳化二亞胺、二異氰酸酯、戊二醛等橋連分子反應(yīng)與選定的粒子共軛。已知有許多酶可以用于此方法。其中較好的是過氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加過氧化物酶以及堿性磷酸酶。例如，美國專利3,654,090，3,850,752和4,016,043還公開了其它標(biāo)記材料和方法。
以下實(shí)施例是為了說明本發(fā)明的各種實(shí)施方式，而不是對本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1染色體的制圖使用Jackson Laboratoray的(B6×SPRET)F1×SPRET回交DNA系列，以32P標(biāo)記的STF-1cDAN片段為探針，進(jìn)行STR-1基因的染色體制圖。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因鼠的產(chǎn)生和β-半乳糖苷酶染色。
用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)構(gòu)建在β-半乳糖苷酶報(bào)道基因之前包含6500堿基對(bp)的上游STR-1序列的融合基因，并將它注入受精卵母細(xì)胞的精核中。利用Southern印記法和PCR擴(kuò)增鑒定出鼠建立者(foundermice)。在20μM的低聚甲醛固定化組織切片上以X-gal為生色底物對轉(zhuǎn)基因組織中STR-1/β-半乳糖苷酶融合基因的表達(dá)進(jìn)行評價(jià)。
實(shí)施例3抗體超變(supershift)實(shí)驗(yàn)中使用的無差別STR-1、2抗體是購自Santa CruzBiothchnology。TFE3抗體是K.Jones提供的。特異性識別USF-1或USF-2的抗體是M.Sawadogo提供的。(17,18)實(shí)施例4STF-1基因組克隆的分離以32P標(biāo)記的STF-1cDNA片段作為雜交探針從EMBL3大鼠基因組文庫中分離出STF-1基因。將STF-1陽性基因組片段亞克隆到SKⅡ質(zhì)粒(Strategene)的EcoRⅠ位置內(nèi)。
實(shí)施例5RNase保護(hù)和引物的延伸用Oligotex(dT)30系統(tǒng)(Quiagen)制備聚A+RNA。用于引物延伸分析的寡核苷酸用γ-32P ATP和T4聚核苷酸激酶標(biāo)記其5’末端。5μg聚A+RNA和末端標(biāo)記的反義引物一起在80℃孵育5分鐘，然后在42℃孵育16小時(shí)。引物延伸反應(yīng)用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶在37℃進(jìn)行1小時(shí)，產(chǎn)物在5％變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分析。用25μg從Tu6細(xì)胞中抽提的總RNA進(jìn)行RNase保護(hù)分析(19)。利用一段相對翻譯起始位置-185至+93位的STF-1基因組片段產(chǎn)生反義STF-1RNA探針。用T7RNA聚合酶和32P-UTP體外合成32P標(biāo)記的反義STF-1RNA。STF-1反義RNA探針和mRNA在80℃退火5分鐘，然后在65℃孵育16小時(shí)。退火反應(yīng)系然后在室溫下以40μg/ml RNase處理1小時(shí)，以5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析消化產(chǎn)物。
實(shí)施例6報(bào)道基因克隆和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染啟動子片段都被利用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)克隆到D.Helinski提供的P(A)3螢光素酶骨架中(20)。來自STF-1啟動子的5’側(cè)翼序列在相對主轉(zhuǎn)錄起始位置的+68位(-6500 STF Luc,-3500 STF Luc,-450 STF Luc,-410 STF Luc,-225 STF Luc,-140 STF Luc)或+78位(-190 STF Luc,-130 STF Luc,-120 STF Luc,-95 STF Luc,-35STF Luc)與螢光素酶基因融合。利用磷酸鈣沉淀法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HIT-IT15細(xì)胞(ATCC)、βTC 3(D.Hanahan(21)提供)、PC12、COS和HeLa細(xì)胞內(nèi)。在單光發(fā)光計(jì)上定量測定螢光素酶值，并歸一化成由共轉(zhuǎn)染的RSV-CAT內(nèi)部對照質(zhì)粒得出的CAT活性。
實(shí)施例7凝膠變化試驗(yàn)和DNase保護(hù)試驗(yàn)為了用于電泳遷移率變化試驗(yàn)，寡核苷酸探針利用Klenow片段通過補(bǔ)平反應(yīng)以α32P-dCTP進(jìn)行標(biāo)記。4μg細(xì)胞核提取物與0.5納克(ng)32P標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸一起孵育并按照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(9)。為了進(jìn)行超變分析，蛋白質(zhì)預(yù)先與抗體一起孵育，然后與放射性雙鏈寡核苷酸一起孵育，然后電泳。按照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行DNase保護(hù)試驗(yàn)(22)。
用HP ScanJet 3C掃描原始照片，然后在Macintosh上用Canvas軟件編輯成DNA結(jié)合試驗(yàn)圖。掃描后的圖像被復(fù)制在Tektronix PhaserⅡSDX上。
實(shí)施例8STF-1基因的染色體定位和基因組組構(gòu)用STF-1cDNA作為Jackson Laboratory的DNA回交系列的雜交探針，單拷貝的STF-1基因在物理圖上位于鼠5號染色體的遠(yuǎn)端(圖1A)。沒有發(fā)現(xiàn)具有遠(yuǎn)端標(biāo)記Pmv12或Iapls3-9的重組體，但是發(fā)現(xiàn)了6個(gè)具有更遠(yuǎn)的Actb基因組的重組體(圖1B)。以上結(jié)果預(yù)示，STF-1基因?qū)⑾鄳?yīng)地存在于大鼠的14號染色體和人染色體7q上，在與4個(gè)同源異型基因簇都不相應(yīng)的基因座上。以上結(jié)果顯示，STF-1基因應(yīng)該被歸為“孤獨(dú)”同源異型框基因。
為了分離編碼STF-1的基因，用32P標(biāo)記的STF-1cDNA探針篩選來自大鼠EMBL3基因組文庫的106個(gè)噬菌體克隆，得到2個(gè)含有15kb的基因組插入片段的陽性克隆。除了6.5kb的5’側(cè)翼和3.5kb的3’側(cè)翼序列，該15kb的STF-1基因組片段還包含完整的STF-1編碼區(qū)，該區(qū)內(nèi)緊靠同源異型框(氨基酸140-215)上游(Ala 135)插有一個(gè)4kb的內(nèi)含子(圖2A)。
STF-1基因組克隆中5’側(cè)翼內(nèi)的共有TATA框和起始序列(圖2B)缺失。接著，對該基因的轉(zhuǎn)錄起始位置進(jìn)行制圖。利用對來自產(chǎn)胰島素細(xì)胞系RIN和Tu6的mRNA進(jìn)行的RNase保護(hù)和引物延伸分析，鑒定出了三個(gè)主起始位置，分別被稱為S1、S2和S3，它們位于翻譯起始位置上游第91、107和120/125核苷酸。還發(fā)現(xiàn)了位于翻譯起始位置上游137個(gè)核苷酸處的第4個(gè)次轉(zhuǎn)錄起始位置。和其它沒有TATA框的啟動子一樣，該STF-1啟動子在S1和S2起始位置上游30bp處含有G/A和G/C豐富區(qū)。(23-25)實(shí)施例9STF-1啟動子在胰島細(xì)胞內(nèi)的活性為了確定STF-1基因5’側(cè)翼內(nèi)的序列是否足以使得STF-1的表達(dá)以胰島細(xì)胞為目標(biāo)，6500bp的STF-15’側(cè)翼序列與β-半乳糖苷酶基因融合，并測定該STF-1-lacz報(bào)道基因在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)的表達(dá)。以x-gal為生色底物，在來自三種各自獨(dú)立的建立系的轉(zhuǎn)基因胰島中檢測到了β-半乳糖苷酶活性，但是在同窩生的對照中沒有檢測到(圖3A)。
與目前所述的內(nèi)源性STF-1蛋白的表達(dá)方式一樣，在轉(zhuǎn)基因鼠的外分泌腺細(xì)胞(圖3B)和例如肝和腎的非胰島組織中(未示)沒有檢測到明顯的β-半乳糖苷酶活性。與報(bào)道中內(nèi)源性STF-1基因在十二指腸中的表達(dá)一樣(8,13)，以反義β-半乳糖苷酶RNA為探針進(jìn)行的原位雜交研究也揭示了在轉(zhuǎn)基因動物的十二指腸上皮細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(未示)。以上結(jié)果表明，6500bp的STF-1啟動子足以使得STF-1的表達(dá)定向于胰島和十二指腸細(xì)胞。
為了確定使STF-1表達(dá)定向于胰島細(xì)胞的功能元件，在兩個(gè)不同的胰島細(xì)胞系(βTC3,HIT)中對-6500STF Luc報(bào)道基因的活性進(jìn)行了檢查。正如根據(jù)轉(zhuǎn)基因小鼠得出的結(jié)果所作的預(yù)計(jì)，STF-1報(bào)道基因在這些胰島細(xì)胞中表現(xiàn)出比在例如HeLa、PC12和COS的非胰島細(xì)胞系中強(qiáng)20至100倍的活性(圖4)。相反，STF-1的4kb內(nèi)含子和3’側(cè)翼區(qū)當(dāng)被插入在基本SV40 CAT啟動子質(zhì)粒中時(shí)，沒有顯示出這樣的活性(未示)，這表明是6.5kb的STF-1啟動子片段專門負(fù)責(zé)將STF-1的表達(dá)定向于胰島細(xì)胞。
為了描述提供胰島細(xì)胞表達(dá)特性的STF-1啟動子內(nèi)的序列，制造了一系列的5’缺失結(jié)構(gòu)物，并通過向HIT細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染對這些報(bào)道基因進(jìn)行了分析(圖4B)。從-6500STF-1報(bào)道基因結(jié)構(gòu)物中缺失掉-6500至-3500bp序列使得STF-1報(bào)道基因的活性降低了4倍，這表明在該區(qū)域內(nèi)存在著遠(yuǎn)端活化序列。進(jìn)一步將STF-1啟動子從-3500bp對截短至-190bp不明顯影響報(bào)道基因在HIT細(xì)胞內(nèi)的活性(圖4B)。但是，缺失STF-1啟動子內(nèi)-190至-95bp的序列嚴(yán)重減弱了啟動子在HIT細(xì)胞內(nèi)的活性，這表明STF-1功能還需要一個(gè)近端元件。對STF-1啟動子-190至-95區(qū)內(nèi)序列的檢視發(fā)現(xiàn)了3個(gè)共有E框基元(圖2A)。雖然去除位于-177的兩個(gè)雙聯(lián)E框不降低啟動子的活性，但是缺失掉位于-104(-95 STF luc)的近端E框完全消除了STF-1在HIT細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
實(shí)施例10STF-1啟動子內(nèi)的近端E框識別含USF復(fù)合物為了確定與STF-1啟動子內(nèi)功能元件結(jié)合的上游因子，用來自HIT和HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核提取物進(jìn)行了DNaseⅠ保護(hù)試驗(yàn)(圖5)。在兩種提取物中都發(fā)現(xiàn)了一個(gè)主要的足跡蛋白活性，其邊界與在功能上十分重要的近端E框一致(-118/-95)。為了在HIT和HeLa細(xì)胞核提取物中進(jìn)一步確定與重要的-104E框基元結(jié)合的蛋白而進(jìn)行了凝膠遷移率變化試驗(yàn)。用從-118至-95的一段雙鏈STF-1寡核苷酸，用兩種細(xì)胞核提取物都發(fā)現(xiàn)了3種復(fù)合物，稱為C1、C2和C3(圖5B，右面，泳道1和4)。在結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，C1、C2和C3的形成被過量50倍的非標(biāo)記STF-1E框競爭寡核苷酸所抑制。但是，突變E框寡核苷酸或非特異性競爭DNA對它們的結(jié)合活性沒有影響，這表明C1、C2和C3確實(shí)對STF-1E框序列具有特異性(圖5B)。HeLa和HIT提取物中的這些聚合物在圖式上沒有質(zhì)的差異(未示)，這表明-104E框可能識別在兩種細(xì)胞中類似表達(dá)的因子。
以前的報(bào)道證明，E框(例如-118/-95STF-1基元(CACGTG))優(yōu)選結(jié)合bHLH-ZIP蛋白例如myc、max、TFE-3和USF。我們對C1、C2或C3復(fù)合物中是否含有上述候選蛋白進(jìn)行了檢查(26,27)。因?yàn)?118/-95E框結(jié)合蛋白具有耐熱變性的能力(未示)，所以我們檢查熱穩(wěn)定上游因子USF是否是C1、C2或C3的組成部分(28)。值得注意的是，在凝膠遷移率變化反應(yīng)中加入抗USF抗血清抑制了所有3中復(fù)合物的形成(圖5C)。但是抗TFE-3抗血清對C1、C2或C3復(fù)合物沒有影響，這表明這些復(fù)合物很可能是由USF蛋白形成的。在凝膠變化試驗(yàn)中，重組USF-1產(chǎn)生了一種蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，它和復(fù)合物C2在相同的相對位置發(fā)生遷移(未示)。而且，在DNaseⅠ保護(hù)研究中，重組USF-1足跡蛋白活性與在HIT提取物中觀察到的一樣(圖5A)。
兩種USF,USF-1和USF-2似乎在大多數(shù)細(xì)胞類型中都表達(dá)(18)。為了分辨出這些USF蛋白中哪種包含在C1、C2和C3復(fù)合物內(nèi)，將HIT或HeLa提取物與抗USF-1特異性抗血清或抗USF-2特異性抗血清一起孵育(圖5D)。雖然USF-1抗血清能夠“超變”所有3中復(fù)合物，但是USF-2特異性抗血清只抑制C1和C3復(fù)合物的形成。以上結(jié)果表明，C1和C3復(fù)合物對應(yīng)于USF-1/USF-2異二聚體，而C2含有USF-1同源二聚體。
為了證實(shí)CACGTG E框序列是否為STF-1啟動子活性所必需，我們構(gòu)建了一個(gè)在E框內(nèi)含有兩處堿基對取代的突變STF-1寡核苷酸(-118/-95)。在以HIT提取物進(jìn)行的凝膠遷移率變化試驗(yàn)中，該突變E框基元(AACGCG)不能形成C1、C2和C3復(fù)合物，也不能與野生型E框寡核苷酸競爭與USF-1的結(jié)合(圖6A)。相應(yīng)的，包含突變STF E基元的全長(6.5kb)STF-1和截短報(bào)道質(zhì)粒(-190STF)在胰島細(xì)胞中的活性比它們的野生型低近10倍(圖6B)。以上結(jié)果表明，結(jié)合USF的近端E框?qū)TF-1啟動子活性來說確實(shí)是關(guān)鍵性的。
所以，前6500堿基對的STF-15’序列內(nèi)的兩個(gè)元件對于胰島特異性表達(dá)來說是重要的位于-6500至-3500之間的遠(yuǎn)端元件，和位于-104的近端元件。近端的-104元件含有一個(gè)共有E框基元，它識別上游活化物USF。許多信息證明，USF對于STF-1的活性十分重要。首先，無差別USF-1、2抗體和USF-1、2特異性抗體都識別STF-1E框特異性復(fù)合物。其次，STF-1E框在HIT細(xì)胞核提取物中的結(jié)合活性具有USF特有的特征復(fù)合物具有熱穩(wěn)定性，具有與重組USF-1相近的半衰期。最后，STF E框上抑制USF復(fù)合物形成的點(diǎn)突變相應(yīng)地減弱了STF-1報(bào)道基因的活性。以上結(jié)果表明，USF復(fù)合物對于STF-1啟動子的活性確實(shí)十分重要，由此，對于胰腺的器官形成也十分重要。
除USF之外的其它核因子，最主要的是myc和max，也能夠高親和力地結(jié)合STF-1E框(CACGTG)基元。myc已被證明通過與max以異二聚體的形式與E框基元結(jié)合來刺激靶基因的轉(zhuǎn)錄(32,33)。由于myc基因的表達(dá)在細(xì)胞有絲分裂后期(例如胰島中的那些)中無法測得，所以那里的STF-1啟動子調(diào)控作用可能不涉及myc-max復(fù)合物。但是，在發(fā)育過程中，STF-1的表達(dá)似乎集中在增殖性管細(xì)胞中(6)，所以，myc可能在那些條件下刺激STF-1的表達(dá)。在這方面，在胰腺發(fā)育過程中觀察到的STF-1表達(dá)的復(fù)雜變化可能在一定程度上反映了E框結(jié)合活性的變化，后者最終將STF-1的產(chǎn)生限制在胰島細(xì)胞。
實(shí)施例11凝膠變化試驗(yàn)和DNaseⅠ保護(hù)試驗(yàn)為了進(jìn)行電泳遷移率變化試驗(yàn)，雙鏈寡核苷酸用Klenow片段通過32PdCTP補(bǔ)平反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記。5微克(μg)細(xì)胞核提取物與0.5納克(ng)標(biāo)記過的寡核苷酸和1(g非特異性競爭DNA一起在冰上孵育30分鐘，然后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。為了進(jìn)行超變試驗(yàn)，細(xì)胞核提取物預(yù)先與抗血清一起在冰上孵育30分鐘至1小時(shí)，然后加入標(biāo)記過的探針?？笻NF-3(、HNF-3(和HNF-3(抗體是由S.Duncan和J.Darell提供的?？笲ETA-2抗體是M.J.Tsai提供的?？?E2A抗體是向Santa Cruz Biochemicals購買的。如現(xiàn)有技術(shù)所述進(jìn)行DNAseⅠ保護(hù)試驗(yàn)(37)。重組HNF-3(由K.Zaret提供。
實(shí)施例12Northen印跡抑生長素細(xì)胞瘤/胰島細(xì)胞瘤Tu6細(xì)胞在乙醇或10-7地塞米松中培養(yǎng)不同的時(shí)間。用苯酚胍法抽提總RNA。用15微克總RNA在含有甲醛的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到Zeta-Probe上。使用Amersham隨機(jī)引發(fā)試劑盒形成隨機(jī)引發(fā)STF-1和微管cDNA。
實(shí)施例13內(nèi)皮因子HNF-3(和BETA-2通過胰島特異性增強(qiáng)子調(diào)控STF-1表達(dá)包含STF-1基因從-6200至-5670的530堿基對的啟動子結(jié)構(gòu)物經(jīng)地塞米松處理后被完全抑制，但含有遍在USF-1識別位置的基本STF-1啟動子結(jié)構(gòu)物卻不受抑制(圖7a)。STF-1基因的該相同530bp區(qū)域在HIT-T15細(xì)胞內(nèi)比在COS-7細(xì)胞內(nèi)活性高約5至10倍，這表明該片段具有胰島細(xì)胞特異性活性(圖7b)。對細(xì)胞特異性STF-1增強(qiáng)子內(nèi)序列的檢測顯示有對應(yīng)E框結(jié)合蛋白(-5.98至-5.963)和HNF-3(-5.927至-5.907)的共有基元(圖7c)。該E框基元，被稱為B元件，在序列上與大鼠胰島素Ⅰ和Ⅱ啟動子內(nèi)的NIR和FAR元件是一樣的(34)。HNF-3位置，被稱為H元件，在12個(gè)位置的9各內(nèi)與HNF-3共有結(jié)合位置是一致的。
為了確定B元件和H元件是否真的被胰島特異性核蛋白識別，我們用以32P標(biāo)記的從-5870至-6100的STF-1增強(qiáng)子片段進(jìn)行DNAseⅠ保護(hù)試驗(yàn)。從HIT T15細(xì)胞制備的核提取物被發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有在B位置(E框基元)和H位置(HNF-3基元)上的DNA結(jié)合活性(圖8a、比較泳道1和2)。在以來自HIT、HeLa和COS 7細(xì)胞的核提取物進(jìn)行的DNAseⅠ保護(hù)試驗(yàn)中，B元件都受到相同程度的保護(hù)，但是只有在來自HIT細(xì)胞的提取物中H元件受到保護(hù)(圖8a，比較由此2和4)。在含有純化重組HNF-3(蛋白的反應(yīng)中，我們還注意到插在H元件足跡中間的一個(gè)突出的超敏位點(diǎn)，這使得我們懷疑HNF-3調(diào)節(jié)物家族中的一員與HIT-T細(xì)胞中的STF-1H元件結(jié)合(圖8a，比較泳道2和5)。
為了進(jìn)一步確定識別STF-1增強(qiáng)子上H元件的核因子，我們用32P標(biāo)記的STF-1H元件探針進(jìn)行了凝膠遷移率變化試驗(yàn)。在含有HIT或RIN核提取物的反應(yīng)系中觀察到主要為低遷移率復(fù)合物，而且該復(fù)合物的形成特異性地受到添加摩爾量過量100倍的非標(biāo)記野生型H元件競爭DNA的抑制，但不受非標(biāo)記突變H元件競爭DNA的抑制(圖8b，比較泳道4-5,9-10,14-15)。在含有HeLa細(xì)胞核提取物的反應(yīng)系中沒有發(fā)現(xiàn)特異性蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，這表明H元件可能識別具有限制性表達(dá)方式的細(xì)胞核因子(圖8b，比較泳道1,6)。但是，在HepG2肝癌提取物中存在著遷移率與RIN/HIT-T15復(fù)合物一樣的H元件特異性復(fù)合物表明，H元件結(jié)合蛋白可能在具有內(nèi)皮性起源的細(xì)胞中普遍表達(dá)(圖8b，比較泳道3-5)。
HNF-3核活化物家族由((,(和()組成，它們通過高度保守的翼狀螺旋主域結(jié)合DNA。為了確定HIT提取物中的H元件結(jié)合活性是否與HNF-3家族成員有關(guān)，我們用HNF-3成員各自的特異性抗血清進(jìn)行了凝膠遷移率變化試驗(yàn)。雖然用Western印記分析在HIT-T15胰島瘤細(xì)胞的細(xì)胞核提取物中測得了全部3種HNF-3蛋白(未示)，但是在使用相同的提取物和H元件探針時(shí)，只發(fā)現(xiàn)HNF-3(抗血清被發(fā)現(xiàn)抑制為主的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的形成(圖8c，泳道1-4)。以從成年大鼠胰島細(xì)胞原代培養(yǎng)物制備的細(xì)胞核提取物進(jìn)行的凝膠變化試驗(yàn)中也得出相同的結(jié)果(圖8c，泳道5-8)。
STF-1增強(qiáng)子內(nèi)的B元件含有與胰島素啟動子內(nèi)的E框元件一致的共有E框基元。以前的研究證明，胰島特異性因子BETA-2通過與遍在因子E47以異二聚體形式結(jié)合這些胰島素啟動子元件來激活胰島素啟動子活性，這促使我們對STF-1B元件上BETA-2/E47的形成進(jìn)行了測試。在HIT細(xì)胞核提取物的凝膠遷移率變化試驗(yàn)中，32P標(biāo)記的B元件探針被發(fā)現(xiàn)形成4種特異性DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物，它們會被加入的非標(biāo)記的野生型競爭抑制，但不受非標(biāo)記突變型的競爭抑制(圖8d，比較泳道1,5,6)。最慢的復(fù)合物其遷移位置與重組E2A/BETA2異二聚體相同(圖8d，比較泳道1和7)。雖然非相關(guān)性抗血清對B元件結(jié)合活性沒有影響(圖8d，泳道4泳道2和3)，但是BETA-2或E2A抗血清特異性地抑制最慢的復(fù)合物的形成(圖8d，泳道2和3)，這表明，E2A/BETA2異二聚體的確在HIT細(xì)胞核提取物中識別T元件。
為了測定HNF-3(和E2A/BETA-2識別位置在介導(dǎo)STF-1增強(qiáng)子活性方面的重要性，我們在B和H元件內(nèi)進(jìn)行了點(diǎn)突變，這樣的突變在體外干擾上述識別因子的結(jié)合。當(dāng)結(jié)合530bp的增強(qiáng)子進(jìn)行測試時(shí)，含有B元件內(nèi)或H元件內(nèi)突變的STF-1報(bào)道質(zhì)粒在HIT T15細(xì)胞內(nèi)的活性比野生型結(jié)構(gòu)物低得多(圖9a)。但是，相反，突變的B元件和H元件結(jié)構(gòu)物的活性在COS-7細(xì)胞內(nèi)與野生型-6500STF-1報(bào)道質(zhì)粒相同；這表明這些突變干擾特異性地與胰島細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄活性。所以，B元件和H元件突變STF-1報(bào)道質(zhì)粒在HIT-T15細(xì)胞內(nèi)對地塞米松誘導(dǎo)也是沒有反應(yīng)的，這表明，這種激素特異性地干擾E2A/BETA 2或HNF-3(活性(圖9b)。
為了評價(jià)地塞米松是否通過干擾HNF-3(或BETA 2/E47對遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的活性來干擾STF-1的表達(dá)，我們用HNF-3(或BETA 2和E47效應(yīng)質(zhì)粒進(jìn)行了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。HNF-3((圖9b)或BETA 2/E47(未示)的過量表達(dá)在非受激HIT T15細(xì)胞內(nèi)對STF-1報(bào)道基因的表達(dá)幾乎沒有影響(圖9b，比較立柱1和5)。HNF-3(被發(fā)現(xiàn)抑制地塞米松對野生型STF-1報(bào)道基因活性的抑制作用(圖9h，比較立柱1,3,7)，但是例如BETA 2/E47、STF-1和HNF-4的活化物不能恢復(fù)經(jīng)地塞米松處理過的細(xì)胞內(nèi)的STF-1啟動子的活性(未示)。在以不斷加量的效應(yīng)質(zhì)粒進(jìn)行的滴定實(shí)驗(yàn)中，HNF-3(被發(fā)現(xiàn)以劑量依賴性方式恢復(fù)-6500STF-1 LUC報(bào)道基因的活性(圖9c)。但是，HNF-3(不加強(qiáng)含有H元件內(nèi)突變的突變STF-1報(bào)道質(zhì)粒的活性，這表明該活化物的抑制作用是通過其在STF-1增強(qiáng)子內(nèi)的識別位置產(chǎn)生的(圖9b比較立柱2,4,6,8)。
本文引用了以下參考文獻(xiàn)。
1．Pictet,R.L.等人，發(fā)育生物學(xué)(Develop.Biol.)；29,436-467(1972)。
2．Gttes,G.K.等人，美國科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.)；89,1128-1132(1992)。
3．Alpert,S.等人，細(xì)胞(Cell)；53,295-308(1988)。
4．Jonsson,J.等人，自然(Nature)；371,606-609(1994)。
5．Ohlsson,H.等人，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO)12,4251-4259(1993)。
6．Guz,Y.等人，發(fā)育(Development)；121,11-18(1995)。
7．Leonard,J.等人，美國科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.)；89,6247-6251.(1992)。
8．Leonard,J.等人，分子內(nèi)分泌學(xué)(Mol Endocrinol)；7,1275-1283(1993)。
9．Peers,B,等人，分子內(nèi)分泌學(xué)；8,1798-1806(1994)。
10．Walker,M.D.等人，自然；306,557-561(1983)。
11．Vallejo,M.等人；分子生物學(xué)(J.Biol.Chem.)；267,12868-12875(1992)。
12．Karlsson,O.等人，美國科學(xué)院院報(bào)；84,8819-8823(1987)。13．Miller,C,等人歐洲分子生物學(xué)雜志；13,1145-1156(1994)14．Naya,F.等人.，基因與發(fā)育(Genes and Dev.)；9,1009-1019(1995)。15．Gernam,M.等人，基因與發(fā)育；6,2165-2176(1992)16．Peshavaria,M.等人，分子內(nèi)分泌學(xué)；8,806-816(1994)17．VanDyke,M.W.等人，基因Ⅲ(GeneⅢ)；99-104(1992)18．Sirito,M，等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)；22,427-433(1994)19．Madsen,O.D.等人，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)；103,2025-2034(1086)20．Maxwell,I.H等人.，生物技術(shù)(Biotechniques)；7,276-280(1989)21．Hanahan,D.等人；自然315,115-122(1985)22．Montminy,M.R.等人，自然；328,175-178(1987)23．Weis,L.等人，F(xiàn)aseb J.；6,3300-3309(1992)24．Ishi,S.等人，科學(xué)(Science)；230,1378-1381(1985)25．Geng,Y.等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)；13,4894-4903(1993)26．Beckmann,H.等人，基因與發(fā)育；4,167-179(1990)27．Gregor,P.D.等人，基因與發(fā)育；4,1730-1740(1990)28．Sawadogo,M.等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)；263,11985-11993(1988)29．Krumlarf,R.等人，細(xì)胞；78,191-201(1994)30．Boncinelli,E.等人，人類生殖學(xué)(Hum.Reproduc.)；3,880-886(1988)31．Lewis,E.B.等人，自然；276,565-570(1978)32．Kretzner,L.等人，自然；359,426-429(1992)33．Blackwood,E.等人，科學(xué)；251,1211-1217(1991)34．Edlund,T.等人，科學(xué)；230:921-916(1985)35．Clark,K.等人，自然；364:412-420(1993)36．Lai,E.等人，美國科學(xué)院院報(bào)(PNAS)；90:10421-10423(1993)37．Sharma,等人，生物化學(xué)雜志(JBC)；271:2294-2299(1996)序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人Montminy和Sharma(ⅱ)發(fā)明名稱新的鑒定刺激STF-1在胰島細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的化合物的方法(ⅲ)序列數(shù)量4(ⅳ)通訊地址(A)地址James F.Weiler,Attorney-at-Law(B)街道One Riverway,Suite 1560(C)城市Houston(D)州Texas(E)國家USA(F)郵編77056(V)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型DS,HD 1.44Mb/1.44Mo(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WordPerfect6.0(ⅵ)當(dāng)前申請信息(A)申請?zhí)柹形传@得(B)申請日(C)申請類型用途(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Weiler,James F.
(B)注冊號16,040(C)文獻(xiàn)/卷宗號D-5848(?、?電傳信息(A)電話713-626-8646(B)電傳713-963-5853(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度403bp
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型(A)說明其它核酸(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅵ)原始來源(B)菌株(C)具體分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細(xì)胞類型(H)細(xì)胞系(xi)SEQ ID NO:1的序列描述TTAAGCTCTA ATGGAGCGGT TTTGTAACGG AGTAAAGGTT CTGATATTTT TGCGCTCCCC 60GGTTTGGAGA GCTCCGCAGC AGGACAGGAG AGATCAGCCT GCTGAGAGAG AAAATTGAAA 120CAAGTGCAGG TGTTCGCGGG CCTGGGCCTC CTTCTTAAGG CAGGGCCAGG CCAATGGTGG 180CCCCAGGCTG AACCACGTGG GGTGCCTCAG AGCCTATGGC ACGGCGACCG GCTTCTCTGT 240CTCTCGCCAG CCTGTGGTTC CCCGGGAGAG CAGTGGAGAA CTGTCAAAGC GATCTGGGGT 300GGCGCTGAGA GTCCGTGAGC TGCCAGCGCC TTAAGGCCTG GCTTGTAGCT CCCTACCCCG 360GGCTGCCGGC CCCGAAGTGC CGGCTGCCAC CATGAATAGT GAG 403(3)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度490bp(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型(A)說明其它核酸(ⅲ)假設(shè)非
(ⅳ)反義非(ⅵ)原始來源(B)菌株(C)具體分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細(xì)胞類型(H)細(xì)胞系(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述TCTAGAGAGT TCTCCTGTTC GCTAGATAAG AAAGCCTGTT CTGCCATCCC AGCAGGCATA 60GGCTGTTTAA GTTACTAGAT AACAGAGTTG TTATTGATTC TATTATTATT ATTTTTTCTA 120CTCTTCCTGA TTCCCTGAAG TCCAAGGGAA GTTTTGTCAA CTAGGAATGA TTTTTGTTTA 180AAAAAAAAAA AAAAAGGCTC CTTGTTGTGT CTTAGCTGGT CAGTGACAGA TGGAGTCCTG 240AGTTTCCTAG GAGCCCTTTA CTCAGGAGTG GGAGAACAGA AAGTAAATAA GCGCTCTTAG 300TCATCTGCTT TCTCAGAGCA GCGTTGGGCC CCAGCACTTG GAAAGCGAAT GCTGGCTCCT 360CCTGGACTCC CCCGTCAGCC TGATGTTGTT AACCCGTTTA ACATTCCCTT ATCACATGCT 420CATTGTGGGC AGAATTAAGT GGAATTAGCT AACAAATTAT ATAAAATTCA TTTACCTTTC 480AAGGAAGCTG 490(4)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型(A)說明其它核酸(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅵ)原始來源(B)菌株(C)具體分離株
(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細(xì)胞類型(H)細(xì)胞系(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述TCAGTGACAG ATGGAGTCCT 20(5)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型(A)說明其它核酸(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅵ)原始來源(B)菌株(C)具體分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細(xì)胞類型(H)細(xì)胞系(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述TCAGTGAAAG ACGGAGTCCT 20
權(quán)利要求
1．一種測定被測化合物刺激胰島細(xì)胞誘導(dǎo)STF-1轉(zhuǎn)錄的能力的方法，它包括以下步驟提供包含具有從SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其片段序列中選擇的STF-1增強(qiáng)子、啟動子和受所述STF-1增強(qiáng)子和所述啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的報(bào)道基因的載體，其中所述的報(bào)道基因能夠使得所述的宿主細(xì)胞具有可檢測信號；將所述載體轉(zhuǎn)移到所述宿主細(xì)胞內(nèi)；在被測化合物存在下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，測定所述的被測物質(zhì)刺激所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述信號的能力；分析所述的信號，測定所述的被測化合物刺激所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述可檢測信號的能力，其中有所述信號的存在表示所述被測化合物刺激胰島細(xì)胞誘導(dǎo)了STF-1的轉(zhuǎn)錄，而沒有所述信號則表示所述的被測化合物沒有刺激胰島細(xì)胞誘導(dǎo)STF-1的轉(zhuǎn)錄。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的報(bào)道基因是酶。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的酶選自螢光素酶和β-半乳糖苷酶。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)移步驟是通過轉(zhuǎn)染進(jìn)行的。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的胰島細(xì)胞是HIT細(xì)胞。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)移步驟是通過微注射將轉(zhuǎn)基因?qū)雱游矬w內(nèi)來進(jìn)行的。
7．一種體內(nèi)標(biāo)記產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞的方法，它包括以下步驟提供包含STF-1啟動子和受所述STF-1啟動子調(diào)控的報(bào)道基因的載體，其中所述的報(bào)道基因能夠使胰島細(xì)胞具有可檢測的信號；將所述載體作為轉(zhuǎn)基因?qū)雱游锏呐咛?；將所述的胚胎培養(yǎng)成具有胰島細(xì)胞的動物體；分析所述的可檢測信號，確定所述的動物的胰島細(xì)胞是否表達(dá)所述的報(bào)道基因，其中有信號存在表示有產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞存在，而沒有信號表示沒有產(chǎn)胰島素的細(xì)胞。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的報(bào)道基因產(chǎn)生熒光蛋白。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的方法還包括利用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)將產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞與不產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞分選開來的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了兩種實(shí)施方式。其一是檢測能夠誘導(dǎo)STF－1轉(zhuǎn)錄的化合物的方法。分離出表達(dá)STF－1/lacZ融合基因的胰島細(xì)胞,通過將待測化合物加入表達(dá)STF－1/lacZ的細(xì)胞來測定各種化合物的作用。然后利用比色法定量測定對照細(xì)胞和經(jīng)處理細(xì)胞內(nèi)的lacZ活性。利用此方法可以篩選大量化合物并可以方便地鑒定出STF－1誘導(dǎo)性化合物。其二是在體內(nèi)用STF－1啟動子標(biāo)記產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞的方法。其中,綠熒光蛋白(GFP)被用作指示物。用轉(zhuǎn)基因方法將STF－1綠熒光蛋白引入豬體內(nèi)就能夠高效迅速地從胰腺中回收產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。
文檔編號C12N15/85GK1209843SQ97191782
公開日1999年3月3日 申請日期1997年1月22日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月22日
發(fā)明者M·R·蒙特米尼, S·夏爾馬 申請人:研究發(fā)展基金會 被以下專利引用 (1),