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胰島細(xì)胞的離體成熟的制作方法

文檔序號(hào):6166571閱讀:633來(lái)源:國(guó)知局
胰島細(xì)胞的離體成熟的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于促進(jìn)來(lái)自斷奶前哺乳動(dòng)物之胰島細(xì)胞成熟的方法,目的是優(yōu)化胰島以將其作為供體組織用于異種移植。本發(fā)明的方法從供體動(dòng)物移出胰腺,然后將所述胰腺組織減小成大于完整胰島之大小的碎片,同時(shí)保持胰島處于完全的、產(chǎn)生胰島素的狀態(tài)。本發(fā)明的方法還在提高經(jīng)培養(yǎng)胰島的葡萄糖響應(yīng)度的新的成熟培養(yǎng)基中依序地培養(yǎng)經(jīng)消化的組織,然后選擇有充分葡萄糖響應(yīng)的胰島用于移植程序。
【專利說(shuō)明】胰島細(xì)胞的離體成熟
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]對(duì)2011年9月28日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)61/540,288和美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)61/540, 293要求優(yōu)先權(quán),其全部公開內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及將未成熟朗格罕氏島分離并培養(yǎng)至成熟的方法。
【背景技術(shù)】
[0004]糖尿病是一類具有多個(gè)共同特征的疾患,其中增加的血液葡萄糖是最明顯的。糖尿病的四種最常見類型為I型糖尿病(TlD)、2型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病和妊娠期糖尿病。TlD是胰島素缺乏疾病,主要在幼年時(shí)期發(fā)病,并且如果不治療則以高血糖癥為特征。T2D是胰島素不敏感與胰腺胰島素分泌不能補(bǔ)償胰島素不敏感相結(jié)合的疾患。繼發(fā)性糖尿病在內(nèi)分泌系統(tǒng)損害(例如胰腺損傷、肝硬化、內(nèi)分泌疾患或者某些抗病毒或抗精神病治療)之后發(fā)生。妊娠期糖尿病作為懷孕的并發(fā)癥發(fā)生。
[0005]身體唯一的胰島素來(lái)源是β細(xì)胞,其存在于胰腺的朗格罕氏島(后文中稱為“胰島”)中。胰島是具有獨(dú)特細(xì)胞結(jié)構(gòu)之內(nèi)分泌細(xì)胞的聚集體,其構(gòu)成胰腺總體積的約2%。除了產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞之外,胰島還包含產(chǎn)生胰高血糖素的α細(xì)胞、產(chǎn)生促生長(zhǎng)素抑制素的δ細(xì)胞、產(chǎn)生胰腺多肽的PP細(xì)胞和產(chǎn)生饑餓素的ε細(xì)胞。胰島的細(xì)胞一起調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能,并且代謝紊亂的治療常常涉及恢復(fù)或調(diào)節(jié)胰島外分泌功能。這些治療之一是胰島同種異體移植,并且其可部分或完全治愈TlD數(shù)月至數(shù)年。但是,其治療應(yīng)用由于胰腺供體的短缺仍受限,而胰腺供體是人胰島的唯一臨床上認(rèn)可的來(lái)源(Scharp D,等.(1990)Diabetes.39:515-518 ;ffier GC,等.(1997)Diabetesl997 ;46:1247 ;ShapiroAM,等.(2000)N Engl J Med2000 ;343:2303 ;和 Ichii H,等.(2009) J Hepatobiliary Pancreat Surg.16(2): 101-12.Epub2008Dec26)。
[0006]人胰島供給不足的潛在補(bǔ)救措施是異種移植包封于免疫應(yīng)答保護(hù)性屏障中的非人胰島。參見圖1 和(Orive G,等.(2003)Nat Med.9:104 ;Duvivier-Kali VF,等.(2001)Diabetes.50:1698 ;和 Schneider S,等.(2005) Diabetes54:687)。特別是,由于豬胰島與人胰島類似的大小和生理學(xué)、人胰島素與豬胰島素幾乎相同的分子結(jié)構(gòu)以及豬胰島素在人糖尿病治療中的長(zhǎng)期安全使用,豬是合適的胰島來(lái)源。豬還提供具有大產(chǎn)仔數(shù)和相對(duì)容易交配的額外優(yōu)點(diǎn)。
[0007]當(dāng)前僅通過(guò)使用市售大小或青壯豬(yuong adult pig)作為供體動(dòng)物進(jìn)行用于移植的成熟豬胰島(即,完全功能的胰島)的分離。但是,從青壯和市售重量豬中分離胰島是勞動(dòng)密集型的并且需要大量的設(shè)備和供應(yīng),包括將豬飼養(yǎng)至適當(dāng)大小所需的資源。固有易損的成年豬胰島的最終產(chǎn)量還對(duì)諸如飼養(yǎng)的因素、胰腺質(zhì)量和如下事實(shí)敏感:圍繞胰島的絕大部分(約98%)的胰腺組織為具有高度酶促活性的外分泌組織,其在開始常規(guī)胰島分離程序之后立即開始破壞胰島。事實(shí)上,前述因素加劇了胰島的易損性并且在胰島分離、儲(chǔ)存和培養(yǎng)期間導(dǎo)致大量胰島破碎(即,其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞)(Socci C,等.(1989)Horm.Metab.Res.25(Suppl.1):32-35 ;Kirchof N,等.(1994)Transplant.Proc.26:616-617 ;Van Deijnen JHM,等.(1992)Cell Tissue Res.267:139-146 ;和 Marchetti P,等.(1992)Diab.Nutr.Metab.5 (Suppl.1):151-154)。因此,每個(gè)胰腺的胰島產(chǎn)量大大低于基于每個(gè)胰腺的固有胰島計(jì)數(shù)的理論產(chǎn)量。用H&E染色的組織樣品揭示,與成年豬胰腺中發(fā)現(xiàn)的輪廓分明的胰島相反,幼豬胰腺較不致密并且具有廣泛分散的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞而沒(méi)有界限清楚的胰島結(jié)構(gòu)。參見圖2。
[0008]新生豬和胎豬也可用作胰島供體。這些胰島來(lái)源提供的優(yōu)點(diǎn)是在這些發(fā)育階段的胰腺是未成熟的,因此包含較少的在胰島分離程序期間損傷胰島的外分泌組織。但是,還有使用這些胰島來(lái)源的與未成熟相關(guān)的缺點(diǎn),例如在這些階段胰島的模糊胰島界限及其結(jié)構(gòu)的精細(xì)。然而,可從新生胰腺和胎胰腺中分離未成熟胰島(Korsgran 0,等.(1988)Transplantationl988 ;45:509-14 ;Latif ZA,等.(1988) Transplantation.45 (4):827-830 ; 1988 ;和 Ricordi C,等.(1990) Islet isolation assessment in man and largeanimals.Acta Diabetol Lat.27 (3):185_95)。但是,這些未成熟膜島在其分離后至少兩周不能分泌響應(yīng)葡萄糖的胰島素,并且可能在移植至宿主后花費(fèi)長(zhǎng)達(dá)兩到三個(gè)月來(lái)變得響應(yīng)葡萄糖(Korsgran O,等.(1988)Transplantationl988 ;45:509-14)。因此,來(lái)自新生膜腺組織和胎胰腺組織的胰島臨床上由于其可變的葡萄糖響應(yīng)度和花費(fèi)長(zhǎng)時(shí)間來(lái)成熟而不令人滿意。
[0009]作為至少因?yàn)樯鲜鲈蚨怯袉?wèn)題的常規(guī)胰島移植方法的可替代選擇,本文中描述的本發(fā)明是用于分離并培養(yǎng)導(dǎo)致高產(chǎn)量胰島當(dāng)量之胰島(即在移植前為有葡萄糖響應(yīng)之胰島)的可再現(xiàn)、有成本效益和可擴(kuò)縮的方法。因此,本發(fā)明的方法將使得能夠作出有依據(jù)的胰島素給藥決定,因?yàn)橐葝u移植物的胰島素分泌功能可在移植前被確證。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明涉及用于促進(jìn)來(lái)自斷奶前(pre-weaned)哺乳動(dòng)物之胰島細(xì)胞成熟的方法,目的是優(yōu)化胰島以將其作為供體組織用于異種移植。在多個(gè)實(shí)施方案中,供體動(dòng)物是仔豬(piglet)。本發(fā)明的方法從供體動(dòng)物移出胰腺并將所述胰腺組織減小成大于完整胰島之大小的碎片,同時(shí)保持胰島處于完全的、產(chǎn)生胰島素的狀態(tài)。本發(fā)明的方法還在蛋白酶溶液中消化所得組織碎片,所述蛋白酶溶液輕柔分離圍繞胰島的外分泌組織但不會(huì)對(duì)胰島細(xì)胞或胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)引起大量損傷。本發(fā)明的方法還在提高所述經(jīng)培養(yǎng)胰島的葡萄糖響應(yīng)度的新的成熟培養(yǎng)基中依序培養(yǎng)所述經(jīng)消化的組織,并且選擇用于移植程序的有充分葡萄糖響應(yīng)的胰島。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中,所述成熟培養(yǎng)基包含a)動(dòng)物來(lái)源的不確定(undefined)成分;b)抗氧化化合物;c)增強(qiáng)β細(xì)胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分;d)維生素B衍生物;f)維生素E衍生物;g)肝素;h)堿性胰腺胰蛋白酶抑制劑;i)絲氨酸蛋白酶抑制劑;和j)脫氧核糖核酸酶。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1是胰島細(xì)胞分離程序的流程圖,包括將幼豬胰腺切割、用膠原酶混合物處理組織切片,以及加工用于異種移植的胰島。
[0013]圖2例示了成年豬胰腺與幼豬胰腺的組織學(xué)比較。組織樣品取自來(lái)自市售重量成年豬或幼豬(15天齡)之胰腺的脾端。將胰腺樣品固定并用蘇木精和伊紅染色法(hematoxylin and eosin stain,H&E)或者抗膜島素和蘇木精(膜島素,Insulin)染色。成體胰腺顯示出完全胰島形成和整體上較密集的細(xì)胞群體(較密集的細(xì)胞核體積),而當(dāng)與成年豬胰腺相比時(shí),幼豬胰腺顯示出沒(méi)有可見的完整胰島形成以及非結(jié)構(gòu)化胰島素和胰高血糖素染色。所有圖像在20 X放大下拍攝,標(biāo)尺=100 μ m。
[0014]圖3顯示出胰島數(shù)目經(jīng)成熟培養(yǎng)期的變化,包括胰島當(dāng)量、純度、生存力和功能。在消化后0、1、3、5、7、9和14天、胰島成熟期間取得胰島樣品用于分析。用用于鑒定胰島當(dāng)量和胰島純度的二硫腙(DTZ)或用于確定細(xì)胞生存力的熒光素二乙酸酯/磺化丙啶(FDA/PD對(duì)胰島組織樣品進(jìn)行染色。胰島當(dāng)量(A)計(jì)算為陽(yáng)性DTZ染色的百分比。胰島純度(B,灰色線)計(jì)算為未染色組織的百分比,胰島生存力(B,黑線)計(jì)算為存活百分比(綠色)/死亡百分比(紅色)。對(duì)于胰島功能(C),在5% CO2下將100個(gè)胰島在2.8mM葡萄糖,然后是28mM葡萄糖,然后是28mM葡萄糖和IBMX,之后是2.8mM葡萄糖中于37°C孵育一小時(shí)。使用標(biāo)準(zhǔn)豬胰島素ELISA分析了樣品的胰島素釋放。在(D)中,培養(yǎng)5天后用FDA/PI染色的胰島樣品的圖像顯示出周圍組織的主要特征為細(xì)胞死亡,而胰島的內(nèi)部區(qū)室仍是存活的。結(jié)果展示為每個(gè)胰腺的平均值土 SEM (η = 6,一式兩份)。
[0015]表格簡(jiǎn)述
[0016]表I報(bào)道了在組織培養(yǎng)中經(jīng)14天表征胰島成熟的數(shù)據(jù)。胰島部分地酶促解離并使得在組織培養(yǎng)(37°C,5% CO2)中成熟14天。在培養(yǎng)中3天、7天和14天后,酶消化后直接取得胰島樣品,然后用二硫腙(DTZ)染色以定量胰島的數(shù)目(胰島計(jì)數(shù))并確定“胰島當(dāng)量”,(即,經(jīng)染色胰島相比未經(jīng)染色胰島的百分比)。使用裝配有標(biāo)準(zhǔn)10X10目鏡計(jì)數(shù)線的標(biāo)準(zhǔn)立體顯微鏡確定了胰島大小的百分比(25X放大,η =數(shù)目,如果是胰腺)。結(jié)果展示為平均數(shù)土 SEM。
[0017]表2報(bào)道了表征在組織培養(yǎng)中胰島成熟過(guò)程中在多個(gè)點(diǎn)處胰島的細(xì)胞組成的數(shù)據(jù)。胰島樣品在成熟期間在0、3、7和11天解離,然后對(duì)于C-肽、胰高血糖素或淀粉酶進(jìn)行染色并使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果給出為平均值土SEM,η = 3,一式三份地進(jìn)行。
[0018]發(fā)明詳述
[0019]本發(fā)明涉及促進(jìn)胰島離體成熟為可作為供體組織用于異種移植之有葡萄糖響應(yīng)之成熟胰島的方法。在本文中應(yīng)理解,本發(fā)明的方法分離并加工從幼年哺乳動(dòng)物的胰腺中移出的胰島。例如,在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法分離從出生與斷奶之間任何發(fā)育階段(即,不再看護(hù))的哺乳動(dòng)物的胰腺中移出的胰島。在本發(fā)明的方法中使用斷奶前供體豬的原理是斷奶后豬對(duì)固體食物的消耗活化胰腺外分泌組織產(chǎn)生消化酶,繼而在移出并加工來(lái)自動(dòng)物的胰腺之后損傷胰島。因此,考慮到前述原理,還有本發(fā)明方法的一些實(shí)施方案考慮使用通常處于與正在斷奶有關(guān)之年齡但是尚未開始消耗固體食物的動(dòng)物的供體胰腺。
[0020]在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法使用獲自幼豬、即仔豬的供體胰腺。通常,這樣的幼豬為約30天齡或更小。在一些實(shí)施方案中,例如,本發(fā)明的方法分離并培養(yǎng)來(lái)自約14至約22天齡仔豬的胰島,而在另一些實(shí)施方案中,幼豬胰島供體可以是約18至約28天齡。
[0021]如上所述,本發(fā)明的方法分離并加工來(lái)自供體胰腺組織的胰島。在本文中應(yīng)理解,本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“胰島”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)為具有朗格罕氏島的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)特征的任何細(xì)胞結(jié)構(gòu),并且包括包含β細(xì)胞的較少結(jié)構(gòu)化的細(xì)胞聚集體。本文中公開的胰島是有利的,至少部分因?yàn)樗鼈兙哂心承┡c成功異種移植有關(guān)的形態(tài)特征,以及因?yàn)榧?xì)胞維持與葡萄糖響應(yīng)有關(guān)的胰島樣體系結(jié)構(gòu)。
[0022]在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法通過(guò)外科手術(shù)移出哺乳動(dòng)物胰腺,包括消減任何非胰腺組織(例如,脂肪等)。通常,收獲十至十五個(gè)胰腺,之后合并用于組織加工。加工胰腺組織涉及使用這樣的技術(shù),將組織減小成約完整胰島大小的部分,同時(shí)注意不妨礙胰島的細(xì)胞排列和體系結(jié)構(gòu)。通常,在冷凍的條件下進(jìn)行胰腺組織切割。在多個(gè)實(shí)施方案中,通過(guò)使用剪刀和攪拌技術(shù)進(jìn)行切割。在多個(gè)實(shí)施方案中,胰腺組織被切割成最長(zhǎng)為約
0.1mm至約IOmm的塊。在某些其他實(shí)施方案中,胰腺組織切片直徑的最長(zhǎng)尺寸為約0.5mm至約1.0mm。通常,從移出胰腺到完成切碎步驟所經(jīng)過(guò)的時(shí)間為約20分鐘或更少。但是,在多個(gè)實(shí)施方案中,在本發(fā)明的方法中,從移出胰腺到完成切碎步驟所經(jīng)過(guò)的時(shí)間可多于20分鐘,例如,長(zhǎng)達(dá)30或40分鐘。
[0023]本發(fā)明的方法還酶促消化經(jīng)切割的、即經(jīng)切碎的胰腺組織以將胰島與非胰島組織分開。通常,本發(fā)明的方法使經(jīng)切碎的胰腺組織與低劑量、優(yōu)選無(wú)菌的膠原酶溶液接觸。在本發(fā)明方法的多個(gè)實(shí)施方案中,膠原酶溶液可包含來(lái)自溶組織梭菌(Clostidiumhistolyticum)的約60%經(jīng)純化I類(Cl)和約40%經(jīng)純化II類(C2)膠原酶。在多個(gè)其他實(shí)施方案中,膠原酶溶液除了 Cl和C2膠原酶以外還可包含其他類型的蛋白酶。例如,膠原酶溶液還可包含溶組織梭菌膠原酶3類(C3)、溶組織梭菌膠原酶4類(C4)、梭菌蛋白酶、thennalysin、胰蛋白酶、糜蛋白酶或彈性酶、或者上述物質(zhì)的任何組合,例如市售為
Liberasef8^P BIendzymeκ的蛋白酶的那些組合。通常,在37 °c下進(jìn)行經(jīng)切割胰腺組織的酶消化,同時(shí)以40~70rpm輕微離心,直到大部分圍繞胰島的腺泡基質(zhì)組織與胰島分開。在多個(gè)實(shí)施方案中,本 發(fā)明的方法在將圍繞的腺泡組織與胰島細(xì)胞分開后在相同的反應(yīng)條件下繼續(xù)將消化反應(yīng)進(jìn)行額外的時(shí)間,以使得胰島的膠原基質(zhì)更完全地被消化。額外膠原酶消化時(shí)期可花費(fèi)的時(shí)間長(zhǎng)度沒(méi)有限制,但是可進(jìn)行長(zhǎng)至本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的除去與胰島無(wú)關(guān)的組織而不過(guò)度損傷胰島所需的時(shí)間。通常,本發(fā)明的方法保持膠原酶消化盡可能簡(jiǎn)短,以幫助維持初始胰島體系結(jié)構(gòu),其在發(fā)育的斷奶前階段表征為具有可容易被破壞的發(fā)育不良膠原基質(zhì)。
[0024]本發(fā)明的方法通過(guò)添加補(bǔ)充有血清或白蛋白或者其二者的冰冷緩沖鹽溶液使胰腺組織的膠原酶消化停止。在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法通過(guò)向反應(yīng)混合物中添加補(bǔ)充有HEPES和10%牛血清白蛋白(BSA)的漢克(Hank)平衡鹽溶液(HBSS)使膠原酶消化反應(yīng)停止。膠原酶消化停止后,經(jīng)消化的胰腺組織通過(guò)金屬網(wǎng)漏斗過(guò)濾以除去碎片和不期望的大組織碎片。在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法使用500μπι金屬網(wǎng)漏斗,以除去大于500 μ m的組織碎片。
[0025]如上所述,本發(fā)明的方法促進(jìn)胰島的成熟。更具體地,本發(fā)明的方法包括組織培養(yǎng)期,其被分為至少兩個(gè)階段,恢復(fù)階段和成熟階段。這些階段通過(guò)順序(即,恢復(fù)階段在成熟階段之前)和通過(guò)某些培養(yǎng)基成分之濃度的變化來(lái)進(jìn)行區(qū)分。培養(yǎng)胰島的恢復(fù)階段從進(jìn)行上述膠原酶消化反應(yīng)之后開始,并且通常持續(xù)約48小時(shí)。培養(yǎng)胰島的成熟階段從恢復(fù)階段之后開始,并且通常持續(xù)約6至8天。本文中,應(yīng)理解,術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)”、“胰島培養(yǎng)”和“培養(yǎng)”是指在人為的體外環(huán)境中維持細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“胰島”和“胰島培養(yǎng)物”是指單獨(dú)的胰島細(xì)胞(例如β細(xì)胞)并且是包含在胰島中的所有細(xì)胞的總稱。短語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)基(cellculture medium) ”、“培養(yǎng)基(culture medium) ”、“培養(yǎng)基制劑(medium formulation) ”或簡(jiǎn)單地說(shuō)“介質(zhì)(medium) ”(在每種情形下,復(fù)數(shù)是“media”)是指培養(yǎng)細(xì)胞(即,胰島)的營(yíng)養(yǎng)溶液,并且可以互換使用。
[0026]本發(fā)明方法的恢復(fù)階段涉及上述經(jīng)過(guò)濾的膠原酶消化的胰腺組織之組織培養(yǎng)的初始48小時(shí)。在恢復(fù)期期間,胰腺組織在本文中稱為“恢復(fù)成熟培養(yǎng)基”或“第一成熟培養(yǎng)基”的特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通常,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基是基礎(chǔ)培養(yǎng)基,其額外地包含:a)不確定成分,例如豬血清或來(lái)自動(dòng)物胚胎、器官或腺體的提取物山)抗氧化化合物;c)增強(qiáng)β細(xì)胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分;d)維生素B的衍生物;e)維生素E的衍生物;f)肝素;g)堿性胰腺胰蛋白酶抑制劑;h)絲氨酸蛋白酶抑制劑;和i)脫氧核糖核酸酶。
[0027]通常,基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是與胰島細(xì)胞成熟相容的任何單一基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液或基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液的組合。例如,基礎(chǔ)培養(yǎng)基可選自但不限于BME培養(yǎng)基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,89,363 (1965) )、BGJb 培養(yǎng)基(Exp.Cell Res.,25,41 (1961))、CMRL1066 培養(yǎng)基(N.Y.Academy of Science, 5,303 (1957)) ,Glasgow MEM 培養(yǎng)基(Virology, 16,147 (1962))、改進(jìn)的 MEM 鋅選擇培養(yǎng)基(J.National Cancer Inst.,49,1705 (1972))、IMDM 培養(yǎng)基(InVitro, 9,6 (1970))、Mediuml99 培養(yǎng)基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1 (1950))、伊格爾(Eagle’s)MEM培養(yǎng)基(Science, 130,432 (1959))、a MEM培養(yǎng)基(Nature New Biology, 230,310(1971))、杜爾貝科(Dulbecco,s)MEM 培養(yǎng)基(Virology, 8,396 (1959))、Ham,s 培養(yǎng)基(Exp.Cell Res.,29,515 (1963) ;Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,53,288 (1965))、RPMI1640 培養(yǎng)基(J.A.M.A.,199,519 (1967))、Fischer’ s 培養(yǎng)基(Methods in Med.Res.,10 (1964))、McCoy,s 培養(yǎng)基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,100,115 (1959))、William,s E 培養(yǎng)基(Exp.Cell Res.,69,106(1971) ;Exp.Cell Res.,89,139 (1974))、其混合培養(yǎng)基等。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是Ham’ s F-12,而在另一些實(shí)施方案中,其為Mediuml99。在又一些實(shí)施方案中,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Ham’ s F-12和Mediuml99培養(yǎng)基的混合物。例如,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基組合物包含以選自1: 10至10: I的比率混合的Ham ‘s F-12和Mediuml99培養(yǎng)基。
[0028]關(guān)于恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的不確定成分,I?20% v/v濃度的豬血清最常用作不確定成分,來(lái)自動(dòng)物胚胎、器官或腺體的提取物(0.5?10% v/v)。還常規(guī)地使用其他血清或白蛋白來(lái)源,包括新生的牛、馬和人。已經(jīng)用于制備培養(yǎng)基補(bǔ)充物的提取物的器官或腺體包括頜下腺(Cohen (1961) J.Biol.Chem.237:1555-1565)、垂體(Peehl 和 Ham(1980) InVitrol6:516-525 ;參見 U.S.Pat.N0.4,673,649)、下丘腦(Maciag,等.(1979) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA76:5674-5678 ;Gilchrest,等.(1984)J.Cell.Physiol.120:377-383)、和腦(Maciag,等.(1981)Science211:1452-1454)。這些類型的化學(xué)不確定補(bǔ)充物在細(xì)胞培養(yǎng)基中提供數(shù)種有用的功能(參見Lambert,等.(1985) In:Animal Cell Biotechnology,Vol.1, Spier 等.,Eds.,Academic Press, New York,即.85-122 (1985))。例如,這些補(bǔ)充物
(I)提供用于不穩(wěn)定或水不溶性營(yíng)養(yǎng)物的載體或螯合劑;(2)結(jié)合并中和有毒部分;(3)提供激素和生長(zhǎng)因子、蛋白酶抑制劑和必需的常常是未確認(rèn)或不確定的低分子量營(yíng)養(yǎng)物;以及(4)保護(hù)細(xì)胞免受物理應(yīng)力和損傷。因此,血清或器官/腺體提取物通常用作相對(duì)低成本的補(bǔ)充物以提供培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的最佳培養(yǎng)基。
[0029]關(guān)于恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的抗氧化化合物成分,該成分發(fā)揮防止由反應(yīng)性氧物質(zhì)(如自由基和過(guò)氧化物)引起的對(duì)重要細(xì)胞成分之損傷的作用。在多個(gè)實(shí)施方案中,抗氧化物成分是谷胱甘肽。存在于恢復(fù)成熟培養(yǎng)基中的谷胱甘肽的量可變,但是通常以落入
0.0025~0.125% (w/v)范圍內(nèi)的濃度存在。
[0030] 如上所述,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基包含增強(qiáng)β細(xì)胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分。在多個(gè)實(shí)施方案中,該成分是合成的或天然的肽激素,其通過(guò)其胰島素分泌的葡萄糖依賴性刺激來(lái)發(fā)揮有效的葡萄糖調(diào)節(jié)作用。所述肽的實(shí)例包括但不限于胃抑制多肽(GIP)和胰高血糖素樣肽I (GLP-1),以及這些肽的模擬物或類似物。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基包含足以促進(jìn)β細(xì)胞成熟的濃度的GLP-1模擬物,Exenatide?(由CaliforniaPeptide Research, Inc., Napa, CA生產(chǎn)的exendin-4的合成形式)。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中,增強(qiáng)β細(xì)胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分是胰島素或胰島素衍生物。胰島素可來(lái)源于任何物種,例如人、牛、豬、馬、犬或鼠,并且可以是合成胰島素或胰島素類似物。術(shù)語(yǔ)“胰島素類似物”等在本文中可互換使用并且意圖涵蓋上述任何形式的“胰島素”,其中多肽鏈內(nèi)的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸已被替換為可替換氨基酸和/或其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸已缺失或者其中一個(gè)或更多個(gè)額外氨基酸已被添加至多肽鏈或氨基酸序列中,其仍具有天然胰島素的至少一種功能,例如降低血液葡萄糖水平。在某些實(shí)施方案中,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基可包含胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)激素。在又一些實(shí)施方案中,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的增強(qiáng)β細(xì)胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分可以是前述因子的任何組合。
[0031 ] 還將維生素B和E家族的衍生物添加至恢復(fù)成熟培養(yǎng)基中以幫助某些能量形成成分并降低氧化應(yīng)激或損傷。維生素B的任何衍生物可以是適當(dāng)?shù)模S生素B衍生物的實(shí)例包括但不限于煙酰胺、煙酰胺類似物、煙酰胺或煙酰胺類似物衍生物、或者煙酰胺或煙酰胺類似物代謝物。在多個(gè)實(shí)施方案中,維生素B衍生物可以以0.02~0.12% (w/v)的濃度存在于恢復(fù)成熟培養(yǎng)基 中??商砑又帘景l(fā)明恢復(fù)成熟培養(yǎng)基中的維生素E衍生物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何物質(zhì),包括但不限于維生素Ε(α -生育酚)、α -生育酚琥珀酸酯、α-生育酚磷酸酯、!'!01(--(6-羥基-2,5,7,8-四甲基色滿-2-羧酸)和維生素E本身,以及上述物質(zhì)的任何組合。在多個(gè)實(shí)施方案中,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的維生素E衍生物成分以
1.0X Kr4 ~5Χ10-4% (w/v)的濃度存在。
[0032]關(guān)于恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的堿性胰腺胰蛋白酶抑制劑成分,合適的抑制劑包括但不限于腔分泌蛋白酶的抑制劑,如抑肽酶(aprotinin)、Bowman-Birk抑制劑、大豆胰蛋白酶抑制劑、雞卵類黏蛋白、雞卵抑制劑、人胰腺胰蛋白酶抑制劑、甲磺酸卡莫司他、類黃酮抑制劑、抗蛋白酶、亮抑肽酶、對(duì)氨基芐脒、AEBSF, TLCK, APMSF, DFP、PMSF、聚(丙烯酸酯)衍生物、胰凝乳蛋白酶抑制劑、芐氧羰基-Pro-Phe-CHO、FK-448、糖聯(lián)苯基硼酸復(fù)合物、.β.-苯基丙酸酯/鹽、彈性蛋白酶抑制劑、甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pr0-Val-氯甲基酮(MPCMK)、EDTA和殼聚糖-EDTA綴合物。合適的蛋白酶抑制劑還包括膜結(jié)合蛋白酶的抑制劑,例如氨基酸、二肽和三肽、氨肽酶抑制劑、苯丁抑制素、嘌呤霉素、桿菌肽、次膦酸二肽類似物、.α.-氨基硼酸衍生物、Na-甘氨膽酸鹽、I,10-菲咯啉、阿西維辛(acivicin)、L-絲氨酸-硼酸鹽、塞奧芬和膦酰二肽。在多個(gè)實(shí)施方案中,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的堿性胰腺胰蛋白酶抑制劑成分以約20至500mM的濃度存在。
[0033]如上所述,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基可包含肝素。通常,肝素以肝素鈉的形式添加至培養(yǎng)基中。在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的肝素成分可以是硫酸乙酰肝素,替代肝素或與肝素組合存在。
[0034]如上所述,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基可包含絲氨酸蛋白酶抑制劑成分。在多個(gè)實(shí)施方案中,絲氨酸蛋白酶抑制劑會(huì)抑制可在上述胰島分離程序的膠原酶消化步驟期間被活化的供體胰腺的內(nèi)源性酶的活化。參見Rose NL等.(2OO3) Transplantation75 (4):462-466,其通過(guò)引用并入本文。在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的恢復(fù)成熟培養(yǎng)基包含蛋白酶抑制劑,Pefabloc?(Roche Biochemicals Inc., Indianapolis, IN)。在多個(gè)其他實(shí)施方案中,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的絲氨酸蛋白酶抑制劑成分以0.2至0.7mM的濃度存在。
[0035]關(guān)于本發(fā)明恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的DNA酶成分,該成分存在于培養(yǎng)基中以防止當(dāng)細(xì)胞死亡并釋放脫氧核糖核酸(DNA)時(shí)趨于發(fā)生的細(xì)胞結(jié)塊。合適的DNA酶的實(shí)例包括DNA酶的DNA酶I以及DNA酶II形式,包括來(lái)源于任何哺乳動(dòng)物來(lái)源的這些酶(包括人、牛和豬DNA酶)的重組形式。在多個(gè)實(shí)施方案中,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的DNA酶成分是鏈道酶a (dornase alfa),其為市售為 Pulmozyme?(Genentech, South San Francisco, CA)的 DNA酶I的重組人形式。在多個(gè)其他實(shí)施方案中,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的DNA酶成分可以以200至400mM的濃度存在。
[0036]恢復(fù)成熟培養(yǎng)基還可任選地包含抗生素或抗生素組合。理想地,考慮包含在本發(fā)明培養(yǎng)基中的抗生素在寬范圍的溫度下是穩(wěn)定的,并且既不被蛋白質(zhì)滅活也不以會(huì)干擾胰島生長(zhǎng)或成熟的方式抑制蛋白質(zhì)部分。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基包含用于組織培養(yǎng)之標(biāo)準(zhǔn)濃度(例如0.0025% (w/v))的硫酸慶大霉素。
[0037]如上所述,本發(fā)明的方法包括組織培養(yǎng)期,其被分為至少兩個(gè)階段,恢復(fù)階段和成熟階段。成熟階段通常在恢復(fù)階段48小時(shí)后立即開始,并且涉及將胰島培養(yǎng)物的恢復(fù)成熟培養(yǎng)基更換為“成熟培養(yǎng)基”或稱作“第二成熟培養(yǎng)基”。除了成熟培養(yǎng)基包含一半量的絲氨酸蛋白酶抑制劑和脫氧核糖核酸酶成分之外,成熟培養(yǎng)基具有與恢復(fù)成熟培養(yǎng)基相同的組成。本發(fā)明的方法在β細(xì)胞成熟期期間至少每48小時(shí)更換50%的成熟培養(yǎng)基。在每一 48小時(shí)的時(shí)間點(diǎn),計(jì)數(shù)胰島的數(shù)目并檢查其生存力。在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法通過(guò)用二硫腙(DTZ)對(duì)培養(yǎng)物的等分試樣染色來(lái)確定胰島計(jì)數(shù)(IC)和胰島當(dāng)量(IE),所述DTZ結(jié)合存在于胰島β細(xì)胞中的鋅離子,從而將胰島染成紅色。在更具體的實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法移出胰腺組織培養(yǎng)物的100 μ I等分試樣,然后將該等分試樣與ImlDTZ混合。通過(guò)共焦顯微術(shù)或流式細(xì)胞術(shù)分析DTZ染色的細(xì)胞來(lái)確定成熟β細(xì)胞。因此,DTZ染色使得能夠確定在胰島中為成熟β細(xì)胞的細(xì)胞比例。在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法產(chǎn)生約IXlO2或更多IE/g胰腺組織。例如,本發(fā)明的方法可產(chǎn)生,但不限于5X102、1X103、5X 103、I X 104、5X IO4IE或其中的任何IE產(chǎn)量/g胰腺組織。舉例來(lái)說(shuō),在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明方法的產(chǎn)量可以是在胰島分離后第八天加工之前6.4X103IE/g收獲的胰腺。
[0038]通常可通過(guò)本發(fā)明的方法通過(guò)用熒光素二乙酸酯(FDA)、碘化丙啶(PI)或Newport Green對(duì)胰島培養(yǎng)物的等分試樣染色,然后通過(guò)共焦顯微術(shù)或通過(guò)使用微板閱讀器分析經(jīng)染色的細(xì)胞來(lái)確定β細(xì)胞成熟期期間胰島培養(yǎng)物的生存力。在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法在胰島分離后的第七天產(chǎn)生大于80%的細(xì)胞生存力。例如,在胰島分離后的第七天,胰島培養(yǎng)物的細(xì)胞生存力可以是但不限于胰島分離后的第七天85%
100 %或其中細(xì)胞生存力的任何百分比。在某些實(shí)施方案中,例如,根據(jù)評(píng)估生存力的FDA和PI方法,在胰島分離后的第七天,細(xì)胞生存力可大于98%。在某些其他實(shí)施方案中,根據(jù)評(píng)估生存力的Newport Green方法,在胰島分離后的第七天,細(xì)胞生存力可大于90%。
[0039]β細(xì)胞的重要功能之一是根據(jù)葡萄糖水平調(diào)節(jié)其胰島素分泌??紤]該功能,可通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合用于該目的的任何方法在本發(fā)明方法的成熟期內(nèi)監(jiān)測(cè)胰島培養(yǎng)物的葡萄糖響應(yīng)。例如,可使用葡萄糖刺激的胰島素釋放(GSIR)測(cè)定在本文中描述的β細(xì)胞成熟過(guò)程的任何階段評(píng)估胰島功能。更具體地,標(biāo)準(zhǔn)GSIR測(cè)定以以下溶液順序?qū)@自胰島培養(yǎng)物的約100至150個(gè)胰島細(xì)胞孵育特定的時(shí)間,通常為一小時(shí),并且每個(gè)葡萄糖溶液孵育之間用PBS進(jìn)行兩次PBS洗滌。之后該測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞分泌的胰島素的量:1)低葡萄糖溶液(2.8mM葡萄糖);2)高葡萄糖溶液(28mM葡萄糖);3)還包含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(ΙΒΜΧ,50μΜ)的高葡萄糖溶液(28mM葡萄糖);以及之后4)低葡萄糖溶液(2.8mM葡萄糖)。
[0040]基于高葡萄糖條件下β細(xì)胞分泌的胰島素與低葡萄糖條件下β細(xì)胞分泌的胰島素的量的比率,隨后將胰島素釋放數(shù)據(jù)用于計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。最大SI (MX)可計(jì)算為高葡萄糖和IBMX條件下分泌的胰島素的量除以僅高葡萄糖條件下分泌的胰島素的量。
[0041]為了檢測(cè)分泌的胰島素,在每一上述葡萄糖刺激步驟之后分別從板中吸出培養(yǎng)基,離心,然后收集。收集上清液用于胰島素分析,在_20°C下儲(chǔ)存直到通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的并且在本發(fā)明方法中適合用于該目的的胰島素檢測(cè)方法來(lái)確定胰島素含量。在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的GSIR測(cè)定通過(guò)放射免疫測(cè)定(RIA)來(lái)檢測(cè)胰島素,而在另一些實(shí)施方案中,該測(cè)定使用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來(lái)檢測(cè)胰島素。
[0042]通常,通過(guò)本發(fā)明方法分離的胰島在分離后(許多β細(xì)胞尚未成熟的階段)立即具有葡萄糖響應(yīng)性。隨著在本發(fā)明方法下β細(xì)胞的成熟,可觀察到葡萄糖反應(yīng)性的連續(xù)增加。在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法經(jīng)時(shí)間增加了胰島培養(yǎng)物的SI。在某些實(shí)施方案中,在β細(xì)胞成熟過(guò)程期間的時(shí)間點(diǎn)之間,SI的增加可以是約5%或更少,而在另一些實(shí)施方案中,SI的增加百分比可以是并且包括5%至200%。例如,在一些實(shí)施方案中,SI在分離時(shí)可以為約1.3,分離后第3天可以為1.7,并且分離后第7天可以為約2.6。
[0043]如上所述,在本發(fā)明方法的β細(xì)胞成熟過(guò)程期間,經(jīng)培養(yǎng)的胰島經(jīng)歷某些發(fā)育變化,這通過(guò)展示經(jīng)分化胰細(xì)胞的多種表型和基因型標(biāo)記而證實(shí)。事實(shí)上,有許多可用于鑒定胰細(xì)胞群體的細(xì)胞標(biāo)志物。據(jù)信,這些標(biāo)記或標(biāo)志物的變化涉及經(jīng)培養(yǎng)胰島的成熟。其中,這些變化包括凋亡的細(xì)胞比例的減少、β細(xì)胞成熟的細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和胰島大小的增加。
[0044]可通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合用于該目的的任何方法(包括使用市售的凋亡檢測(cè)試劑盒)來(lái)確定本發(fā)明方法的β細(xì)胞成熟期期間的凋亡水平的變化。用于檢測(cè)胰島培養(yǎng)物中凋亡的另一些示例性方法包括基于羰花青核酸染色的技術(shù),如YO-PIK^-1碘化物和Vybrant?1凋亡測(cè)定試劑盒(均購(gòu)自Life Technologies)。通
常,胰島在β細(xì)胞成熟過(guò)程期間主要在胰島的外部腺泡細(xì)胞層中經(jīng)歷凋亡的漸進(jìn)性減少。在多個(gè)實(shí)施方案中,經(jīng)歷凋亡的胰島細(xì)胞的部分在β細(xì)胞成熟過(guò)程中可減少十倍或更多。例如,分離后第3天的凋亡胰島細(xì)胞部分可以是約22.5%,之后分離后第8天減少至約4.2%。
[0045]可通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合用于該目的的任何方法來(lái)檢測(cè)β細(xì)胞成熟的細(xì)胞標(biāo)志物。例如,檢測(cè)胰島細(xì)胞標(biāo)志物的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法是通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)。簡(jiǎn)要地,可用抗體對(duì)經(jīng)過(guò)濾的(例如,70 μ m過(guò)濾器)、分散酶解離的胰島細(xì)胞懸液進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,所述抗體對(duì)胰島素(對(duì)β細(xì)胞具有特異性)、胰高血糖素(對(duì)α細(xì)胞具有特異性)、促生長(zhǎng)素抑制素(對(duì)δ細(xì)胞具有特異性)、胰多肽(PP)(對(duì)ρρ產(chǎn)生細(xì)胞具有特異性)和淀粉酶(對(duì)腺泡組織具有特異性)具有特異性。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中,對(duì)于淀粉酶染色呈陽(yáng)性的胰島細(xì)胞(即,腺泡細(xì)胞)的比例減少,而對(duì)于胰島素染色呈陽(yáng)性的胰島細(xì)胞(即,β細(xì)胞)的比例隨時(shí)間增加。在某些實(shí)施方案中,淀粉酶陽(yáng)性細(xì)胞在分離后第2天相對(duì)于第7天的比例可分別從約75%減少到10% ;例如,從約65%減少到約25%。相反地,在某些實(shí)施方案中,胰島素陽(yáng)性細(xì)胞在分離后第2天相對(duì)于第7天的比例可分別從約25%增加到約85% ;例如,從約42%增加到約70%。
[0046]可通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適用于該目的的任何方法來(lái)確定胰島細(xì)胞形態(tài)學(xué)和體系結(jié)構(gòu)。通常,胰島的標(biāo)準(zhǔn)蘇木精和伊紅染色法(Η&Ε)染色揭示其細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)特征。如上所述,胰島的直徑與功能(即,葡萄糖響應(yīng)性)正相關(guān)。在這方面,本發(fā)明方法可產(chǎn)生分離后第8天其中絕大部分的胰島直徑超過(guò)50 μ m的培養(yǎng)物。例如,在多個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明方法產(chǎn)生胰島培養(yǎng)物,其中約90 %或更多胰島的直徑為并且包括50 μ m至150 μ m0
實(shí)施例
[0047]實(shí)施例1.胰島移出和分離
[0048]將正在斷奶的仔豬用作未成熟胰島的供體來(lái)源。通常的胰島制備方法使用十只14至26天齡的Yorkshire仔豬。通過(guò)快速外科手術(shù)獲取(即,少于五分鐘)從仔豬移出胰腺,之后置于冰冷的器官保存溶液(Corning Cellgro)中。整個(gè)冷卻的缺血時(shí)間限制在20分鐘。將收獲的胰腺合并并如下切割。冷凍后,切除胰腺周圍的動(dòng)物脂肪和淋巴組織,之后細(xì)細(xì)地切碎直到組織切片的直徑通常為0.5mm至1.0_。使用標(biāo)準(zhǔn)剪刀和攪拌技術(shù)繼續(xù)進(jìn)行切割過(guò)程,以將胰腺組織切碎。將切碎的組織添加至低劑量Clzyme膠原酶ΜΑ/BP蛋白酶的酶混合物(75?250mg/胰腺,VitaCyte LLC, Indianapolis, IN)中,然后使得在37°C下消化并溫和地?fù)u動(dòng)旋轉(zhuǎn)(40?60rmp),直到大部分周圍腺泡組織與未成熟胰島輕輕地分開。之后使胰腺組織在同一條件下再消化150分鐘。在消化反應(yīng)結(jié)束時(shí),將補(bǔ)充有HEPES和10% BSA的100?150ml冷的Hank平衡鹽溶液(HBSS)添加至組織-膠原酶混合物中,以使消化反應(yīng)停止。消化時(shí)間保持盡可能短,以幫助保存初期胰島體系結(jié)構(gòu),因?yàn)樵谄浞蛛x的時(shí)候胰島的膠原基質(zhì)發(fā)育不良并且容易遭受破壞。將經(jīng)消化組織通過(guò)500 μ m金屬網(wǎng)漏斗過(guò)濾,以除去直徑大于500 μ m的未經(jīng)消化的組織,留下的未成熟胰島通常直徑為50 μ m至500 μ m0之后,使胰島經(jīng)受使得它們經(jīng)歷成熟的組織培養(yǎng)條件。簡(jiǎn)要地,胰島的培養(yǎng)分為兩個(gè)階段:i)恢復(fù)階段;和ii)成熟階段?;謴?fù)階段涉及外科手術(shù)分離胰島之后48小時(shí)的時(shí)期,并且成熟階段涉及從恢復(fù)階段結(jié)束至胰島足夠成熟以在異種移植當(dāng)天有葡萄糖響應(yīng)的時(shí)間的時(shí)期,通常約八天。這些培養(yǎng)階段描述于以下實(shí)施例中。
[0049]實(shí)施例2.經(jīng)分離胰島的回收
[0050]對(duì)于首個(gè)分離后48小時(shí),將胰島簇培養(yǎng)于被稱為恢復(fù)成熟培養(yǎng)基的新的組織培養(yǎng)基中。制備恢復(fù)成熟培養(yǎng)基中的第一步驟涉及獲得Ham’ s F-12/Mediuml99基礎(chǔ)培養(yǎng)基(F-12/199培養(yǎng)基),其中Ham,s F-12和Mediuml99成分以I: I比率存在。在這些研究中,通過(guò)將Ham’ 8?-12和]^(1丨11111199粉末(均購(gòu)自Cellgro,Inc.)以各自0.815%的重量/體積(w/v)濃度(即,8.15g在IL水中)添加至滿足IS09001:2000和cGMP指南(ThermoScientific Inc.,Waltham,MA)的無(wú)菌水中來(lái)制備F-12/199培養(yǎng)基。之后向該F-12/199培養(yǎng)基添加:5.5% (w/v)豬血清(Lampire Biological Laboratories, Inc.,Pipersville,PA) ;2.5 X IO-3 % (w/v)硫酸慶大霉素(Fisher Bioreagents, Thermo Fisher Scientific,Inc., Waltham, MA) ;0.062 % (w/v)谷胱甘妝三妝(Acros Organics, Thermo FisherScientific, Inc., Waltham, MA) ;0.6 % (w/v)胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)激素(Sigma-Aldrich C0., LLC, St.Lous,MO) ;0.029% (w/v) L-谷氨酸胺(Fisher Bioreagents,Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) ;0.0244% (w/v) 6-羥基-2, 5, 7,8-四甲基色滿-2-羧酸(Trolox?, Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA);
4.2X 10_6% (w/v)艾塞那肽(Exenatide, exendin-4 的合成形式,由 California PeptideResearch, Inc., Napa, CA 制造);0.066% 肝素(150U/mg 肝素納,F(xiàn)isher Bioreagents,Thermo Fisher Scientific, Inc.,Waltham, MA) ;215mM 抑妝酶(Sigma-Aldrich C0.,LLC,St.Lous, MO) ;0.5mM Pefabloc?(Sigma-Aldrich C0.,LLC, St.Lous, MO) ;417mM DNA 酶a (Genentech Inc., S.San Francisco, CA);以及足夠量的HEPES緩沖液以將培養(yǎng)基的pH維持在7.2至7.5 (通常為5mM至20mM)。在T-175懸浮燒瓶中以80~100 μ I組織在40ml培養(yǎng)基中的組織密度于37°C和5% CO2下在恢復(fù)成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)胰島。
[0051]實(shí)施例3.經(jīng)切除胰島的成熟
[0052]在恢復(fù)成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)后,將胰島從恢復(fù)成熟培養(yǎng)基移出,以200Xg離心兩分鐘,然后再懸浮于本文中簡(jiǎn)稱為“成熟培養(yǎng)基”的恢復(fù)成熟培養(yǎng)基修改形式中。具體地,恢復(fù)成熟培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基之間的差異為成熟培養(yǎng)基具有一半量的Pefabloc?和DNA酶a。將胰島培養(yǎng)于成熟培養(yǎng)基中,直到胰島完全成熟,時(shí)期為約八天至九天,在此期間每48小時(shí)更換50%的培養(yǎng)基 。根據(jù)以下實(shí)施例中描述的組織化學(xué)和功能分析來(lái)定義胰島的完全成熟。當(dāng)胰島達(dá)到完全成熟時(shí),可以將它們長(zhǎng)期培養(yǎng)在“經(jīng)補(bǔ)充成熟培養(yǎng)基”中,該培養(yǎng)基為包含額外5mM濃度鈣的成熟培養(yǎng)基。需要額外的鈣用于幫助防止胰島包囊的崩解。
[0053]實(shí)施例4.胰島生存力、數(shù)目和成熟度
[0054]在每48小時(shí)更換培養(yǎng)基時(shí),評(píng)價(jià)了組織等分試樣的胰島計(jì)數(shù)、細(xì)胞生存力和β細(xì)胞成熟度。在本文中稱為胰島計(jì)數(shù)(IC)的培養(yǎng)基中胰島的數(shù)目以及在本文中稱為胰島當(dāng)量(IE)的包含成熟中β細(xì)胞之胰島的數(shù)目通過(guò)將胰島培養(yǎng)物的100 μ I等分試樣添加至Iml 二硫腙(DTZ)(結(jié)合存在于β細(xì)胞之鋅離子的紅色染料)中來(lái)確定(LatifZA,等.(1988) Transplantation45 (4):827-830 ;Ricordi C,等.(1990) Acta DiabetolLat27(3):185-95 ;和 Scharp DW,等.(1984) World J Surg.8 (2):143-151)。將 DTZ 染色進(jìn)行5分鐘之后,利用裝配有10X10目鏡計(jì)數(shù)線的標(biāo)準(zhǔn)立體顯微鏡(Max Erb Instrument C0.,Santa Ynez,CA)以25X放大率來(lái)觀察胰島。計(jì)數(shù)每個(gè)胰島簇以得到1C?;跈z測(cè)的成熟中β細(xì)胞的存在,使用陽(yáng)性DTZ染色在成熟期內(nèi)確定了胰島純度的百分比。更具體地,通過(guò)各個(gè)組織簇內(nèi)陽(yáng)性DTZ染色的量除以未染色區(qū)域的量確定了純度百分比。
[0055]通過(guò)使用突光素二乙酸酯(FDA)和碘化丙唳(PI)或Newport Green/PI染色、然后通過(guò)共焦顯微術(shù)(使用ZeissLSM510共焦顯微鏡(Carl Zeiss, Inc.))的可視化分析了細(xì)胞生存力百分比,并使用微板閱讀器定量了生存力(Tecan Infinite F200, Magellan V7)(lglesias I,等.(2008) Transplant Proc.40(2):351-354 ;Lamb Μ,等.(2011) TransplantProc.43 (9):3265-3266;和 Lukowiak B,等.(2001) J Histochem Cytochem.49(4):519-528)。
[0056]緊接著其分離,胰島純度平均為8.5% ±1.1。參見圖3B。培養(yǎng)7天后,胰島的純度已增加至78% ±1.5。參見圖3B。DTZ陽(yáng)性組織的比例在組織培養(yǎng)期間增加(培養(yǎng)7天后,12.6X103±183IEQ(平均值土 sem)增加至 33.3 X 103± 136 (η = 10),ρ < 0.05),并且大部分胰島的直徑為50~150 μ m(7天后94.52±11% )。參見表1和圖3A。
[0057]分離后7天發(fā)生經(jīng)培養(yǎng)胰島的完全成熟,并且沒(méi)有直徑超過(guò)350 μ m的胰島,約90%的胰島為50 μ m至150 μ m。參見表1。在培養(yǎng)的第7天,生存力為> 98% ±0.03 (FDA/PI)和> 90% ±0.4 (Newport Green)。參見圖 3B。
[0058]表1.[0059]
【權(quán)利要求】
1.用于促進(jìn)來(lái)自斷奶前哺乳動(dòng)物之胰島細(xì)胞成熟的方法,其包括: a)從斷奶前哺乳動(dòng)物中移出胰腺; b)將所述胰腺組織減小成大于完整胰島之大小的碎片,同時(shí)保持胰島處于完全的、產(chǎn)生胰島素的狀態(tài); c)在蛋白酶溶液中消化所述組織碎片,使得圍繞所述胰島的任何外分泌組織僅部分地與所述胰島分開; d)在第一成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述經(jīng)消化的組織; e)在第二成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述經(jīng)消化的組織; f)確定所述經(jīng)培養(yǎng)胰島的葡萄糖響應(yīng)度;以及 g)選擇有葡萄糖響應(yīng)的胰島。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述斷奶前哺乳動(dòng)物是仔豬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述第一成熟培養(yǎng)基包含: a)動(dòng)物來(lái)源的不確定成分;b)抗氧化化合物;c)增強(qiáng)β細(xì)胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分;d)維生素B衍生物;f)維生素E衍生物;g)肝素;h)堿性胰腺胰蛋白酶抑制劑;i)絲氨酸蛋白酶抑制劑;和j)脫氧核糖核酸酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述第二成熟培養(yǎng)基包含: a)動(dòng)物來(lái)源的不確定成分;b)抗氧化化合物;c)增強(qiáng)β細(xì)胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分;d)維生素B衍生物;f)維生素E衍生物;g)肝素;h)堿性胰腺胰蛋白酶抑制劑;i)絲氨酸蛋白酶抑制劑;和j)脫氧核糖核酸酶,其中所述絲氨酸蛋白酶抑制劑和所述脫氧核糖核酸酶成分的濃度不大于其在所述第一成熟培養(yǎng)基中濃度的一半。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法,其中所述動(dòng)物來(lái)源的不確定成分為豬血清。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法,其中所述抗氧化化合物為谷胱甘肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法,其中所述增強(qiáng)β細(xì)胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分為Exenatide?、胰島素、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)激素、或其組八口 ο
8.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法,其中所述維生素B衍生物為煙酰胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法,其中所述維生素E衍生物為6-羥基-2,5,7,8-四甲基色滿-2-羧酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法,其中所述堿性胰腺胰蛋白酶抑制劑為抑肽酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法,其中所述絲氨酸蛋白酶抑制劑為Pefabloc?。
12.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法,其中所述脫氧核糖核酸酶為鏈道酶α。
【文檔編號(hào)】G01N33/567GK104011546SQ201280047827
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月28日
【發(fā)明者】喬納森·Rt·萊基 申請(qǐng)人:胰島科學(xué)股份有限公司
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