專利名稱：印度水稻的轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于使用土壤桿菌法對水稻進行轉(zhuǎn)化的方法。
背景技術(shù)：
對于水稻轉(zhuǎn)化方法，已開發(fā)有通過原生質(zhì)體的電擊穿(エレクトロポレ-シヨ ソ)法和PEG法，使用的是容易培養(yǎng)的日本水稻。然而，這種方法，僅適用于由原生質(zhì)體而來的分化系已經(jīng)確定了的品種，對于培養(yǎng)困難的印度水稻，適用實例卻很少。
粒子槍(パ-テイクルガン)法，由于不需要原生質(zhì)體培養(yǎng)系統(tǒng)，所以作為適用于多種品種的新型轉(zhuǎn)化方法，已在很多研究機構(gòu)內(nèi)廣泛采用。一般認為印度水稻品種培養(yǎng)困難，但其中，占印度水稻中的大部分，稱作groupl的品種群[Glaszmann J．C．(1987)亞洲水稻品種的同工酶和分類(lsozymes andclassification of Asian rice varieties)The or Appl．Genet．7421-30]培養(yǎng)很困難。但是，利用Christou等人報導(dǎo)的粒子槍法[Christoup．Ford，T．L．a(chǎn)ndKofron．M(1992)用于水稻的各種獨立基因轉(zhuǎn)移法的進展(The deve lopment ofa variety-independent gene-transfer method for rice)TIB TECH 10239-246]對Groupl品種的轉(zhuǎn)化效率，未成熟胚芽低到2-3％，其他研究組近年來也報導(dǎo)，對于印度水稻沒有獲得高效轉(zhuǎn)化系(LiL．Rongda．Q．Kochko A．，F(xiàn)auquet，C．a(chǎn)nd Beachy，R．N．(1993)使用生物分解法的一種改進的水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(An improved rice transformation system using the biolistic method)，PlantCell Report 12250-255)。
另一方面，土壤桿菌法，對于雙子葉植物，作為既簡便又穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化方法已得到廣泛采用。但到目前為止，一直認為土壤桿菌法不適用于稻科等單子植物(Potryk US 1．，(1990)對禾谷類作物的基因轉(zhuǎn)移(Gene transfer tocereals)an assessment Bio／technology 8535-542)。近幾年才明確，對于單子葉植物的水稻也可以進行轉(zhuǎn)化(WO 94／00977；WO 95／06722；HieiY．，Ohta，S．，Komari，T．a(chǎn)nd Kumashiro．T．(1994)水稻的有效轉(zhuǎn)化，(Efficienttransformation of rice)(Oryza Sativa L．)由土壤桿菌和T-DNA界面的序列分析所引起(mediated by transformation by Agrobacteri um and Sequence analysisof the boundaries of the T-DNA)The Plant Journal 6271-282]，作為一種有用的轉(zhuǎn)化方法期待著今后的研究發(fā)展。
另一方面，Rance等人公開了一種從印度水稻的成熟種子誘導(dǎo)具有再分化能力的愈傷組織(カルス)的有效培養(yǎng)基NB[lann M．Rance I．M．等人，部分干燥成熟胚衍生的愈傷組織，一種顯著改進印度水稻再生能力的簡便處理法(Partial desiccation of mature embryo-derived calli，a simple treatment thatdramatically enhances the regeneration ability of indica rice)plant cellReports(1994)13647-651]。但是，關(guān)于篩選NB培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化細胞的效果沒有研究。使用粒子槍法，Li等人報導(dǎo)了使用類似于NB的培養(yǎng)基(不含有NAA，BA及L-谷氨酰胺)，對日本水稻具有很高的轉(zhuǎn)化效率(Li L．等人，(1993)使用生物分解法的一種改進水稻轉(zhuǎn)化體系(An improved ricetransformation system using the biloisticm ethod)Plant cell Report 12250-255)。但是，也報導(dǎo)了，對于印度水稻不能有效地獲得轉(zhuǎn)化體。Li等人對這種培養(yǎng)基在土壤桿菌法中的適用性沒有研究。
如上所述，運用原生質(zhì)體的方法，存在的問題是對于不能由原生質(zhì)體確立再分化系統(tǒng)的品種，因而不適用。就粒子槍法的報導(dǎo)而言，到目前為止，對于像印度水稻這樣的培養(yǎng)困難的品種，轉(zhuǎn)化效率仍很低。
我們認為土壤桿菌法適合于作為印度水稻的轉(zhuǎn)化方法。如上所述，使用土壤桿菌法對日本水稻進行轉(zhuǎn)化的方法已為眾人所知。本發(fā)明人對適用于日本水稻的方法，是否也適用于印度水稻進行了研究。
如WO94／000977及Hiei等人(1994)所報導(dǎo)，利用土壤桿菌對水稻進行轉(zhuǎn)化的方法，首先考慮的是采用脫分化組織的方法。因此使用屬于Groupl多種印度水稻，將土壤桿菌向愈傷組織引入基因進行試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然很少，但得到了轉(zhuǎn)化體。然而還不能確立具有再現(xiàn)性的轉(zhuǎn)化系。使用愈傷組織進行轉(zhuǎn)化時，必須把細胞分裂活性很高、且具有再分化能力的愈傷組織用作材料。然而，就培養(yǎng)困難的水稻品種而言，誘導(dǎo)適于導(dǎo)入基因的高細胞分裂活性的愈傷組織，也并非容易。因此，把愈傷組織作為試驗材料時，適用品種的范圍受到限定，我們認為使用培養(yǎng)困難的品種，不能很容易地獲得轉(zhuǎn)化體。
又考慮愈傷組織之外的其它部分，我們認為可采用未成熟胚作材料的方法(WO 95／06722，EP-A-0672752)。然而，把WO 95／06722或EP-A0672752中記載的對日本水稻有效的方法，原封不動用于印度水稻時，轉(zhuǎn)化效率很低，且不能確立實用的轉(zhuǎn)化系。
發(fā)明描述因此，本發(fā)明的目的是提供一種對印度水稻能高效地進行轉(zhuǎn)化的方法。
本發(fā)明者們經(jīng)過大量研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，按WO 95／06722、EP-A-0672752中記載的、用土壤桿菌屬細胞對水稻未成熟胚細胞進行轉(zhuǎn)化的方法，篩選轉(zhuǎn)化細胞工序中所用的培養(yǎng)基，通過將上述Rance等人的NB培養(yǎng)基用作基本培養(yǎng)基，這樣可使印度水稻達到很高的轉(zhuǎn)化效率，并完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供的印度水稻轉(zhuǎn)化方法，其特征是利用土壤桿菌法對印度水稻未成熟的胚細胞進行轉(zhuǎn)化，并篩選轉(zhuǎn)化的細胞。在水稻轉(zhuǎn)化方法中，作為篩選轉(zhuǎn)化的細胞的培養(yǎng)基，使用如下成分的培養(yǎng)基，即，含有KNO32000-4000mg／l、MgSO460-200mg／l、KH2PO4200-600mg／l、CaCl2100-450mg／l、(NH4)2SO4200-600mg／l、H3BO31-7mg／l、MnSO42-20mg／l、EDTA或其鹽20-50mg／l、Fe3-8mg／l、肌醇50-200mg／l、2，4-二氯苯氧基醋酸0．5-10mg／l、細胞分裂素類0．01-5mg/l和糖類5000-80000mg／l，以及膠凝劑，其pH值為4．5-6．5。
用過去的方法轉(zhuǎn)化效率低、不能進行再現(xiàn)性地轉(zhuǎn)化印度水稻，根據(jù)本發(fā)明可以高效率進行轉(zhuǎn)化。
附圖的簡單說明

圖1是本發(fā)明方法中可理想使用的超二元載體(Super binaryvector)PTOK162及PTOK233的結(jié)構(gòu)示意圖。
實施發(fā)明的最佳方式供本發(fā)明轉(zhuǎn)化方法的細胞是印度水稻的未成熟的胚細胞。作為印度水稻，雖沒有特別限定，但在過去的技術(shù)中，對屬于轉(zhuǎn)化特別困難的Groupl(Glaszmann、上面所述)的品種，適當(dāng)使用時能發(fā)揮出特別的能力。屬于Guoupl的印度水稻品種中，可列舉有1R8、1R24、1R26、1R36、1R54、1R64、1R72、新青矮1、南京11、水原258等，但并不僅限于這些。
本發(fā)明中，所謂未成熟胚是指在受粉后逐漸成熟過程中的未成熟種子的胚。本發(fā)明方法用的未成熟胚的階段(成熟期)沒有特別限定，可在受粉后任何時期采取，最好是受精2天以后。未成熟胚最好是近交系(インブレツド)和近交系之間的F1、近交系和自然受粉品種間的F1和市售F1品種的未成熟胚。而且，最好是胚中的胚盤細胞。未成熟胚在和土壤桿菌屬細菌接觸前沒有必要進行脫分化處理。這里所說的脫分化處理是指將植物組織已分化的細胞，在脫分化培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)以得到無秩序繁殖的愈傷組織等未分化狀態(tài)細胞塊而進行的處理。
轉(zhuǎn)化中使用的土壤桿菌屬細菌，可以使用具有Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒，過去用于雙子葉植物轉(zhuǎn)化的細菌。其大多數(shù)具有來自根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ti質(zhì)粒的病毒(ウィルレ ンス)領(lǐng)域(vir領(lǐng)域)，該病毒領(lǐng)域含原來DNA領(lǐng)域的載體。承擔(dān)付與植物形質(zhì)的基因插入到該載體中，或者是這種所謂載體存在于別的質(zhì)粒中，通過相同重組等在活體內(nèi)使之插入到Ti質(zhì)粒中。小鞠等人開發(fā)了一種載體，含有來自以下領(lǐng)域的DNA領(lǐng)域，即，在稱作根瘤土壤桿菌A281的強病原性的、轉(zhuǎn)化效率極高的株(Hodd，E．E．等人，1984；生物技術(shù)(Biotech)2702-709、Hood，E．E．等人，1986；細菌學(xué)(J．Bacterilo．)1681283-1290、Komari，T．等人．，1986；J．Bacteriol．16688-94、Jin．S．等人．，1987；J．Bacteriol．1694417-4425、Komari，T．，1989；植物科學(xué)(Plant Science)60223-229、ATCC(37349)中所含的Ti質(zhì)粒pTiBo542的病毒(ウィルレンス)領(lǐng)域(vir領(lǐng)域)(特開平4-222527號)。本發(fā)明把在根瘤土壤菌A281中所含的Ti質(zhì)粒pTiBo542的病毒領(lǐng)域、土壤桿菌屬細菌的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒的T-DNA的左邊緣和右邊緣構(gòu)型，及位于左邊緣和右邊緣之間所希望的基因的載體，稱之為“超二元載體”。本發(fā)明能理想地使用這樣的超二元載體。
作為這種超二元載體的實例，有pTOK162(特開平4-222527號、美國專利5591616、EP-A-0604662)。該構(gòu)造示于圖1。這種質(zhì)粒是可在大腸菌和根瘤土壤桿菌中繁殖的稱作pTOK154的質(zhì)粒(由Ti質(zhì)粒誘導(dǎo)的公知的pGA472質(zhì)粒和由稱作pVCK101的公知的廣寄主范圍質(zhì)粒，利用后述方法構(gòu)建的含T領(lǐng)域的質(zhì)粒)中，組合進來自pTiBo542的病毒(ウィルレンス)領(lǐng)域的已克隆(クロ-ン)化的上述15．2kb的kpnl片段含(virB、VIRg、virC各種基因)。該pTOK154中排列著T領(lǐng)域的2個邊界序列并要在其間導(dǎo)入印度水稻的耐卡那霉素的基因。該例是在含有來自pTiBo542病毒領(lǐng)域的已克隆化的DNA片段的質(zhì)粒上，配置往印度水稻中要導(dǎo)入的遺傳基因的實例。將從pTOK162和pGL2-1G誘導(dǎo)而來的耐潮霉素的基因(hpt)和付與蓖麻(ヒマ)的內(nèi)含子(イントロン)的GUS基因，通過相同重組組入pTOK162的T-DNA領(lǐng)域中，得到的pTOK233(Hiei et al．上述)，也是一種理想的超二元載體。pTOK233的構(gòu)造與圖1所示相同。
要組入印度水稻中的所希望的基因，可以用常規(guī)方法組入到上述質(zhì)粒的T-DNA領(lǐng)域中的限制酶的部位上，可根據(jù)質(zhì)粒具有的耐藥性等適當(dāng)選擇的標志(marker)進行選擇。像圖1所示的pTOK162那樣，大型的，具有多個限制部位的，以通常的亞克隆化(サブクロ-ンニング)方法將所希望的DNA導(dǎo)入到T領(lǐng)域內(nèi)有時也不一定容易。在這種情況下，通過利用根瘤土壤桿菌細胞內(nèi)的在活體內(nèi)進行相同重組(Herrera-Estrella，L．等人，1983；EMBOJ．2987-995、Horsch，R．H．等人，1984；Science 223496-498)，能夠?qū)⒛康腄NA導(dǎo)入到pTOK162中。即，例如，首先，將pTOK162導(dǎo)入根瘤土壤桿菌中，再將這種菌導(dǎo)入已導(dǎo)入所希望DNA的稱為pBR322的質(zhì)粒(含有類似的質(zhì)粒)中。pTOK162的DNA中，由于具有和pBR322相同的部分，所以通過相同排列的重組能將pBR322誘導(dǎo)體組入到pTOK162中。pBR322不同于pTOK162，在根瘤土壤桿菌中，由于不能復(fù)制，如果不是這種組入狀態(tài)(稱為pTOK162∷pBR322誘導(dǎo)體)，就不可能在根瘤土壤桿菌中生存。同樣，如果對pTOK162和pBR322誘導(dǎo)體的各種特異性(耐藥劑性等)進行選擇，就能獲得具有pTOK162∷pBR322誘導(dǎo)體的根瘤土壤桿菌。進而在研究將各種質(zhì)粒導(dǎo)入到具有pTOK162的根瘤土壤桿菌中時，發(fā)現(xiàn)作為pBR322誘導(dǎo)體的篩選標志，最好來自轉(zhuǎn)座子(トランスポゾン)Tn7(DeGreve，H．H．等人，1981；Plasmid 6235-248)的耐奇霉素基因子(SP)。因此，所希望的基因已被克隆到pBR322中的情況下，如果將SP基因插入到它的質(zhì)粒內(nèi)，通過根瘤土壤桿菌內(nèi)的相同重組，可以將所希望的基因?qū)氲絧TOK162的T領(lǐng)域內(nèi)。在其它情況下，可考慮先準備由來自pBR322的DNA和SP基因構(gòu)成的質(zhì)粒，再將所希望的基因插入該質(zhì)粒中的方法。這時，若運用T領(lǐng)域的邊界排列，最終，在pTOK162上，也能將耐卡那霉素基因和所希望的基因配置在各個T領(lǐng)域中。將耐卡那霉素作為標志對植物進行轉(zhuǎn)化的情況下，在兩個T領(lǐng)域都導(dǎo)入時也能以相當(dāng)?shù)谋壤l(fā)生，所以目的基因完全能導(dǎo)入進去。另外，由于兩個T領(lǐng)域有時也能組入到不同的染色體內(nèi)，所以以后從耐卡那霉素基因分離目的基因也是可能的。
作為成為寄主的土壤桿菌細菌，雖沒有特殊限定，但優(yōu)選使用根瘤土壤桿菌。
將質(zhì)粒導(dǎo)入到根瘤土壤桿菌等的土壤桿菌類細菌中的操作可按通常方法進行。例如可按細菌的三系雜交法(Ditta，G．等人，1980；Pro．Natl．Acad．Sci．USA777347-7351)進行。
這樣調(diào)制的土壤桿菌屬細菌中，由于含有來自pTOK162的病毒(ヴィルレ ンス)能力很高的DNA，所以能高效率地進行印度水稻的轉(zhuǎn)化。
另外，本發(fā)明中，導(dǎo)入印度水稻中的基因，和現(xiàn)有技術(shù)一樣，是被配置在T領(lǐng)域邊界排列之間的，但在土壤桿菌屬細菌中，可以配置在Ti質(zhì)粒上，也可以配置在其它質(zhì)粒上。
使用土壤桿菌屬細菌對印度水稻未成熟胚進行轉(zhuǎn)化的方法，可以通過使未成熟胚單獨與土壤桿菌屬細菌接觸的方法進行。例如，配制細胞濃度為106-1011個細胞／ml的土壤桿菌屬細菌懸浮液，將未成熟胚在該懸浮液中浸泡3-10分鐘后，再在固體培養(yǎng)基上進行共存培養(yǎng)數(shù)天。在轉(zhuǎn)化中的未成熟胚，沒有必要在2，4-D存在下進行培養(yǎng)等的脫分化處理。
進行轉(zhuǎn)化的未成熟胚，隨后最好在脫分化狀態(tài)下進行轉(zhuǎn)化細胞的篩選、繁殖。篩選可根據(jù)上述所希望基因的發(fā)現(xiàn)和標志(耐藥性等)進行。脫分化狀態(tài)的細胞，最好是具有正常個體再生能力的愈傷組織。
本發(fā)明的方法是將轉(zhuǎn)化細胞的篩選，在具有上述組成和pH值的培養(yǎng)基上進行。作為上述組成中作為細胞分裂素類的最好實例，有6-苯甲基氨基嘌呤。作為上述組成中糖的最好實例，有麥芽糖、蔗糖和葡萄糖，及它們的混合物。作為膠凝劑，有瓊脂、瓊脂糖、牻牛兒樹膠(ゲランガム)等。這些都是使培養(yǎng)基膠凝化的物質(zhì)，其配合量可按能膠凝化的適當(dāng)量，對此沒有特殊限定，通常為2-10g／l。優(yōu)選使用含有如下組成的培養(yǎng)基，即在上述組成中再至少添加K10．5～2mg／l、ZnSO40．7～5mg／l、Na2MoO40．1～0．3mg／l、CuSO40．01～0．02mg／l、CoCl20．01～0．02mg／l、煙酸0．25～10mg／l、維生素B60．25～5mg／l、和維生素B10．05～20mg／l。在該組成中再至少添加酪蛋白氨基酸(カザシ)100～3000mg／l、脯氨酸100～3000mg／l、谷氨酸100～3000mg／l、和α-萘乙酸0．01～5mg／l也是優(yōu)選使用的培養(yǎng)基。還可以使用，在上述各組成中再添加1000～60000mg/l糖醇的培養(yǎng)基。作為糖醇的最好實例，有甘露醇和山梨糖醇。另外，在根據(jù)耐藥性進行篩選時，當(dāng)然除上述組成以外要含有該藥劑。篩選最好進行2-5次。這種情況下，一次篩選的時間最好為2-3周、二次篩選時間最好2周。進行多次篩選時，雖然任何一次篩選都是在上述培養(yǎng)基上進行，但也可以在上述范圍內(nèi)成分含量不同的培養(yǎng)基上進行篩選。
來自轉(zhuǎn)化細胞的植物體再生，可按公知的方法(Rance等人，1994(上述))進行。這時，最好在再分化培養(yǎng)基上也添加篩選的藥劑。這樣獲得所希望形質(zhì)的植物體；最好是獲得所希望的形質(zhì)、而且具有正常能育性的轉(zhuǎn)化植物體再生。這些具體的操作實例在下述實施例中詳細論述。
以下根據(jù)實施例更具體地說明本發(fā)明。下述實施例僅僅為了示例而記載，從任何意義上講，都不能作為限制的解釋。
實施例1、比較例1-3(1)土壤桿菌的菌系和質(zhì)粒寄主細菌，使用LBA4404(ATCC37349)載體使用上述pTOK233(參照圖1)。
(2)試驗用品種和組織作為試驗用的品種，有1R8、1R24、1R26、1R36、1R54、1R64、1R72、新青矮1、南京11、水原258。開花后10-14天去除未成熟種子的芽穎、在70％乙醇中進行數(shù)秒，在含有吐溫20的1％次氯酸鈉水溶液中進行15分鐘滅菌處理。用滅菌水洗滌數(shù)次后，在體現(xiàn)顯微鏡下，摘取1．5-2mm長的未成熟胚。
(3)接種和共存培養(yǎng)將在含有50mg／l潮霉素和50mg／l卡那霉素的AB培養(yǎng)基(Chilton M-D．等人(1974)Agrob acterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA notdetected in crown gall tumors．Proc．Natl．Sci．USA，713672-3776)上培養(yǎng)3-7天的土壤桿菌的菌落，用白金環(huán)采取，在AAM培養(yǎng)基(Hiei等人，1994．上述)中進行懸浮，制成接種液。菌密度配制為2～3×108／ml。
向摘取的未成熟胚上滴加1ml細菌懸浮液，旋轉(zhuǎn)約30秒鐘，靜置5-10分鐘后，將附著有細菌懸浮液的未成熟胚在共存培養(yǎng)用的NB-AS培養(yǎng)基上，使胚盤向上，置床，在25℃的黑暗處進行4-5天的共存培養(yǎng)。這里使用的NB-AS培養(yǎng)基的組成，是Rance等人(1994)(上述)所述的NB培養(yǎng)基，但去除L-谷氨酰胺、添加了乙酰丁香酮100μM、蔗糖20g／l、D-葡萄糖10g／l、海噬菌斑(Sea plaque)瓊脂糖12．5g／l。即，該組成是KNO32830mg／l、MgSO4·7H2O185mg／l、KH2PO4400mg／l、CaCl2·2H2O166mg／l、(NH4)2SO4463mg／l、K10．7mg／l、H3BO33．0mg／l、MnSO4·H2O10mg／l、ZnSO4·7H2O2．0mg／l、Na2MoO42H2O0．25mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／l、CoCl2·6H2O0．025mg／l、Na2·EDTA37．3mg／l、Fe2SO4·7H2O27．8mg／l、肌醇100mg／l、煙酸1．0mg／l、鹽酸維生素B61．0mg／l、鹽酸維生素B110mg／l、酪蛋白氨基酸300mg／l、L-脯氨酸300mg／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、α-萘乙酸1mg／l、6-苯甲基氨基嘌呤1mg／l、乙酰丁香酮100μM、蔗糖2g／l、D-葡萄糖10g／l、海噬菌斑(Sea plaque)瓊脂糖12．5g／l、pH值為5．2。
(4)轉(zhuǎn)化細胞的篩選共存培養(yǎng)后，用手術(shù)刀除去伸長的苗條，移植到含有3mg／l潮霉素的NBM培養(yǎng)基上，在30℃的黑暗處培養(yǎng)3-4天。接著將未成熟胚分別移植到含20-50mg／l潮霉素的NBM(實施例1)、2N6M(比較例1)、CCM(比較例2)、MSM(比較例3)的1次篩選培養(yǎng)基上，在30℃的明亮條件下培養(yǎng)2-3周。將在未成熟胚的胚盤上形成的耐潮霉素的愈傷組織，移植到含20mg／l潮霉素的NB2培養(yǎng)基上或含30mg／l潮霉素的CCM培養(yǎng)基上，2周內(nèi)，在30℃明亮條件下進行2次篩選。使用相同的NB2培養(yǎng)基或濃度50mg／l潮霉素的CCM培養(yǎng)基，在10-14天間隔內(nèi)進行1-3次(3-5次篩選)、在小盒(Compact)內(nèi)進行球狀胚胎發(fā)生的愈傷組織篩選和繁殖。以下列出了所用NBM、2N6M、CCM、MSM、NB2培養(yǎng)基的組成。另外，在這些篩選培養(yǎng)基里，下述組成中還添加了250mg／l的頭孢氨噻(ヤフオタキシム)。
NBM培養(yǎng)基KNO32830mg／l、MgSO4·7H2O185mg／l、KH2PO4400mg／l、CaCl2·2H2O166mg／l、(NH4)2SO4463mg／l、KI0．75mg／l、H3BO33．0mg／l、MnSO4·H2O10mg／l、ZnSO4·7H2O2．0mg／l、Na2MoO4·2H2O0．25mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／1、CoCl2·6H2O0．025mg／l、Na2．EDTA37．3mg／l、Fe2SO4·7H2O27．8mg／l、肌醇100mg／l、煙酸1．0mg／l、鹽酸維生素B61．0mg／l、鹽酸維生素B110mg／l、酪蛋白氨基酸300mg／l、L-脯氨酸300mg／l、L-谷氨酰胺300mg／l、2，4-二氯苯氧乙酸2mg／l、α-萘乙酸1mg／l、6-苯甲基氨基嘌呤1mg／l、D-麥芽糖30g／l、牻牛兒樹膠(商品名Gelrite，Sigma公司制)2．5g／l、pH值為5．8。
2N6M培養(yǎng)基在N6無機鹽類，N6維生素[Chu C-C．(1978)N6培養(yǎng)基及其對谷類作物的其它培養(yǎng)中的應(yīng)用(The N6 medium and its applications to anther cultureof cereal crops．)ln proc．Symp．Plant Tissue Culture PekingScience Press，PP43-50]中，加入酪蛋白氨基酸1g／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、D-麥芽糖30g／l、牻牛兒樹膠(商品名Gelrite Sigma公司制)2．5g／l。即KNO32830mg／l、MgSO4·7H2O185mg／l、KH2PO4400mg／l、CaCl2·2H2O166mg／l、(NH4)2SO4463mg／l、KI0．75mg／l、H3BO31．6mg／l、MnSO4·4H2O3．3mg／l、ZnSO4·7H2O1．5mg／l、Na2MoO4·2H2O0．25mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／l、Na2·EDTA37．3mg／l、Fe2SO4·7H2O27．8mg／l、煙酸0．5mg／l、鹽酸維生素B60．5mg／l、鹽酸維生素B11．0mg／l、酪蛋白氨基酸1g／l、甘氨酸2mg／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、D-麥芽糖30g／l、牻牛兒樹膠(商品名Gelrite，Sigma公司制)2．5g／l、pH值為5．8。
CCM培養(yǎng)基在CC培養(yǎng)基[Potrykus 1等人(1979)由谷類細胞培養(yǎng)物原生質(zhì)體形成的愈傷組織(Callus formation from cell culture protoplasts of corn)(Zea maysL．)．Theor．Appl．Genet．54209-214；Hartke S．等人(1989)來自各種印度水稻的體細胞的胚胎發(fā)生和植物再生(Somaic embryogenesis and plantregeneration from various indica rice)(Oryza SativaL．)genotypes．J．Genet＆Breed．43205-214]中。加入D-麥芽糖30g／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、牻牛兒樹膠(商品名Gelrite Sigma公司制)2．5g／l。即KNO31212mg／l、NH4NO3640mg／l、CaCl2·2H2O588mg／l、MgSO4·7H2O247mg／l、KH2PO4136mg／l、FeSO4·7H2O27．8mg／l、Na2EDTA37．3mg／l、H3BO33．1mg／l、MnSO4·4H2O11．15mg／l、ZnSO4·7H2O5．76mg／l、KI0．83mg／l、Na2MoO4·2H2O0．24mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／l、CoSO4·7H2O0．028mg／l、煙酸6mg／l、鹽酸維生素B18．5mg／l、鹽酸維生素B61mg／l、甘氨酸2mg／l、肌醇90mg／l、椰子水100ml/l(Gibco公司制)、甘露醇36．43g／l、D-麥芽糖30mg/1、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、牻牛兒樹膠(商品名Gelrite．Sigma公司制)2．5g／l、pH值為5．8。
MSM培養(yǎng)基在MS無機鹽類、MS維生素[Murashige，T．a(chǎn)nd SKoog，F(xiàn)(1962)一種用于煙草組織培養(yǎng)物快速生長和生物檢定的改良培養(yǎng)基(A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures)Physiol．Plant．15∶473-497]中，加入酪蛋白氨基酸1g／l、D-麥牙糖30g／l、2，4-二氟苯氧乙酸2mg /l、牻牛兒樹膠(商品名Gelrite Sigma公司制)2．5g／l。即NH4NO31650mg／l、KNO31900mg／l、MgSO4·7H2O370mg／l、KH2PO4170mg／l、CaCl2·2H2O440mg／l、KI0．83mg／l、H3BO36．2mg／l、MnSO4·4H2O22．3mg／l、ZnSO4·7H2O8．6mg／l、Na2MoO4·2H2O0．25mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／l、CoCl2·6H2O0．025mg／l、Na2·EDTA37．3mg／l、Fe2SO4·7H2O27．8mg／l、肌醇100mg／l、煙酸0．5mg／l、鹽酸維生素B60．5mg／l、鹽酸維生素B10．1mg／l、甘氨酸2．0mg／l、酪蛋白氨基酸1g／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、D-麥芽糖30g／l、牻牛兒樹膠(商品名Gelrite，Sigma公司制)2．5g／l、pH值為5．8。
NB2培養(yǎng)基KNO32830mg／l、MgSO4·7H2O185mg／l、KH2PO4400mg／l、CaCl2·2H2O166mg／l、(NH4)2SO4463mg／l、KI0．7mg／l、H3BO33．0mg／l、MnSO4·H2O10mg／l、ZnSO4·7H2O2．0mg／l、Na2MoO4·2H2O0．25mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／l、CoCl2·6H2O0．025mg／l、Na2·EDTA37．3g／l、Fe2SO4·7H2O27．8mg／l、肌醇100mg／l、煙酸1．0mg／l、鹽酸維生素B61．0mg／l、鹽酸維生素B110mg／l、酪蛋白氨基酸300mg／l、L-脯氨酸300mg／l、L谷氨酰胺300mg／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／1、α-萘乙酸1mg／16-苯甲基氨基嘌呤0．2mg／l、D-麥芽糖30g／l、D-甘露醇30g／l、牻牛兒樹膠(商品名Gelrite，Sigma公司制)2．5g／l、pH值為5．8。
接著，將選取的愈傷組織移植到含有40mg／l潮霉素的NBM再分化前培養(yǎng)基上，在30℃明亮條件下培養(yǎng)約10天。
(5)轉(zhuǎn)化體的再分化和GUS發(fā)現(xiàn)研究將通過再分化前培養(yǎng)得到的，耐潮霉素的胚胎發(fā)生的愈傷組織，在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中進行干燥處理后(Rance等人，1994(上述))移植到將RN培養(yǎng)基(Rance等人1994(上述)的糖源改為30g／l D-麥芽糖的RNA再分化培養(yǎng)基(含有30mg／l潮霉素)上。2-3周后，將再分化植物移植到含有30mg／l潮霉素的MSI(1／2濃度MS主要無機鹽、MS微量無機鹽、MS維生素、1g／l酪蛋白氨基酸、0．2mg／l吲哚酪酸、15g／l蔗糖、3g／lGelrite，pH5．8)生根培養(yǎng)基上，在25℃明亮條件下培養(yǎng)約3周。將得到的耐潮霉素的再分化植物的葉子，通過X-Glue處理，研究GUS發(fā)現(xiàn)(Hiei等人．1994(上述))。將再分化的個體再移植到50倍的Hyponex水溶液中，在25℃明亮條件下進行10天育苗后，再移植到溫室內(nèi)的花盆里。
(6)轉(zhuǎn)化體的SaZan(サザン)分析和后代中導(dǎo)入基因的發(fā)現(xiàn)將由顯示GUS發(fā)現(xiàn)的再分化個體葉子中提取的DNA，用限制酶Hindlll或Kpnl進行處理，將hpt或GUS基因作為探針(プロ-ブ)進行SaZan分析。對于SaZan分析，按Sambrook等人(1990)所述方法進行(Sambrokk，J．等人，Molecular cloningALaboratory Manual，2nd Edn．Cold Spring Harbor，NYCold Spring Harbor Laboratory Press)。將轉(zhuǎn)化體的自行繁殖下一代種子播種到無激素(ホルモンフソ-)的MS培養(yǎng)基上，發(fā)芽后，通過葉片的X-Gluc處理而研究GUS發(fā)現(xiàn)。再將這些相同的由種子得來的苗移植到含有50mg／l潮霉素、無激素的MS培養(yǎng)基上，研究抗潮霉素性能。
結(jié)果示檢表1和表2。
表1一次篩選中基本培養(yǎng)基的比較(品種IR24、菌系LBA4404／pTOK233)*獨立的GUS陽性植物的系統(tǒng)數(shù)(不含克隆)。
對二、三次篩選培養(yǎng)基使用NB2培養(yǎng)基(20mg／l潮霉素)。
對再分化前的培養(yǎng)基使用NBM培養(yǎng)基(40mg／l潮霉素)。
對再分化培養(yǎng)基使用RBM培養(yǎng)基(30mg／l潮霉素)。
表2一次篩選中基本培養(yǎng)基的比較(品種IR36、菌系LBA4404／pTOK233)*獨立的GUS陽性植物的系統(tǒng)數(shù)(不含克隆)。
對二次篩選培養(yǎng)基使用CCM培養(yǎng)基(30mg／l潮霉素)。
對三-五次篩選培養(yǎng)基使用CCM培養(yǎng)基(50mg／l潮霉素)。
對再分化前的培養(yǎng)基使用NB培養(yǎng)基(40mg／l潮霉素)。
對再分化培養(yǎng)基使用RNM培養(yǎng)基(30mg／l潮霉素)。
表3用LBA4404／pTOK233對印度水稻進行轉(zhuǎn)化的結(jié)果

*獨立的GUS陽性植物系統(tǒng)數(shù)(不含克隆)。**對二次篩選以后的培養(yǎng)基使用CCM培養(yǎng)基以下對上述實驗結(jié)果進行說明。
(1)轉(zhuǎn)化細胞的篩選在1次篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周后，在NBM培養(yǎng)基上，與CCM、MSM和2N6M培養(yǎng)基相比得到非常高頻率的耐潮霉素的愈傷組織(表1、表2)。對1次篩選過程中的未成熟胚，研究其用X-Gluc處理的GUS基因的發(fā)現(xiàn)，確認在用NBM培養(yǎng)基培養(yǎng)的未成熟胚的胚盤上形成的多個細胞塊，都顯示出一樣的GUS發(fā)現(xiàn)。在使用CCM和MSM培養(yǎng)基的情況下，胚盤整體肥大，幾乎見不到GUS發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的特異增殖。即，使用NBM培養(yǎng)基的情況下，由于導(dǎo)入基因領(lǐng)域顯示出選擇性的增殖，所以1個未成熟胚就能得到數(shù)個獨立地耐潮霉素的細胞塊。與此相比，使用CCM和MSM培養(yǎng)基的情況下，導(dǎo)入基因領(lǐng)域見不到選擇性的增殖，胚盤的表層細胞整體有愈傷組織化的傾向。由于這個原因，使用CCM和MSM培養(yǎng)基進行1次篩選的情況下，要看清耐潮霉素的細胞塊，進行篩選都是很困難的。
當(dāng)CCM和MSM培養(yǎng)基的潮霉素濃度降低到20、30mg／l時，和不添加潮霉素的情況一樣，胚盤整體顯示出增殖。使用2N6M培養(yǎng)基的情況下，與NBM培養(yǎng)基相比，從未成熟胚中篩選的愈傷組織數(shù)少，見到的是生長遲緩的傾向。Christou等人，在粒子槍法中，雖然將MS和CC培養(yǎng)基用于轉(zhuǎn)化細胞的篩選[ChristouP．等人，(1991)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻(Production oftransgenic rice)(Oryza SativaL．由通過放電粒子加速外源DNA進入未成熟的合子胚的農(nóng)業(yè)上重要的印度和日本水稻品種所得的植物(plants formagronomically important indica and；aponica varieties via electeric disch argeparticle acceleration of exogenous DNA into immature zygoticembryos)Bio／technology 9957-962；Chistou P．Ford，T．L．a(chǎn)nd KofronM．(1992)水稻用的各種獨立基因轉(zhuǎn)移法的進展(The development of a variety-indep endent gene-transfer method for rice)TIB TECH 10239-246]、但和本比較例的情況一樣，所得轉(zhuǎn)化體的數(shù)量很少。
使用從NBM培養(yǎng)基中去除了NAA和BA只有2，4-D的單獨培養(yǎng)基的情況下，獲得具有再分化能力的、有耐性的胚胎發(fā)生的愈傷組織是很困難的。從此考慮，認為為了誘導(dǎo)有再分化能力的胚胎發(fā)生的愈傷組織，BA等細胞分裂素類是必需的。Li等人(1993)(上述)使用不含有NAA，BA和L-谷氨酰胺的NB培養(yǎng)基、進行轉(zhuǎn)化細胞的篩選，據(jù)報導(dǎo)認為對于印度水稻，僅得到了極少的再生個體，與本比較例中的結(jié)果是一致的。
1次篩選的培養(yǎng)期間最好是2-3周、當(dāng)超過該期限繼續(xù)培養(yǎng)時，在未成熟胚的胚盤上形成的愈傷組織，其增殖也會超過需要，每個未成熟胚難以得到數(shù)個獨立的篩選愈傷組織，此外，愈傷組織的形態(tài)也趨于不好。
(2)2次選取以后的培養(yǎng)對于試驗用的10個品種中的8個品種，在NB2培養(yǎng)基上，愈傷組織以胚胎發(fā)生的狀態(tài)增殖。對于1R36、1R72的兩個品種，其比較結(jié)果可知，與NB2培養(yǎng)基比，CCM培養(yǎng)基(30-50mg／l潮霉素、250mg／l頭孢氨噻)能保持形態(tài)良好的愈傷組織。
使用NBM培養(yǎng)基進行1次篩選的試驗區(qū)中，與其它培養(yǎng)基相比，在2，3次篩選中非常多的愈傷組織也都保持了耐性(表1、2)。2次篩選以后的培養(yǎng)大致進行2周，當(dāng)繼續(xù)3周以上培養(yǎng)時，愈傷組織產(chǎn)生溫度，形態(tài)向不良方向發(fā)展。篩選進行3次或4次、5次后，進行再分化前的培養(yǎng)。
(3)再分化培養(yǎng)10個品種都有效地得到了再分化個體、再分化困難的品種沒有發(fā)現(xiàn)。在生根培養(yǎng)基方面，添加了1BA(0．2mg／l)的MSI培養(yǎng)基，與不含激素的培養(yǎng)基相比，明顯地促進了生根，是最適宜的。向生根培養(yǎng)基里添加潮霉素(30mg／l)，對植物體階段的耐潮霉素個體篩選非常有效。
(4)轉(zhuǎn)化效率大部分再分化的個體，在葉子中都顯示出一樣的GUS發(fā)現(xiàn)(表3)。在NBM培養(yǎng)基上，使用1次篩選的培養(yǎng)系時，對于10個試驗用品種，每個未成熟胚芽都以30％以上的非常高的效率，得到耐潮霉素的、而且顯示GUS發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化體(表1、2、3)。
(5)SaZan分析和對后代的遺傳通過SaZan分析結(jié)果，可以確認顯示GUS發(fā)現(xiàn)的再生個體，確認在研究的所有個體上都導(dǎo)入了遺傳基因。同時，確認了T-DNA導(dǎo)入到各個個體的水稻基因組的隨機部位上。對后代GUS的發(fā)現(xiàn)和耐潮霉素性的研究結(jié)果，可以觀察到適合于孟德爾遺傳法則的遺傳分離。
權(quán)利要求
1．一種印度水稻轉(zhuǎn)化方法，其特征是，利用土壤桿菌法對印度水稻未成熟胚細胞進行轉(zhuǎn)化、篩選被轉(zhuǎn)化細胞、在水稻的轉(zhuǎn)化方法中，篩選作為轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)基，它含有KNO32000～4000mg／l、MgSO460～200mg／l、KH2PO4200～600mg／l、CaCl2100～450mg／l、(NH4)2SO4200～600mg／l、H3BO31～7mg／l、MnSO42～20mg／1、EDTA或其鹽20～50mg／l、Fe3～8mg／l、肌醇50～200mg／l、2，4-二氯苯氧醋酸0．5～10mg／l、細胞分裂素類0．01～5mg／l和糖類5000～8000mg／l，以及膠凝劑，其pH值為4．5～6．5。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征是，上述細胞分裂素類是6-苯甲基氨基嘌呤。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征是，上述糖類是選自麥芽糖、蔗糖和葡萄糖中至少一種。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述方法，其特征是，上述培養(yǎng)基至少還含有KI0．5～2mg／l、ZnSO40．7～5mg／l、Na2MoO40．1～0．3mg／l、CuSO40．01～0．02mg／l、CoCl20．01～0．02mg／l、煙酸0．25～10mg／l、維生素B60．25～5mg／l、和維生素B10．05～20mg／l。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征是，上述培養(yǎng)基至少還含有酪蛋白氨基酸100～3000mg／l、脯氨酸100～3000mg／l、谷氨酰胺100～3000mg／l、及α-萘乙酸0．01～5mg／l。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述方法，其特征是，上述培養(yǎng)基還含有1000～60000mg／l的糖醇。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征是，上述糖醇是甘露醇或山梨糖醇。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述方法，其特征是，上述印度水稻屬于Groupl。
全文摘要
本發(fā)明是一種能夠高效地對印度水稻進行轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明方法是利用土壤桿菌法對印度水稻未成熟胚細胞進行轉(zhuǎn)化,并用培養(yǎng)基對已轉(zhuǎn)化的細胞進行篩選。該培養(yǎng)基含有KNO
文檔編號C12N15/84GK1206435SQ97191464
公開日1999年1月27日 申請日期1997年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月22日 公開號97191464.8
發(fā)明者樋江井祐弘 申請人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社 被以下專利引用 (6),