專(zhuān)利名稱(chēng)：5'－三磷酸核苷的制造方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從5＇-二磷酸腺苷(ADP)以外的5＇-二磷酸核苷(NDP)制造或再生5＇-三磷酸核苷(NTP)的方法及該方法在寡糖合成等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著核酸發(fā)酵和核酸分解等核酸工業(yè)的發(fā)展，目前已可廉價(jià)地制造核苷和5＇-一磷酸核苷酸(NMP)，其一部分已作為藥品或其原料而制造銷(xiāo)售。此外，核苷、核苷酸或其衍生物作為醫(yī)藥的開(kāi)發(fā)也在積極地進(jìn)行。另外，近年來(lái)，隨著糖鏈工程技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于糖核苷酸(糖鏈的酶合成底物)合成的研究也在活躍地進(jìn)行。
這樣，與NMP可廉價(jià)地制造和供應(yīng)相比，雖已報(bào)告NTP有各種化學(xué)合成或使用微生物或酶的合成方法，但以5＇-三磷酸腺苷為起始原料的NTP的廉價(jià)的制造方法目前尚未確立，故市售的NTP極昂貴。
最近，用以糖核苷酸為底物的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的寡糖的合成技術(shù)開(kāi)發(fā)正在廣泛地進(jìn)行，其中引人注目的有美國(guó)Scripps研究所提出的糖核苷酸循環(huán)法(參見(jiàn)PCT專(zhuān)利申請(qǐng)公報(bào)1995年第500248號(hào)、日本專(zhuān)利公開(kāi)公報(bào)1995年第79792號(hào))。該方法是以NTP和糖1-磷酸為底物，使用糖核苷酸焦磷酸化酶和糖基轉(zhuǎn)移酶，在合成糖核苷酸的同時(shí)，將同時(shí)合成的糖核苷酸作為單糖供體，有效地進(jìn)行糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，由此合成寡糖。該方法的特征在于，通過(guò)烯醇丙酮酸磷酸與丙酮酸激酶的組合而使由糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成的NDP再生成NTP，然后再將再生的NTP用作合成糖核苷酸的底物，由此可減少高價(jià)的NTP的添加量且可提高糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的效率，從而有望降低寡糖的制造成本。
但是，上述循環(huán)法雖然具有不必大量使用高價(jià)的NTP的優(yōu)點(diǎn)，然而，為再生NTP，卻必須大量使用高價(jià)的烯醇丙酮酸磷酸，因此，該方法并未成為一種可滿(mǎn)足實(shí)用性的方法。
此外，在將NDP轉(zhuǎn)換成NTP的反應(yīng)中，雖可用核苷二磷酸激酶等其他酶代替丙酮酸激酶，但依然需要高價(jià)的5＇-三磷酸腺苷(ATP)作為磷酸供體，不是根本的解決辦法。
因此，本發(fā)明提供一種不使用高價(jià)的烯醇丙酮酸磷酸或ATP的、更實(shí)用的從NDP合成或再生NTP的方法，同時(shí)提供該方法在合成寡糖等方面的應(yīng)用方法。
本發(fā)明者為達(dá)到上述目的，進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以往公知的多磷酸激酶(Biochim.Biophys.Acta.,26,294-300(1957))具有以多磷酸為磷酸供體，將ADP以外的NDP磷酸化、合成NTP的活性。在研究將上述發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于寡糖合成時(shí)，確認(rèn)其比現(xiàn)有的上述糖核苷酸循環(huán)法更實(shí)用，由此完成了本發(fā)明。
發(fā)明的揭示即，本發(fā)明提供一種從ADP以外的NDP制造NTP的方法，該方法是一種特征在于用多磷酸激酶作為酶、用多磷酸作為磷酸供體的從NDP制造NTP的方法。
此外，本發(fā)明還提供一種從其他酶反應(yīng)生成的ADP以外的NDP再生NTP的方法，該方法是一種特征在于用多磷酸激酶作為酶、用多磷酸作為磷酸供體的從NDP再生NTP的方法。
再者，本發(fā)明還提供一種制造受體糖的糖基化化合物的方法，其中，在通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶從糖核苷酸和受體糖制造該受體糖的糖基化化合物的同時(shí)，將在該反應(yīng)中生成的NMP或NDP轉(zhuǎn)換成NTP，然后再轉(zhuǎn)換成糖核苷酸，從而使NMP或NDP再循環(huán)，該方法的特征在于，用多磷酸激酶作為酶，用多磷酸作為磷酸供體，進(jìn)行從NDP向NTP的轉(zhuǎn)換。
圖面的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1和圖2是制造受體糖的半乳糖基化化合物的反應(yīng)圖解。圖3是制造受體糖的葡糖醛酸基化化合物的圖解。圖4是制造受體糖的葡糖基化化合物的反應(yīng)圖解。圖5和圖6是制造受體糖的巖藻糖基化化合物的反應(yīng)圖解。圖7是制造受體糖的甘露糖基化化合物的反應(yīng)圖解。圖8是制造受體糖的N-乙酰氨基葡糖基化化合物的反應(yīng)圖解。圖9是制造受體糖的N-乙酰氨基半乳糖基化化合物的反應(yīng)圖解。圖10是制造受體糖的唾液酸基化化合物的反應(yīng)圖解。圖11是制造乳糖的反應(yīng)圖解。圖12是制造N-乙酰乳糖胺的反應(yīng)圖解。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的特征在于，在從NDP制造NTP時(shí)，用多磷酸激酶作為酶，用多磷酸作為磷酸供體。這里，構(gòu)成NDP和NTP的核苷的例子有鳥(niǎo)苷、肌苷、黃苷、胞苷、尿苷和胸苷。
本發(fā)明中使用的多磷酸激酶若是具有以多磷酸為磷酸供體，將NDP磷酸化，合成NTP的活性的多磷酸激酶(E.C.2.7.4.1)，則無(wú)特別限定，不限于來(lái)源于動(dòng)物、植物、微生物等特定來(lái)源的多磷酸激酶。其中，從制備酶的簡(jiǎn)便程度等考慮，較好的是使用來(lái)源于大腸桿菌的多磷酸激酶。此外，也可利用近年來(lái)的基因工程技術(shù)，克隆多磷酸激酶基因，以大腸桿菌等為宿主，大量生產(chǎn)多磷酸激酶，通過(guò)該重組體制備酶(J.Biol.Chem.,267,22556-22561(1992))。
添加在反應(yīng)系中的多磷酸激酶只要具有上述活性，可以是形式的。其具體例子包括微生物菌體、該菌體的處理物或由該處理物得到的酶制劑等。
微生物菌體的制備可用以下方法進(jìn)行用可培養(yǎng)該微生物的培養(yǎng)基，以常法培養(yǎng)后，通過(guò)離心分離等收集菌體。下面以屬于芽胞桿菌屬或大腸桿菌屬的細(xì)菌為例進(jìn)行具體說(shuō)明?？墒褂萌庵囵B(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％食鹽)或2×YT培養(yǎng)基(1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％食鹽)等作為培養(yǎng)基，將菌種在該培養(yǎng)基上接種后，在視需要進(jìn)行攪拌的同時(shí)，在30～50℃培養(yǎng)10-50小時(shí)左右，然后將所得的培養(yǎng)液離心分離，收集微生物菌體，由此可制成具有多磷酸激酶活性的微生物菌體。
微生物菌體處理物的例子有將上述微生物菌體通過(guò)機(jī)械性破壞(用韋林氏混勻器、弗氏壓碎器、勻漿器、研缽等)、凍融、自體消化、干燥(通過(guò)冷凍干燥、風(fēng)干等)、酶處理(用溶菌酶等)、超聲波處理、化學(xué)處理(酸、堿處理等)等一般性處理方法處理后得到的菌體破壞物或菌體細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的變性物。
酶制劑的例子有用通常的酶的純化手段(鹽析處理、等電點(diǎn)沉淀處理、有機(jī)溶劑沉淀處理、透析處理、各種色譜處理等)對(duì)上述菌體處理物中具有多磷酸激酶活性的部分進(jìn)行處理后所得的粗制酶或純化的酶。
添加在反應(yīng)液中的NDP可以是市售品。使用濃度例如可在1～200mM，最好在10～100mM的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行設(shè)定。此外，添加的多磷酸也可以是市售品。使用濃度可在換算成無(wú)機(jī)磷酸為1～1000mM，最好在10～200mM的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行設(shè)定。
從NDP向NTP的轉(zhuǎn)換可用以下方法進(jìn)行往pH在4～9的范圍內(nèi)的適當(dāng)?shù)木彌_液中加入NDP和多磷酸，再加入0.001單位/ml以上，最好為0.001-1.0單位/ml的多磷酸激酶，在30℃以上，最好在32-37℃反應(yīng)1-50小時(shí)，視需要，同時(shí)進(jìn)行攪拌。
在將由其他酶反應(yīng)生成的NDP再生成NTP時(shí)，除添加NDP外，其他反應(yīng)條件與上述反應(yīng)條件相同。
通過(guò)上述合成或再生而得到的NTP可視需要用通常的核苷酸分離純化方法(離子交換柱層析、吸附柱層析、鹽析等)進(jìn)行分離純化。此外，例如在以下所示的存在糖核苷酸合成酶等的體系中，NTP可有效地用作底物，用于寡糖合成等。
即，可構(gòu)筑實(shí)用的受體糖的葡糖基化化合物的合成系，其中，在用葡糖基轉(zhuǎn)移酶從糖核苷酸和受體糖制造受體糖的葡糖基化化合物的同時(shí)，將在該反應(yīng)中生成的NMP或NDP轉(zhuǎn)換成NTP，然后再轉(zhuǎn)換成糖核苷酸，進(jìn)行再循環(huán)。在該制造受體糖的葡糖基化化合物的方法中，用多磷酸激酶作為酶，用多磷酸作為磷酸供體，進(jìn)行NDP向NTP的轉(zhuǎn)換。
該合成系的特征在于，在用葡糖基轉(zhuǎn)移酶將糖核苷酸的葡糖基轉(zhuǎn)移至受體糖、合成受體糖的葡糖基化化合物的同時(shí)，用多磷酸和多磷酸激酶將由轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成的NMP或NDP再生成NTP進(jìn)行再利用。
此外，若從別的角度看，該合成系的特征在于，在該合成系中共存著用葡糖基化轉(zhuǎn)移酶將糖核苷酸中的葡糖基殘基轉(zhuǎn)移至受體糖、合成受體糖的葡糖基化化合物的反應(yīng)系和用多磷酸和多磷酸激酶將由轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成的NMP或NDP再生成NTP的反應(yīng)系。
該合成系中使用的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的例子有半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰氨基葡糖基轉(zhuǎn)移酶等。
因此，用該酶所得的受體糖的葡糖基化化合物的例子有在受體糖上加合了半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、甘露糖、葡糖醛酸、唾液酸、N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰氨基葡糖的化合物。
此外，受體糖若是具有上述葡糖基轉(zhuǎn)移酶可識(shí)別為底物的糖鏈的化合物，則無(wú)特別限定，其例子有單糖、寡糖、多糖、糖蛋白、糖脂等。此外，構(gòu)成這些受體糖的糖不限于通常的糖，也可包括脫氧糖、氨基酸、糖醛酸、糖化物、糖醇。
在上述合成系中NTP向糖核苷酸的轉(zhuǎn)換可通過(guò)NDP-葡糖基焦磷酸化酶和糖1-磷酸與NTP的反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。此外，當(dāng)由該反應(yīng)得到的糖核苷酸所具有的葡糖基殘基與所需的葡糖基殘基不同時(shí)，可通過(guò)其與差向異構(gòu)酶、脫氫酶、合成酶等的反應(yīng)而轉(zhuǎn)換成所需的糖核苷酸。
上述合成系的適用范圍極為廣泛，只要根據(jù)作為目的的葡糖基化生成物，從公知的底物和酶中適當(dāng)?shù)剡x擇構(gòu)成上述合成系的要素進(jìn)行使用即可，并不限于上述列出的例子。
關(guān)于上述合成系的具體的要素組合，已有若干報(bào)道，這些文獻(xiàn)(日本專(zhuān)利公開(kāi)公報(bào)1995年第79792號(hào)、PCT專(zhuān)利申請(qǐng)公報(bào)1994年第505638號(hào)、1995年第500248號(hào)、1996年第509619號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利No.5,409,817等)在本說(shuō)明書(shū)中引作參考。但在已知的報(bào)道中，在從NDP向NTP的轉(zhuǎn)換中使用的磷酸供體與激酶的組合僅例舉了乙酰磷酸與乙酸激酶的組合及烯醇丙酮酸磷酸與丙酮酸激酶的組合，在本發(fā)明中，與這些組合不同，用多磷酸作為磷酸供體，用多磷酸激酶作為激酶。
下面說(shuō)明上述合成系的適用例。
(1)在用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶從糖核苷酸和受體糖制造該受體糖的半乳糖基化化合物的同時(shí)，將在該反應(yīng)中生成的NDP轉(zhuǎn)換成NTP，然后再轉(zhuǎn)換成糖核苷酸，進(jìn)行再循環(huán)的受體糖的半乳糖基化化合物的制造方法(圖1和圖2)。
(2)在用葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶從糖核苷酸和受體糖制造該受體糖的葡糖醛酸基化化合物的同時(shí)，將在該反應(yīng)中生成的NDP轉(zhuǎn)換成NTP，然后再轉(zhuǎn)換成糖核苷酸，進(jìn)行再循環(huán)的受體糖的葡糖醛酸基化化合物的制造方法(圖3)。
(3)在用葡糖基轉(zhuǎn)移酶從糖核苷酸和受體糖制造該受體糖的葡糖基化化合物的同時(shí)，將在該反應(yīng)中生成的NDP轉(zhuǎn)換成NTP，然后再轉(zhuǎn)換成糖核苷酸，進(jìn)行再循環(huán)的受體糖的葡糖基化化合物的制造方法(圖4)。
(4)在用巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶從糖核苷酸和受體糖制造該受體糖的巖藻糖基化化合物的同時(shí)，將在該反應(yīng)中生成的NDP轉(zhuǎn)換成NTP，然后再轉(zhuǎn)換成糖核苷酸，進(jìn)行再循環(huán)的受體糖的巖藻糖基化化合物的制造方法(圖5和圖6)。
(5)在用甘露糖基轉(zhuǎn)移酶從糖核苷酸和受體糖制造該受體糖的甘露糖基化化合物的同時(shí)，將在該反應(yīng)中生成的NDP轉(zhuǎn)換成NTP，然后再轉(zhuǎn)換成糖核苷酸，進(jìn)行再循環(huán)的受體糖的甘露糖基化化合物的制造方法(圖7)。
(6)在用N-乙酰氨基葡糖基轉(zhuǎn)移酶從糖核苷酸和受體糖制造該受體糖的N-乙酰氨基葡糖基化化合物的同時(shí)，將在該反應(yīng)中生成的NDP轉(zhuǎn)換成NTP，然后再轉(zhuǎn)換成糖核苷酸，進(jìn)行再循環(huán)的受體糖的N-乙酰氨基葡糖基化化合物的制造方法(圖8)。
(7)在用N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶從糖核苷酸和受體糖制造該受體糖的N-乙酰氨基半乳糖基化化合物的同時(shí)，將在該反應(yīng)中生成的NDP轉(zhuǎn)換成NTP，然后再轉(zhuǎn)換成糖核苷酸，進(jìn)行再循環(huán)的受體糖的N-乙酰氨基半乳糖基化化合物的制造方法(圖9)。
此外，上述(6)和(7)的合成系也可通過(guò)NDP-Gal NAc4-差向異構(gòu)酶與NDP-Gal NAc的反應(yīng)，生成NDP-Glc NAc而同時(shí)進(jìn)行(參見(jiàn)圖8和圖9)。
(8)在用唾液酸轉(zhuǎn)移酶從糖核苷酸和受體糖制造該受體糖的唾液酸基化化合物的同時(shí)，將在該反應(yīng)中生成的NDP轉(zhuǎn)換成NTP，然后再轉(zhuǎn)換成糖核苷酸，進(jìn)行再循環(huán)的受體糖的唾液酸基化化合物的制造方法(圖10)。
在上述合成系中，酶的使用形式與上述多磷酸激酶同樣，可以是微生物菌體、酶制劑等。此外，本發(fā)明合成系中的最佳反應(yīng)條件可在公知范圍內(nèi)，根據(jù)最終產(chǎn)物的葡糖基化生成物進(jìn)行適當(dāng)?shù)男∫?guī)模試驗(yàn)作出決定。
具體地說(shuō)，NDP-糖焦磷酸化酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、多磷酸激酶等各種酶可在0.0001～100.0單位/ml，最好在0.001～10.0單位/ml的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇。此外，NTP、糖1-磷酸、受體糖、多磷酸等底物可在0.01-1000mM，最好在1～200mM的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。合成反應(yīng)可通過(guò)往pH在3～10范圍內(nèi)的適當(dāng)?shù)木彌_液中加入各種酶和底物，在30℃以上，最好在32～37℃反應(yīng)1～100小時(shí)而進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)可根據(jù)需要同時(shí)進(jìn)行攪拌。
由上述反應(yīng)得到的葡糖基化生成物可用公知的方法(各種柱層析法)進(jìn)行分離純化。
實(shí)施例下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例中DNA的制備、用限制酶進(jìn)行的酶切、用T4DNA連接酶進(jìn)行的DNA連接及大腸桿菌的轉(zhuǎn)化均按《(Molecular Cloning》(Maniatis等編，Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York(1982))中所述的方法進(jìn)行。此外，限制酶、AmpliTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶由日本寶酒造株式會(huì)社購(gòu)得。反應(yīng)液中核苷酸類(lèi)的定量是用HPLC法進(jìn)行的。具體地說(shuō)，分離是通過(guò)使用YMC公司的ODS-AQ312柱，以0.5M磷酸二氫鉀溶液為洗脫液進(jìn)行的。實(shí)施例1用多磷酸激酶合成NTP(1)大腸桿菌多磷酸激酶基因的克隆用齊藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta.,72,619(1963))制備大腸桿菌K12株JM109菌(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)的染色體DNA。以該DNA為模板，用常法合成下面二種引物DNA，用PCR法擴(kuò)增大腸桿菌多磷酸激酶(ppk)。
引物(A)5＇-TACCATGGGTCAGGAAAAGCTATA-3＇引物(B)5＇-ATGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGA-3＇ppk基因的PCR擴(kuò)增通過(guò)用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司的DNA熱循環(huán)儀循環(huán)處理反應(yīng)液25次來(lái)進(jìn)行，所述反應(yīng)液(100μl)由50mM氯化鉀、10mMTris-鹽酸(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、模板DNA 0.1μg、引物DNA(A)和(B)各0.2μM、AmpliTaqDNA聚合酶2.5單位組成，各熱循環(huán)由熱變性(94℃,1分鐘)、退火(55℃,1.5分鐘)、聚合(72℃,1.5分鐘)組成。
基因擴(kuò)增后，用酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應(yīng)液，往水溶性部分中加入2倍體積的乙醇，沉淀出DNA。按文獻(xiàn)(《Molecular Cloning》，見(jiàn)上)的方法通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)回收的DNA沉淀物進(jìn)行分離，純化出1.9kb的DNA片段。將該DNA用限制酶NcoⅠ和BamHⅠ酶切，用T4DNA連接酶將其與用相同的限制酶NcoⅠ和BamHⅠ消化過(guò)的質(zhì)粒pTrc99A(Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品)連接。用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌，從所得的耐氨芐西林轉(zhuǎn)化體中分離出質(zhì)粒pTrc-PPK。pTrc-PPK是在pTrc99A的trc啟動(dòng)子下游的NcoⅠ-BamHⅠ酶切部位中插入了含大腸桿菌ppk基因的NcoⅠ-BamHⅠDNA片段的產(chǎn)物。
(2)大腸桿菌多磷酸激酶的制備將包含質(zhì)粒pTrc-PPK的大腸桿菌JM109菌接種在含100μg/ml氨芐西林的2×YT培養(yǎng)基300ml中，在37℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到4×108菌/ml時(shí)，添加IPTG，使其在培養(yǎng)液中的終濃度為1mM，再在30℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)5小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離(9,000×g,10分鐘)回收菌體，然后將其懸浮在60ml緩沖液(50mM Tris-鹽酸(pH7.5)、5mMEDTA、0.1％Triton X-100、0.2mg/ml溶菌酶)中。在37℃保溫1小時(shí)后，進(jìn)行超聲波處理，將菌體破碎，再進(jìn)行離心分離(20,000×g,10分鐘)，除去菌體殘?jiān)?br> 將如此制得的上清部分在含5mM氯化鎂和1mM 2-巰基乙醇的50mM Tris-鹽酸(pH7.8)中進(jìn)行透析，得到粗制酶試樣。粗制酶試樣中多磷酸激酶比活性為0.19單位/mg蛋白，是對(duì)照菌(包含pTrc99A的大腸桿菌JM109菌)的比活性(0.00018單位/mg蛋白)的約1000倍。還有，按秋山等的方法(J.Biol.Chem.,267,22556-22561(1992))通過(guò)電泳將多磷酸激酶純化至均一物質(zhì)，將其作為純化酶試樣。其比活性為0.7單位/mg蛋白。
本發(fā)明中多磷酸激酶活性的單位按以下方法測(cè)定、算出。
往含5mM氯化鎂、100mM硫酸銨、5mM ADP和多磷酸(以無(wú)機(jī)磷酸計(jì)，為150mM)的25mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.8)中加入酶試樣，保溫于37℃進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)在100℃熱處理1分鐘使反應(yīng)停止。用高壓液相色譜法(HPLC)對(duì)反應(yīng)液中的ATP進(jìn)行定量，將1分鐘內(nèi)在37℃生成1微摩爾ATP的活性作為1個(gè)單位。
(3)NTP的合成Ⅰ往含10mM氯化鎂、100mM硫酸銨、多磷酸(以無(wú)機(jī)磷酸計(jì)，為50mM)和5mM NTP(ADP、CDP、GDP、UDP、IDP)的25mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.8)中加入多磷酸激酶的純化酶試樣0.01單位/ml，在37℃反應(yīng)18小時(shí)。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1生成物NTP(mM)底物NDP(mM) 添加多磷酸 未添加多磷酸ADP(5.0) ATP(1.01)ATP(0)CDP(5.0) CTP(0.13)CTP(0)GDP(5.0) GTP(0.19)GTP(0)UDP(5.0) UTP(0.09)UTP(0)IDP(5.0) ITP(0.76)ITP(0)(4)NTP的合成Ⅱ往含10mM氯化鎂、100mM硫酸銨、多磷酸(以無(wú)機(jī)磷酸計(jì)，為50mM)和25mM NDP(ADP、CDP、GDP、UDP)的100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.8)中加入多磷酸激酶的純化酶試樣0.17單位/ml，在37℃反應(yīng)16小時(shí)。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2底物NDP(mM)生成物NTP(mM)ADP(25.0)ATP(12.2)CDP(25.0)CTP(5.63)GDP(25.0)GTP(10.8)
UDP(25.0)UTP(12.3)(5)大腸桿菌多磷酸激酶的多磷酸合成(NDP生成)活性將從底物NTP合成多磷酸(即上述實(shí)施例的逆反應(yīng))的活性以NDP的生成作為指標(biāo)進(jìn)行解析。即，往含10mM氯化鎂、100mM硫酸銨和5mM NDP(ATP、CTP、GTP、UTP)的25mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.8)中加入多磷酸激酶的粗制酶試樣0.01單位/ml，在37℃溫育18小時(shí)。
用HPLC解析所得反應(yīng)液，結(jié)果見(jiàn)表3。表3清楚地表明，在本反應(yīng)條件下來(lái)發(fā)現(xiàn)以ATP以外的NTP為底物的多磷酸合成。
表3底物NTP(mM) 生成物NDP(mM)ATP(5.0)ADP(1.58)CTP(5.0)CDP(＜0.01)GTP(5.0)GDP(＜0.01)UTP(5.0)UDP(＜0.01)實(shí)施例2用多磷酸激酶從UDP合成UDP-葡萄糖(UDPG)(1)大腸桿菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆用齊藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta.,72,619(1963))制備大腸桿菌K12株JM109菌(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)的染色體DNA。以該DNA為模板，用常法合成下面二種引物DNA，用PCR法擴(kuò)增大腸桿菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(galU)基因(Weissborn等，J.Bacteriol.,176,2611(1994))。
引物(C)5＇-GCGAATTCTGATATACTGGGATGCGATAC-3＇引物(B)5＇-ACGTCGACACCGATACGGATGTATCTT-3＇galU基因的PCR擴(kuò)增通過(guò)用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司的DNA熱循環(huán)儀循環(huán)處理反應(yīng)液25次來(lái)進(jìn)行，所述反應(yīng)液(100μl)由50mM氯化鉀、10mMTris-鹽酸(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、模板DNA 0.1μg、引物(C)和(D)各0.2μM、AmpliTaqDNA聚合酶2.5單位組成，各熱循環(huán)由熱變性(94℃,1分鐘)、退火(55℃,1.5分鐘)、聚合(72℃,1.5分鐘)組成。
基因擴(kuò)增后，用酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應(yīng)液，往水溶性部分中加入2倍體積的乙醇，沉淀出DNA。按文獻(xiàn)(《Molecular Cloning》，見(jiàn)上)的方法通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)回收的DNA沉淀物進(jìn)行分離，純化出1.0kb的DNA片段。將該DNA用限制酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切，用T4DNA連接酶將其與用相同的限制酶EcoRⅠ和SalⅠ消化過(guò)的質(zhì)粒pTrc99A(Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品)連接。用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌，從所得的耐氨芐西林轉(zhuǎn)化體中分離出質(zhì)粒pTrc-galU。pTrc-galU是在pTrc99A的trc啟動(dòng)子下游的EcoRⅠ-SalⅠ酶切部位中插入了含大腸桿菌galU基因的EcoRⅠ-SalⅠDNA片段的產(chǎn)物。
(2)大腸桿菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的制備將包含質(zhì)粒pTrc-galU的大腸桿菌JM109菌接種在含100μg/ml氨芐西林的2×YT培養(yǎng)基300ml中，在37℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到4×108菌/ml時(shí)，添加IPTG，使其在培養(yǎng)液中的終濃度為1mM，再在37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2.5小時(shí)。
培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離(9,000×g,10分鐘)回收菌體，然后將其懸浮在60ml緩沖液(50mM Tris-鹽酸(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.2mg/ml溶菌酶)中。在37℃保溫1小時(shí)后，進(jìn)行超聲波處理，將菌體破碎，再進(jìn)行離心分離(20,000×g,10分鐘)，除去菌體殘?jiān)?。將如此制得的上清部分作為酶試樣。酶試樣中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的活性與對(duì)照菌(包含pTrc99A的大腸桿菌JM109菌)一起列在下面的表中。
表4菌株 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶活性JM109/pTrc99A＜0.5(單位/mg蛋白)JM109/pTrc-galU20.4UDP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的單位按以下方法測(cè)定、算出。即，往含5mM氯化鎂、6mMUTP和6mM葡萄糖1-磷酸的50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)中加入酶試樣，保溫于37℃進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)在100℃熱處理5分鐘使酶失活。用HPLC法對(duì)反應(yīng)液中的UDPG進(jìn)行定量，將1分鐘內(nèi)在37℃生成1微摩爾UDPG的活性作為1個(gè)單位。
(3)UDPG的合成往含100mM硫酸銨、10mM氯化鎂、20mMUDP、30mM葡萄糖1-磷酸和多磷酸(以無(wú)機(jī)磷酸計(jì)，為50mM)的100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.8)中分別加入大腸桿菌多磷酸激酶粗制酶試樣(0.17單位/ml)和大腸桿菌UDPG焦磷酸化酶的酶試樣(2.0單位/ml)，在37℃保溫。反應(yīng)7.5小時(shí)后，用HPLC法對(duì)反應(yīng)液中的UDPG進(jìn)行定量，確認(rèn)有5.5mM的UDPG生成。此外，反應(yīng)24小時(shí)后，確認(rèn)有10.1mM的UDPG生成。而未在上述反應(yīng)液中添加多磷酸的對(duì)照組在反應(yīng)7.5小時(shí)和24小時(shí)后其UDPG的生成分別為0.23mM和0.20mM。實(shí)施例3寡糖的合成(1)大腸桿菌UDP-半乳糖4-差向異構(gòu)酶基因(galE)的克隆用齊藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta.,72,619(1963))制備大腸桿菌K12株JM109菌(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)的染色體DNA。以該DNA為模板，用常法合成下面二種引物DNA，用PCR法擴(kuò)增大腸桿菌UDP-半乳糖4-差向異構(gòu)酶(galE)基因。
引物(E)5＇-TAGAATTCATACCATAAGCCTAATGGA-3＇引物(F)5＇-TAGGATCCTTAATCGGGATATCCCTGT-3＇galE基因的PCR擴(kuò)增通過(guò)用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司的DNA熱循環(huán)儀循環(huán)處理反應(yīng)液25次來(lái)進(jìn)行，所述反應(yīng)液(100μl)由50mM氯化鉀、10mMTris-鹽酸(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、模板DNA 0.1μg、引物DNA(E)和(F)各0.2μM、AmpliTaqDNA聚合酶2.5單位組成，各熱循環(huán)由熱變性(94℃,1分鐘)、退火(55℃,1.5分鐘)、聚合(72℃,1.5分鐘)組成。
基因擴(kuò)增后，用酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應(yīng)液，往水溶性部分中加入2倍體積的乙醇，沉淀出DNA。按文獻(xiàn)(《Molecular Cloning》，見(jiàn)上)的方法通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)回收的DNA沉淀物進(jìn)行分離，純化出1.0kb的DNA片段。將該DNA用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，用T4DNA連接酶將其與用相同的限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化過(guò)的質(zhì)粒pTrc99A(Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品)連接。用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌，從所得的耐氨芐西林轉(zhuǎn)化體中分離出質(zhì)粒pTrc-galE。pTrc-galE是在pTrc99A的trc啟動(dòng)子下游的EcoRⅠ-BamHⅠ酶切部位中插入了含大腸桿菌galE基因的EcoRⅠ-BamHⅠDNA片段的產(chǎn)物。
(2)大腸桿菌UDP-半乳糖4-差向異構(gòu)酶的制備將包含質(zhì)粒pTrc-galE的大腸桿菌JM109菌接種在含100μg/ml氨芐西林的2×YT培養(yǎng)基300ml中，在37℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到4×108菌/ml時(shí)，添加IPTG，使其在培養(yǎng)液中的終濃度為1mM，再在37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離(9,000×g,10分鐘)回收菌體，然后將其懸浮在60ml緩沖液(50mM Tris-鹽酸(pH7.5)、5mM EDTA、0.2mg/ml溶菌酶)中。在0℃保溫20分鐘后，進(jìn)行超聲波處理，將菌體破碎，再進(jìn)行離心分離(20,000×g,10分鐘)，除去菌體殘?jiān)?br> 將如此制得的上清部分作為粗制酶試樣。粗制酶試樣中UDP-半乳糖4-差向異構(gòu)酶的比活性為26.6單位/mg蛋白，為對(duì)照菌(包含pTrc99A的大腸桿菌JM109菌)的比活性(0.011單位/mg蛋白)的約2400倍。
在本發(fā)明中，UDP-半乳糖4-差向異構(gòu)酶活性的單位按以下方法測(cè)定、算出。即，將在含10mMUDP-葡萄糖的40mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.8)中，于1分鐘內(nèi)在37℃生成1微摩爾UDP-半乳糖的活性作為1個(gè)單位。
(3)乳糖(Gal(β1-4)Glc)的合成(參見(jiàn)圖11)往含10mM氯化鎂、10mM氯化錳、20mM葡萄糖、4mM UTP、30mM葡萄糖1-磷酸和0.2mg/mlα-乳白蛋白的25mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.8)中加入多磷酸，使其濃度達(dá)到150mM(以磷酸計(jì))，再加入0.5單位/ml來(lái)源于牛奶的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Sigma公司產(chǎn)品)、1.0單位/ml UDP-半乳糖焦磷酸化酶、1.0單位/ml UDP-半乳糖4-差向異構(gòu)酶、0.1單位/ml多磷酸激酶，在37℃保溫20小時(shí)。用糖分析裝置(Dionex公司產(chǎn)品)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行了分析，確認(rèn)有12.4mM的乳糖生成。
(4)N-乙酰乳糖胺(Gal(β1-4)GlcNAc)的合成(參見(jiàn)圖12)往含10mM氯化鎂、10mM氯化錳、20mMN-乙酰葡糖胺、4mM UTP、30mM葡萄糖1-磷酸的25mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.8)中加入多磷酸，使其濃度達(dá)到150mM(以磷酸計(jì))，再加入0.5單位/ml來(lái)源于牛奶的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Sigma公司產(chǎn)品)、1.0單位/ml UDP-半乳糖焦磷酸化酶、1.0單位/ml UDP-半乳糖4-差向異構(gòu)酶、0.1單位/ml多磷酸激酶，在37℃保溫20小時(shí)。用糖分析裝置(Dionex公司產(chǎn)品)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行了分析，確認(rèn)有13.6mM的N-乙酰乳糖胺生成。
產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用的可能性根據(jù)本發(fā)明，可簡(jiǎn)便且低成本地用酶從NDP合成NTP。此外，還可在與糖核苷酸合成等組合的寡糖的酶合成系中無(wú)需在從NDP再生或轉(zhuǎn)換成NTP的反應(yīng)中使用昂貴的烯醇丙酮酸磷酸或ATP等，從而可低成本地再循環(huán)合成糖核苷酸和與其相關(guān)的寡糖。
權(quán)利要求
1．從5＇-二磷酸腺苷以外的5＇-二磷酸核苷(NDP)制造5＇-三磷酸核苷(NTP)的方法，其特征在于，使用多磷酸激酶作為酶，使用多磷酸作為磷酸供體。
2．從由其他酶反應(yīng)生成的5＇-二磷酸腺苷以外的NDP再生NTP的方法，其特征在于，使用多磷酸激酶作為酶，使用多磷酸作為磷酸供體。
3．制造受體糖的葡糖基化化合物的方法，其中，在用葡糖基轉(zhuǎn)移酶從糖核苷酸和受體糖制造所述受體糖的葡糖基化化合物的同時(shí)，將在該反應(yīng)中生成的5＇-一磷酸核苷(NMP)或NDP轉(zhuǎn)換成NTP，然后再轉(zhuǎn)換成糖核苷酸，從而將NMP或NDP進(jìn)行再循環(huán)，其特征在于，在該方法中，用多磷酸激酶作為酶，用多磷酸作為磷酸供體。
4．如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述葡糖基化轉(zhuǎn)移酶是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶或N-乙酰氨基葡糖基轉(zhuǎn)移酶；所述受體糖的葡糖基化化合物是在受體糖上加合了半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、甘露糖、葡糖醛酸、唾液酸、N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰氨基葡糖的化合物。
5．如權(quán)利要求3或4所述的制造方法，其特征在于，從NTP向糖核苷酸的轉(zhuǎn)換通過(guò)NTP與NDP-葡糖基焦磷酸化酶和糖1-磷酸反應(yīng)，根據(jù)需要，再與差向異構(gòu)酶、脫氫酶或合成酶的反應(yīng)而進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從5′－二磷酸腺苷以外的5′－二磷酸核苷(NDP)制造5′－三磷酸核苷(NTP)的方法,其特征在于用多磷酸激酶作為酶,用多磷酸作為磷酸供體,本發(fā)明還涉及該方法在各種葡糖基化反應(yīng)中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明,可簡(jiǎn)便且低成本地用酶從NDP合成NTP。此外,還可在與糖核苷酸合成等組合的寡糖的酶合成系中無(wú)需在從NDP再生或轉(zhuǎn)換成NTP的反應(yīng)中使用昂貴的烯醇丙酮酸磷酸或ATP等,從而可低成本地再循環(huán)合成糖核苷酸和與其相關(guān)的寡糖。
文檔編號(hào)C12N9/90GK1209844SQ97191778
公開(kāi)日1999年3月3日 申請(qǐng)日期1997年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月19日
發(fā)明者野口利忠, 柴肇一 申請(qǐng)人:山佐醬油株式會(huì)社