本發(fā)明屬于病毒診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及HPV-58病毒E6/E7致癌基因共同標準對照質(zhì)粒的構(gòu)建方案及在細胞樣本中E6以及E7致癌基因拷貝數(shù)的絕對定量檢測方法。

背景技術(shù)：

人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是導致宮頸癌的一個重要因素。宮頸癌在婦科腫瘤中發(fā)病率居第2位，全球每年新發(fā)病例約50萬人，死亡例數(shù)約25萬人。

HPV基因組DNA全長約8kb，包括6個早期基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)開放式閱讀框(open-reading frame，ORF)、2個晚期基因(L1、L2)開放式閱讀框及1個非編碼長控制區(qū)(non-coding long control region，LCR)，其中，E6、E7基因為兩個主要的原癌基因。

HPV分為皮膚型和粘膜型2大類。粘膜型HPV主要感染人泌尿生殖道的黏膜上皮，導致與泌尿生殖器官相關(guān)的多種疾病。根據(jù)與癌癥發(fā)生的關(guān)系大小，粘膜型HPV分為高危型(high-risk，HR)和低危型(low-risk，LR)。高危型主要有HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66型；而低危型主要有HPV-6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81型?；诜肿恿餍胁W和病毒學的研究發(fā)現(xiàn)，HPV特別是高危型HPV感染宮頸可發(fā)展為宮頸癌，宮頸鱗狀細胞癌患者中，58型HPV為其中的一個主要感染亞型，其E6/E7致癌基因的在組織細胞中的拷貝數(shù)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

目前，針對人乳頭狀瘤病毒基因的實驗室檢測和研究方面主要采用相對定量PCR檢測、核酸雜交檢測(包括核酸印跡原位雜交、斑點雜交、雜交捕獲等)。這些方法可進行HPV分型，實時PCR檢測可以初步對病毒拷貝數(shù)進行相對定量。值得注意的是，常用的相對定量檢測方法由于沒有設計病毒拷貝數(shù)的標準對照參比品及絕對定量拷貝數(shù)計算體系，因而對于細胞樣品中病毒絕對拷貝數(shù)的具體信息未能知曉，因而不能為后續(xù)的研究和結(jié)果解讀提供足夠的信息。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對58型HPV病毒E6及E7致癌基因構(gòu)建共同標準品質(zhì)粒，建立58型HPV病毒E6及E7致癌基因在細胞樣品中的絕對定量檢測體系，該檢測體系的建立既可以通過檢測E6基因，又可以通過檢測E7基因，快速斷定細胞樣品是否受到HPV病毒感染，且對細胞樣品中中HPV-58型病毒E6及E7致癌基因DNA拷貝數(shù)進行絕對定量，從而為細胞樣品后續(xù)的研究，樣品病毒感染情況和癌變可能的預判解讀提供足夠的信息。

本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)：一種58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷貝數(shù)的絕對定量檢測方法，經(jīng)過下列各步驟：

(1)構(gòu)建58型HPV病毒E6/E7標準品質(zhì)粒：

a.根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中58型HPV(GenBank：D90400.1)基因序列，針對E6/E7基因區(qū)，按下述設計特異性引物：

HPV58E6/E7For：5'-ACG GTC TGA CCG AAA CCG GTG-3'

HPV58E6/E7Rev：5'-ACC TCA AAC CAG CCA GTA CAG-3'

b.HPV-58陽性細胞中總DNA的提?。合葘?mL HPV-58陽性細胞保存液吸入1.5mL滅菌的EP管中，在4℃下以13000rpm離心5min；棄上清，往沉淀中加入1mL Tris-HCl洗滌緩沖液【50mM Tris-HCl(pH 8.1)，1mM EDTA，0.5％Tween 20】，在4℃下以13000rpm離心5min；棄上清，再加入1mL Tris-HCl洗滌緩沖液，在4℃下以13000rpm離心5min，棄上清；往沉淀中加入200μL濃度為0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液，在50℃下消化過夜；然后以95℃沸水煮沸變性10min；再在4℃下以13000rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至0.5mL EP管中，-70℃下凍存，得到58型HPV基因組DNA；

c.將步驟(1)b所得58型HPV基因組DNA通過PCR的方法，利用步驟a的特異性引物擴增58型HPV病毒E6/E7基因，將擴增產(chǎn)物連接到pMD-18T Vector克隆載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑單克隆進行測序鑒定，獲得58型HPV目的基因序列鑒定正確的陽性菌株；

d.將步驟(1)c所得序列鑒定正確的陽性菌株分別進行常規(guī)培養(yǎng)，獲得58型HPV標準品質(zhì)粒，并用紫外分光光度計測定58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒的濃度，再按下列公式計算標準品質(zhì)粒的拷貝數(shù)：

Number of copies(copies/μl)＝(Amount×6.022×10²³)/(Length×1×10⁹×650)

其中，Amount為紫外分光光度計測得標準品質(zhì)粒所測含量(ng/μl)，Length代表模板DNA長度；

(2)參照步驟(1)c所得的58型HPV病毒目的基因序列分別設計下列58型HPV病毒E6和E7的熒光定量PCR特異性引物：

HPV58E6For：5'-TGT CAG GCG TTG GAG ACA TC-3'

HPV58E6Rev：5'-ATA GCA ATC GTA AGC ACA CT-3'

HPV58E7For：5'-ACC AAC TGA CCT ATT CTG CTA TG-3'

HPV58E7Rev：5'-ACG TCG GTT GTT GTA CTG TTG AT-3'

(3)利用步驟(1)d所得58型HPV病毒標準品質(zhì)粒分別檢測細胞樣品中的E6和E7致癌基因拷貝數(shù)，具體檢測方法如下：

a.將步驟(1)d所得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒用雙蒸水按梯度稀釋至10^-7，按PCR反應體系以SYBR法實時熒光定量PCR檢測標準品質(zhì)粒擴增效率和特異性，通過熒光定量PCR檢測直接獲得58型HPV標準品質(zhì)粒的擴增曲線與溶解曲線，同時根據(jù)熒光定量PCR檢測所得標準品Ct值作為X軸，標準品拷貝數(shù)log₁₀作為Y軸繪制58型HPV標準品質(zhì)粒的標準曲線，進而得到58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒的標準曲線方程：

所述PCR反應體系如下：

表1熒光定量PCR反應體系(反應總體積為20μl)

采用的反應程序如下：

b.按步驟(3)a提供的PCR反應體系以SYBR法實時熒光定量PCR檢測細胞樣品DNA，分別根據(jù)步驟(3)a利用標準品質(zhì)粒得到標準曲線和標準曲線方程，進而獲得細胞樣品中HPV病毒E6及E7致癌基因的絕對定量拷貝數(shù)。

所述步驟(3)a中用雙蒸水按梯度稀釋至10^-7是指將58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒分別用雙蒸水稀釋成以下梯度：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7。

本發(fā)明是通過檢索NCBI 58型HPV病毒基因組序列，針對58型HPV病毒E6/E7基因，以47-941位點區(qū)域構(gòu)建HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒，即將58型HPV病毒E6/E7基因選定區(qū)構(gòu)建到同一個載體上，建立58型HPV病毒E6/E7致癌基因絕對定量體系，該檢測體系的建立既可以通過檢測E6基因，又可以通過檢測E7基因，快速斷定細胞樣品是否受到HPV病毒感染，并對細胞樣品中HPV病毒E6/E7致癌基因拷貝數(shù)進行絕對定量，從而對細胞癌變的預后判斷提供數(shù)據(jù)參考。

本發(fā)明具備的優(yōu)點和效果：本發(fā)明是針對58型HPV病毒E6/E7基因特定區(qū)域構(gòu)建標準品質(zhì)粒，即將58型HPV病毒E6/E7基因選定區(qū)域基因構(gòu)建到同一個載體上，隨后通過建立的58型HPV病毒E6/E7致癌基因熒光定量PCR絕對定量體系進行檢測，該E6/E7致癌基因共同標準品對照質(zhì)粒的構(gòu)建及檢測體系的建立既可以通過檢測E6基因，又可以通過檢測E7基因，來達到對細胞樣品中的HPV病毒E6及E7致癌基因DNA拷貝數(shù)進行絕對定量的目的，從而對細胞樣品癌變預后判斷以及干預后對癌變進程的影響提供重要數(shù)據(jù)參考。

附圖說明

圖1為58型HPV病毒E6/E7區(qū)域基因PCR擴增片段；圖中，M：markerDL1200；

圖2為熒光定量PCR檢測直接獲得的58型HPV病毒E6/E7致癌基因標準品質(zhì)粒及宮頸癌細胞樣本中E6基因的擴增曲線；

圖3為熒光定量PCR檢測直接獲得的58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒及宮頸癌細胞樣本中E6基因的溶解曲線；

圖4為58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒檢測E6基因的標準曲線；

圖5為熒光定量PCR檢測直接獲得的58型HPV病毒共同標準品質(zhì)粒及宮頸癌細胞樣本中E7基因的擴增曲線；

圖6為熒光定量PCR檢測直接獲得的58型HPV病毒標準品質(zhì)粒及宮頸癌細胞樣本中E7基因的溶解曲線；

圖7為58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒檢測E7基因的標準曲線。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明做進一步描述。

(1)構(gòu)建58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒：

a.根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中58型HPV病毒E6/E7的序列(GenBank:D90400.1)，按表2設計特異性引物，擴增E6/E7區(qū)基因序列：

表2 58型HPV病毒E6/E7區(qū)域的PCR引物

b.宮頸癌細胞中提取總的DNA：

先將1mL HPV-58陽性組織細胞保存液吸入1.5mL滅菌的EP管中，在4℃下以13000rpm離心5min；棄上清，往沉淀中加入1mL Tris-HCl洗滌緩沖液【50mM Tris-HCl(pH 8.1)，1mM EDTA，0.5％Tween 20】，在4℃下以13000rpm離心5min；棄上清，再加入1mL Tris-HCl洗滌緩沖液，在4℃下以13000rpm離心5min，棄上清；往沉淀中加入200μL濃度為0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液，50℃下消化過夜；然后以95℃沸水煮沸變性10min；再在4℃下以13000rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至0.5mL EP管中，-70℃下凍存，得到58型HPV基因組DNA；

c.將步驟(1)b所得58型HPV基因組DNA通過PCR的方法，利用步驟a的特異性引物擴增58型HPV病毒E6/E7基因，將擴增產(chǎn)物(見圖1)連接到pMD-18T Vector克隆載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑單克隆進行測序鑒定，獲得58型HPV病毒E6/E7目的基因序列鑒定正確的陽性菌株；

d.將步驟(1)c所得序列鑒定正確的陽性菌株分別進行常規(guī)培養(yǎng)，獲得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒，并用紫外分光光度計測定58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒的濃度，再按下列公式計算標準品質(zhì)粒的拷貝數(shù)：

Number of copies(copies/μl)＝(Amount×6.022×10²³)/(Length×1×10⁹×650)

其中，Amount為紫外分光光度計測得標準品質(zhì)粒所測含量(ng/μl)，Length代表模板DNA長度；58型HPV病毒E6/E7標準品質(zhì)粒DNA Length為3587bp。在該實施例中，紫外分光光度計測得58型HPV病毒E6/E7標準品質(zhì)粒Amount為228ng/μl，計算得58型HPV病毒E6/E7標準品質(zhì)粒拷貝數(shù)為5.89×10¹⁰copies/μl。

(2)參照步驟(1)c所得58型HPV病毒E6/E7基因目的基因序列設計表3的E6和E7的熒光定量PCR特異性引物：

表3 58型HPV病毒E6、E7熒光定量PCR引物

(3)利用步驟(1)d所得58型HPV病毒E6/E7標準品質(zhì)粒檢測HPV-58陽性宮頸癌細胞中58型HPV DNA拷貝數(shù)，具體檢測方法如下：

a.將步驟(1)d所得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒用雙蒸水按梯度稀釋至10^-7，即以下梯度：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，分別使用58型HPV病毒E6、E7熒光定量PCR引物，按表4PCR反應體系以SYBR法實時熒光定量PCR檢測標準品質(zhì)粒擴增效率和特異性，通過熒光定量PCR檢測分別獲得58型HPV E6/E7致癌基因共同標準品質(zhì)粒檢測E6、E7基因的擴增曲線(見圖2，圖5)與溶解曲線(見圖3，圖6)，同時根據(jù)熒光定量PCR檢測所得標準品Ct值作為X軸，標準品拷貝數(shù)log₁₀(見表5，表6)作為Y軸繪制58型HPV病毒E6/E7標準品質(zhì)粒的標準曲線(見圖4，圖7)，進而分別得到58型HPV病毒E6/E7標準品質(zhì)粒檢測E6、E7基因的標準曲線方程：y＝-0.3726x+14.478及y＝-0.5477x+15.597。

所述PCR反應體系如表4：

表4熒光定量PCR反應體系(反應總體積為20μl)

采用的反應程序如下：

表5 58型HPV病毒標準品E6基因檢測結(jié)果

表6 58型HPV病毒標準品E7基因檢測結(jié)果

b.按步驟(3)a提供的PCR反應體系以SYBR法實時熒光定量PCR檢測HPV-58病毒陽性宮頸癌細胞中提取的總DNA，獲得宮頸癌細胞樣本中58型HPV病毒E6、E7的擴增曲線(見圖2，圖5)和溶解曲線(見圖3，圖6)，根據(jù)步驟(3)a利用標準品質(zhì)粒得到標準曲線和標準曲線方程(見圖4，圖7)，進而分別獲得宮頸癌細胞中58型HPV病毒E6/E7致癌基因的拷貝數(shù)(見表7和表8)：

表7宮頸癌細胞樣本中58型HPV病毒E6基因檢測結(jié)果

表8宮頸癌細胞樣本中58型HPV病毒E7基因檢測結(jié)果

SEQUENCE LISTING

<110> 中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所

<120> 一種58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷貝數(shù)的絕對定量檢測方法

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 1

acggtctgac cgaaaccggt g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 2

acctcaaacc agccagtaca g 21

<210> 3

<211> 895

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 3

acggtctgac cgaaaccggt gcatatataa agcagacatt ttttggtagg ctactgcagg 60

actatgttcc aggacgcaga ggagaaacca cggacattgc atgatttgtg tcaggcgttg 120

gagacatctg tgcatgaaat cgaattgaaa tgcgttgaat gcaaaaagac tttgcagcga 180

tctgaggtat atgactttgt atttgcagat ttaagaatag tgtatagaga tggaaatcca 240

tttgcagtat gtaaagtgtg cttacgattg ctatctaaaa taagtgagta tagacattat 300

aattattcgc tatatggaga cacattagaa caaacactaa aaaagtgttt aaatgaaata 360

ttaattagat gtattatttg tcaaagacca ttgtgtccac aagaaaaaaa aaggcatgtg 420

gatttaaaca aaaggtttca taatatttcg ggtcgttgga cagggcgctg tgcagtgtgt 480

tggagacccc gacgtagaca aacacaagtg taacctgtaa caacgccatg agaggaaaca 540

acccaacgct aagagaatat attttagatt tacatcctga accaactgac ctattctgct 600

atgagcaatt atgtgacagc tcagacgagg atgaaatagg cttggacggg ccagatggac 660

aagcacaacc ggccacagct aattactaca ttgtaacttg ttgttacact tgtggcacca 720

cggttcgttt gtgtatcaac agtacaacaa ccgacgtacg aaccctacag cagctgctta 780

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atgaccctga aggtacaaac ggggtagggg cgggctgtac tggctggttt gaggt 895

<210> 4

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<212> DNA

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gatggaaatc catttgcagt atgtaaagtg tgcttacgat tgctat 166

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<213> Human papillomavirus type 58

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