同時(shí)檢測(cè)煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性n-亞硝胺的gc-ms/ms方法
【專利摘要】一種同時(shí)檢測(cè)煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N?亞硝胺的GC?MS/MS方法，具體包括四種煙草特有亞硝胺：NNN、NAT、NAB、NNK，和八種揮發(fā)性N?亞硝胺：NDMA、NPYR、NPIP、NMOR、NEMA、NDEA、NDPA、NDBA；其特征在于：在煙草樣品中加入氫氧化鈉溶液，手持振蕩混合均勻后加入二氯甲烷，振蕩器振蕩，加入無水硫酸鎂，手持振蕩后置于振蕩器中振蕩，然后離心、濃縮，最后用GC?MS/MS分析。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：樣品前處理簡(jiǎn)便、煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N?亞硝胺能夠同時(shí)被分析，可批量處理，且該方法測(cè)定速度快、加標(biāo)回收率好、精密度高，可為準(zhǔn)確評(píng)估煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N?亞硝胺的安全風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支撐。
【專利說明】
同時(shí)檢測(cè)煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N-亞硝 胺的GC-MS/MS方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N-亞硝胺檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域， 具體是使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS )同時(shí)分析煙草及煙草制品中煙草4種特有亞 硝胺和8種揮發(fā)性N-亞硝胺，利用該方法可快速定量分析煙草及煙草制品中12種亞硝胺的 含量。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草特有亞硝胺(TSNAs)是煙草及煙草制品中最主要的一類致癌物質(zhì)，而TSNAs中 最關(guān)注的4種分別為N-亞硝基降煙堿(NNN)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)、N-亞硝基假木賊堿 (NAB)、4-甲基亞硝基吡啶基丁酮(NNK);揮發(fā)性N-亞硝胺(VNAs)是一類受到廣泛關(guān)注的致 癌類物質(zhì)，早在1970年以前研究者就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)煙草中含有揮發(fā)性N-亞硝胺，主要包括N-亞 硝基二甲基胺（NDMA)、N-亞硝基吡咯烷（NPYR)、N-亞硝基哌啶（NPIP)、N-亞硝基嗎啉 (NMOR)、N-亞硝基甲基乙基胺(NEMA)、N-亞硝基二乙胺(NDEA)、N-亞硝基二丙胺(NDPA)和N-亞硝基二丁胺(NDBA)等8種揮發(fā)性N-亞硝胺，其中NDMA為2A級(jí)致癌物，NPYP、NM0R、NPIP為2B 級(jí)致癌物。
[0003] 煙草和煙草制品的基質(zhì)比較復(fù)雜，在亞硝胺的檢測(cè)中需要采用相應(yīng)的前處理方法 凈化基質(zhì)。固相萃取、液液萃取、固相微萃取等前處理技術(shù)可以降低基質(zhì)效應(yīng)，但相應(yīng)地也 增加了樣品分析時(shí)間并限制了樣品通量，截至目前，關(guān)于同時(shí)測(cè)定煙草和煙草制品中煙草 特有亞硝胺和揮發(fā)性N-亞硝胺的報(bào)道很少，有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而專門提供的一種同時(shí)檢測(cè)煙草及煙 草制品中煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N-亞硝胺的GC-MS/MS方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)煙草特有亞硝胺和 揮發(fā)性N-亞硝胺的同時(shí)分析，簡(jiǎn)化了前處理操作，可以對(duì)煙草及煙草制品進(jìn)行批量快速檢 測(cè) 。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種同時(shí)檢測(cè)煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N-亞硝胺的GC-MS/MS方法， 具體包括四種煙草特有亞硝胺：NNN、NAT、NAB、NNK，和八種揮發(fā)性N-亞硝胺:NDMA、NPYR、 NPIP、NMOR、NEMA、NDEA、NDPA、NDBA，是在煙草樣品中加入氫氧化鈉溶液，手持振蕩混合均勻 后加入二氯甲烷，振蕩器振蕩，加入無水硫酸鎂，手持振蕩后置于振蕩器中振蕩，然后離心、 濃縮，最后用GC-MS/MS分析，具體步驟如下： a、 內(nèi)標(biāo)溶液的配制：配制內(nèi)標(biāo)濃度為1 y g/m 1的_1^-06、匪￡厶-03、_￡厶-010、_卩八-D14、NM0R-D8、NPYR-D8、NPIP-D8、NDBA-D8 的混合內(nèi)標(biāo)二氯甲烷工作溶液和 NNK-D4、NAT-D4、 NAB-D4和NNK-D4的混合內(nèi)標(biāo)二氯甲烷溶液； b、 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：以二氯甲烷為溶劑，配制煙草特有亞硝胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，具體 濃度為：5 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml、1000 ng/ml、 5000 ng/ml;分別加入煙草特有亞硝胺內(nèi)標(biāo)溶液，使各內(nèi)標(biāo)物的濃度均為400 ng/ml;以二 氯甲烷為溶劑，配制揮發(fā)性N-亞硝胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液具體濃度為:0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、l ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/ml 和 100 ng/ml，分別加入揮發(fā)性N_ 亞硝胺內(nèi)標(biāo)溶液，使各內(nèi)標(biāo)物的濃度均為20 ng/ml。
[0006] C、煙草樣品準(zhǔn)備:煙草及煙草制品磨碎后冷藏保存以備用； d、 萃取:將準(zhǔn)確稱取的4 g樣品放于50 mL離心管中加入4 ml濃度為10%的氫氧化鈉溶 液以提高目標(biāo)物的提取效果，手持振蕩15 s混合均勻，然后加入30 ml二氯甲烷和相應(yīng)的內(nèi) 標(biāo)溶液(煙草特有亞硝胺內(nèi)標(biāo)溶液的加入量為200yl，揮發(fā)性N-亞硝胺內(nèi)標(biāo)溶液的加入量20 yl)，將離心管置于振蕩器振蕩20 min，振蕩后加入4.5 g無水硫酸鎂，手持振蕩15 s后置于 振蕩器中振蕩2 min; e、 離心:樣品在高速離心機(jī)上以11000 r/min離心5 min; f、 濃縮:離心后取上清液在43°C±2°C下氮吹濃縮至2 ml左右，將其轉(zhuǎn)移至2 mL色譜小 瓶中，以備檢測(cè)； g、GC-MS/MS測(cè)定，GC-MS/MS儀器工作參數(shù)如表1: 表1 GC-MS/MS儀器工作參數(shù)
目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)如表2: 表2目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)
h、結(jié)果計(jì)算。
[0007] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:樣品前處理簡(jiǎn)便、煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N-亞硝胺能夠同 時(shí)被分析，可批量處理，且該方法測(cè)定速度快、加標(biāo)回收率好、精密度高，可為準(zhǔn)確評(píng)估煙草 及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N-亞硝胺的安全風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支撐。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 本發(fā)明結(jié)合實(shí)例作進(jìn)一步描述，但并不限制本發(fā)明。
[0009] 實(shí)例 1 按照上述
【發(fā)明內(nèi)容】
中步驟(b)配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后再用GC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，得到線 性方程和相關(guān)系數(shù)。以信噪比為3和10計(jì)算檢出限和定量限。結(jié)果表明方法線性好、檢出限 低(結(jié)果見表3) 表3煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N-亞硝胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限
實(shí)例2 按照上述
【發(fā)明內(nèi)容】
中步驟d、e和f，在樣品處理前加入定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，結(jié)果如表4所 示，所有目標(biāo)物的日內(nèi)回收率在88.5%-117%之間，日間回收率在89.2%-107%之間。日內(nèi)精密 度和日間精密度分別為4.3%-13.5%和6.2%-15.1%，精密度良好。
實(shí)例3 按照上述
【發(fā)明內(nèi)容】
中步驟測(cè)定7種樣品中的煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N-亞硝胺含量， 結(jié)果見表5。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種同時(shí)檢測(cè)煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發(fā)性N-亞硝胺的GC-MS/MS方 法，具體包括四種煙草特有亞硝胺:順1嫩1\祖8、順1(，和八種揮發(fā)性^亞硝胺 :勵(lì)^即￥1?、 NPIP、NMOR、NEMA、NDEA、NDPA、NDBA;其特征在于:在煙草樣品中加入氫氧化鈉溶液，手持振 蕩混合均勻后加入二氯甲烷，振蕩器振蕩，加入無水硫酸鎂，手持振蕩后置于振蕩器中振 蕩，然后離心、濃縮，最后用GC-MS/MS分析。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的GC-MS/MS方法，其特征在于:該方法的具體步驟如下： a、內(nèi)標(biāo)溶液的配制：配制內(nèi)標(biāo)濃度為I μg/ml的NDMA-D6、MffiA-D3、NDEA-D10、NDPA-D14、NM0R-D8、NPYR-D8、NP IP-D8、NDBA-D8 的混合內(nèi)標(biāo)二氯甲烷溶液和NNK-D4、NAT-D4、NAB-D4和NNK-D4的混合內(nèi)標(biāo)二氯甲烷溶液； b、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：以二氯甲烷為溶劑，配制煙草特有亞硝胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并 分別加入煙草特有亞硝胺內(nèi)標(biāo)溶液，使各內(nèi)標(biāo)物的濃度均為400 ng/ml;以二氯甲烷為溶 劑，配制揮發(fā)性N-亞硝胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別加入揮發(fā)性N-亞硝胺內(nèi)標(biāo)溶液，使各內(nèi)標(biāo)物 的濃度均為20 ng/ml; c、 煙草樣品準(zhǔn)備:煙草及煙草制品磨碎后冷藏保存以備用； d、 萃取:將準(zhǔn)確稱取的4 g樣品放于50 mL離心管中加入4 ml濃度為10%的氫氧化鈉溶 液，手持振蕩15 s混合均勻，然后加入30 ml二氯甲烷和相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)溶液，將離心管置于振 蕩器振蕩20 min，振蕩后加入4.5 g無水硫酸鎂，手持振蕩15 s后置于振蕩器中振蕩2 min; e、 離心:樣品在高速離心機(jī)上以11000 r/min離心5 min; f、 濃縮:離心后取上清液在43°C±2°C下氮吹濃縮至2 ml左右，將其轉(zhuǎn)移至2 mL色譜小 瓶中，以備檢測(cè)； g、 GC-MS/MS測(cè)定，GC-MS/MS儀器工作參數(shù)如下表：h、結(jié)果計(jì)算。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GC-MS/MS方法，其特征在于:煙草特有亞硝胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的 具體濃度為：5 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml、1000 ng/ ml、5000 ng/ml;揮發(fā)性N-亞硝胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的具體濃度為：0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、l ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/ml 和I00 ng/ml〇
【文檔編號(hào)】G01N30/04GK105891383SQ201610386484
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月4日
【發(fā)明人】郭軍偉, 謝復(fù)煒, 劉顯軍, 劉雷雨, 王洪波, 趙樂, 樊美娟, 潘立寧, 陳黎
【申請(qǐng)人】中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院