本發(fā)明涉及一種從香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-8基因片段、編碼蛋白制備方法及用途，所編碼的蛋白具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抗腫瘤及清除自由基及染料廢水脫色等功能。

背景技術(shù)：

真菌富含多種生物活性分子，包括核糖體失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素樣蛋白、多糖和激酶。其中的抗腫瘤成分以不良反應(yīng)少、療效顯著等優(yōu)點(diǎn)在腫瘤治療方面具有獨(dú)到之處。香菇菌C91-3屬真菌為擔(dān)子菌亞門擔(dān)子菌綱側(cè)耳科，該菌種已于2013年保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益氣，扶正祛邪，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，防治癌癥等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，et a1．An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J]．Biochem J，2003，374：321—327]。香菇菌C91-3發(fā)酵液中含有多種蛋白成分，通過動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)有些蛋白成分具有較好的抗腫瘤作用[黃敏，寧安紅，張卓然等．香菇C91-3菌絲發(fā)酵液小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用的研究[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志，1996，8(3)：38-40]。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，其發(fā)酵液中的一些蛋白組分具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力[戴兵,黃敏,寧安紅.香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白抑制小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14生長及誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.浙江醫(yī)學(xué)，2004，26（9）；656 -658]。雖然目前已有關(guān)于從香菇C91-3菌中提取可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的基因片段、編碼蛋白及制備方法的相關(guān)報(bào)道，但是不同的基因片斷的作用效果不盡相同，亟待開發(fā)更多的表達(dá)蛋白藥效強(qiáng)、靶向性好、具備產(chǎn)業(yè)價(jià)值的香菇C91-3cDNA的基因片段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種從香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-8基因片段、編碼蛋白及制備方法，所編碼的蛋白具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抗腫瘤及清除自由基等功能。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

一種上述香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段編碼蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一種上述香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行：

a. 提取香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA；

b. 將菌絲體總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

c. PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因：

以所得到的cDNA為模板、以具有BamHⅠ和NotⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；所述PCR反應(yīng)引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

d. 回收純化DNA片段：

將所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，純化762bpMarker附近的明顯條帶，切膠回收DNA片段。

所述香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段的制備方法，其特征在于所述a步驟是取培養(yǎng)18天的香菇C91-3菌株的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室溫靜置30min，樣品融化后繼續(xù)研磨至裂解液透明狀，室溫靜置5min后，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，然后加入1/5體積氯仿，溫和振蕩后，4?C, 12000 r/min離心，15 min；吸取上層水相溶液并轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置15 min，再次4?C，12000 r/min離心，10 min，棄上清，然后加入75%乙醇洗滌并干燥，最后用DEPC處理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA。

所述c步驟的PCR反應(yīng)體系50 μl： cDNA模板1 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，dNTP Mixture 4 μl、5×PrimeSTAR Buffer 10 μl、2.5 U/μl 的PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.5 μl、滅菌蒸餾水33.5 μl；反應(yīng)條件：98℃變性10 s，55℃復(fù)性10 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃冷卻10 min。

一種上述香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段編碼蛋白在制備抗腫瘤、抗氧化或抗衰老藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明是從香菇C91-3菌絲體轉(zhuǎn)錄組中，克隆出一段特異性基因片段，命名為Latcripin-8基因片段，該基因片段所編碼的蛋白具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抗腫瘤及清除自由基等功能?？蓪⒃摶蚱芜M(jìn)行基因重組，并于原核表達(dá)體系中進(jìn)行高效表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物通過親和層析進(jìn)行分離和提純，獲得該基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白可用于研究細(xì)胞凋亡中的機(jī)制及其在細(xì)胞信號通路中的作用，也可用于制備治療腫瘤、抗氧化或抗衰老藥物，增加藥物種類。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例 PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例所用載體 pET-32a（＋）雙酶切后的電泳圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提取的Latcripin-8基因片段轉(zhuǎn)化后的單克隆陽性菌落。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例重組表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的Western-blot電泳圖。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例純化后的目標(biāo)蛋白SDS-PAGE電泳圖。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例純化后的目標(biāo)蛋白對SGC細(xì)胞的生長抑制率示意圖。

香菇C91-3菌株保藏日期：2013年3月15日；

分類命名：香菇（Lentinula edodes）；

保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）；

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號

保藏號：CGMCC No.7354。

具體實(shí)施方式

a. 提取香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA：

取用培養(yǎng)基培養(yǎng)18天的香菇C91-3菌株的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，加入1ml的Trizol后室溫靜置30min，樣品融化后繼續(xù)研磨至裂解液透明狀，室溫靜置5min后，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，然后加入然后加入0.2 ml氯仿，溫和振蕩后，4?C, 12000 r/min離心，15 min；吸取上層水相溶液0.5 ml并轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5 ml離心管，加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置15 min，再次4?C,12000 r/min離心，10 min，棄上清，然后加入75%乙醇1 ml洗滌并干燥，最后用DEPC處理水溶解，香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA；

紫外分光光度計(jì)驗(yàn)證純度，OD260/280比值在1.8~2.0之間。

進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，表明RNA提取純度較高。

b. 將菌絲體總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，本試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

反應(yīng)體系：香菇菌絲體總RNA (1μg/μl) 1 μl、3’ RACE Adaptor (5 μM) 1 μl、dNTP Mixture (10 mM each) 1 μl、RNase Free dH₂O 4.5 μl；

反應(yīng)條件：70℃，10 min 立即冰上放置2分鐘；

然后加入下列組分：5× M-MLV Buffer 2μl、 RNase Inhibitor (40 U/μl) 0.25 μl、Reverse Transcriptase M-MLV (無RNA酶) (200 U/μl) 0.25 μl，體系總體積達(dá)到10 μl。

反應(yīng)條件： 42℃，60 min 70℃，15 min 得到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（cDNA）。

c. PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因：

以所得到的cDNA為模板、以具有BamHⅠ和NotⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；所述PCR反應(yīng)引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

引物委托寶生物（大連）公司合成。

PCR反應(yīng)體系50 μl： cDNA模板1 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μl、5×PrimeSTAR Buffer（Mg^2＋plus） 10 μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μl）0.5 μl、滅菌蒸餾水33.5 μl；反應(yīng)條件：98℃變性10 s，55℃復(fù)性10 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃冷卻10 min。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，圖1中M ： DL2,000 DNA Marker；1：Latcripin-8目的克隆片段產(chǎn)物，證明成功獲得了該基因片段。

d. 回收純化DNA片段：

將所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，純化762bpMarker附近的明

顯條帶，切膠回收DNA片段，命名為Latcripin-8基因片段。

實(shí)驗(yàn)：

1. Latcripin-8基因片段序列測定：

測序由大連寶生物公司測定，香菇C91-3 Latcripin-8基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1。Latcripin-8的基因片段序列長為762bp的cDNA，其含有254個(gè)密碼子可讀框（ORF）。經(jīng)使用NCBI數(shù)據(jù)庫核苷酸相似性檢索表明，無任何相似性的基因片段序列，證明此基因?yàn)橐恍滦突蚱巍?/p>

2. Latcripin-8基因片段的克隆表達(dá)

2.1 載體構(gòu)建

2.1.1 將質(zhì)粒pET-32a（＋），使用BamHⅠ/NotⅠ進(jìn)行酶切；

反應(yīng)體系 （37℃過夜）：

pET-32a（＋）（100 ng/μl） 10 μl

10×K Buffer 5 μl

EcoRⅠ（10 U/μl） 1 μl

XhoⅠ（10 U/μl） 1 μl

dH₂O Up to 50 μl

取5 μl 進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，M ： λ-Hind Ⅲ digest；1 ：pET-32a（＋）-plasmid；p；2 ：ET-32a（＋）- BamHⅠ/NotⅠ，表明質(zhì)粒切割完全，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 載體回收

使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切膠回收約5.9 kbp 的DNA 片段。

2.1.3 將pET-32a（＋）載體與本發(fā)明實(shí)施例的Latcripin-8基因片段進(jìn)行重組

使用In-Fusion? HD Cloning Kit，分別將本發(fā)明實(shí)施例的Latcripin-8基因片段與酶切后回收載體連接，反應(yīng)體系及條件如下：

Latcripin-8基因片段（100 ng/μl） 2 μl

酶切后回收載體（50 ng/μl） 1μl

5xIn-Fusion HD Enzyme Premix 2 μl

dH₂O Up to 10 μl

50℃ 15 min

取上述In-Fusion 產(chǎn)物2.5 μl 熱轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta-gami(DE3)中，涂布于含四種抗生素（羧芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素）的LB平板上，37 ℃ 過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果如圖3所示，表明重組載體成功轉(zhuǎn)化到宿主菌中，并獲得陽性菌落。

同時(shí)，選取平板上生長的單克隆陽性菌落接種于含四種抗生素（羧芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素）的LB液體培養(yǎng)基于37 ℃ 培養(yǎng)14小時(shí)，采用寶生物公司Plasmid Miniprep Kit V3.l 抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果如SEQ ID NO.1。

2.2 Latcripin-8蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

2.2.1 Latcripin-8蛋白的自誘導(dǎo)表達(dá)

挑取2.1.3的單克隆陽性菌落，接種于10 ml 含四種抗生素（羧芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素）的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃ 下，120 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜，再接種于100 ml含四種抗生素（羧芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素）的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于37 ℃ 下，120 r/min 振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。取菌液進(jìn)行反復(fù)凍融破碎（4次），低溫（4℃）離心5000 r/min，5 min，取上清，加入50 μl PBS。將上清按蛋白樣品處理方法處理后，做12%SDS-PAGE電泳圖如

圖4所示，圖4中M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白； 1：Lp-8全菌蛋白，表明重組蛋白在陽性菌株中成功表達(dá)。

2.2.2目標(biāo)蛋白Western-blotting 鑒定分析

將SDS-PAGE電泳分離樣品后，將PAGE膠用濕轉(zhuǎn)膜的方式轉(zhuǎn)印到NC膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉液封閉120分鐘后，第一抗Mouse Anti-His Tag Monoclonal Antibody，4℃孵育過夜。再加入第二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)室溫孵育60分鐘，顯色試劑盒顯色如圖5所示，證明誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白確實(shí)為目的蛋白。

2.3 Latcripin-8蛋白的純化及活性鑒定

2.3.1. Latcripin-8蛋白的純化

將上述條件誘導(dǎo)的菌體低溫5000 r/min，10 min~20 min離心，每50~100 mg菌體（濕重）加入1~2 ml細(xì)菌裂解液。10000×g，4℃離心15~20分鐘，分離上清和沉淀，并收集沉淀（包涵體）。將沉淀重懸于Binding Buffer中，10,000×g離心20分鐘，收集上清。將上清負(fù)載上柱，利用HIS標(biāo)簽的親和層析進(jìn)行蛋白的純化，使用適量Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。得到單一的目的蛋白，12%SDS-PAGE電泳驗(yàn)證如圖6所示。圖6中，1： M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白； 1：Lp-8純化前；2：純化1 ；3：純化2；4：純化3 。

采用現(xiàn)有方法對純化濃縮的目標(biāo)蛋白進(jìn)行測序，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.3.2. Latcripin-8蛋白的除鹽和復(fù)性

將純化后的Latcripin-8蛋白進(jìn)行梯度透析，將Latcripin-8蛋白裝入MW16000的透析袋中，兩端用透析袋夾夾緊。將透析袋放入0.5 L~2 L的透析復(fù)性液中，冰浴，攪拌透析，24 h~72 h，每6~8 h換液一次復(fù)性，逐步降低尿素濃度直至0。將透析袋中的溶液離心10000 rpm，4℃離心，20~30 min上清即為復(fù)性的重組蛋白。

2.33. Latcripin-8蛋白的活性鑒定（CCK8法）

將純化濃縮的目的蛋白進(jìn)行微量BCA蛋白定量后，用CCK8法檢測細(xì)胞存活和生長情況。將目的蛋白作用的終濃度分別調(diào)整為12.5 μg / mL、25 μg / mL、50 μg / mL、100 μg / mL、200 μg / mL，備用。以PBS作為空白對照，評價(jià)其對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，選用人胃癌SGC細(xì)胞株進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)。用0.25~1%胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5×10⁴/ml。每孔加入100 ul，邊緣孔用無菌PBS填充，5% CO₂，37 ℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）加入上述100 μg / mL的藥物每孔200 μL，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，5% CO₂，37 ℃孵育24小時(shí)，48小時(shí)，并倒置顯微鏡下觀察。48小時(shí)后棄去含有藥物的培養(yǎng)基，然后每孔加入CCK8溶液（即10% CCK8）200μL，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。終止培養(yǎng)，置搖床上低速振蕩5 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀450nm處測量各孔的吸光值，按照下面公式計(jì)算抑瘤率（細(xì)胞生長抑制率）=（對照組平均OD值－實(shí)驗(yàn)組平均OD值）/（對照組平均OD值－空白組平均OD值）。目標(biāo)蛋白的CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本發(fā)明基因表達(dá)的蛋白對人胃癌SGC細(xì)胞株有明顯地抑制作用，在蛋白濃度為12.5 μg / mL、25 μg / mL、50 μg / mL、100 μg / mL時(shí)，24 h、48 h的抑瘤率見圖7。

序列表

<110> 大連醫(yī)科大學(xué)

<120>香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段、編碼蛋白、制備方法及用途

<160> 4

<210> 1

<211> 762

<212> DNA

<213>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）

<400> 1

1 GACTGGAAAACTCTTGGATCTGGCTCGTTTGGCAAGGTTTACAAGGGCACTTATCTTGGA

61 ATCGACGTCGCCATCAAGGAAGTCTTACCATCTACTGAATACGACGTGGCSAAATACTTT

121 GAGCGTGAATGGCGTCTCATGAAGGAATCTCGCCATCCTAATATCGTCCTCTTTCTTGGT

181 CTCTCTCGTGCTCCCGAGCCAGACAATCGCATTTTCATCGTCTCCGAGTTCATAGACAAC

241 GGCAACCTGCGTCATTACATTCACGACAAGAACAAACCRTTCCCGTGGCGTCTTCGATTG

301 TCTTTTGCCACAGATATTGCCCGTGCGCTTGCATATTTACATGCTCGAAAATGCATACAT

361 CGAGATTTGAAAGGCGAAAACCTGCTTGTCACCGCTAATGGTCGTTTGAAGATTACAGAC

421 TTTGGCTTTGCTCGGATAGCTGCCCGAAGCGAAGACGAATCSAARCGACTCACGTTTTGT

481 GGRACCGATTCGTACATGTCTCCCGAAATCCTCCTTGGAGAGGAGTTTGATCTCCCTACC

541 GACATATTCTCCTTYGGTATCATYCTCTGTGAGATCGCTGCYCGCCGACTTGCGGACGAC

601 CATCATTTCAAGCGAGCYGCACCSACTTTCTCCATMGATGCAGATGAGATCCGCAGTCTC

661 GCTAATCCAGGATGTCCGCCTGACTTGATATCATTGTGCATTGAATGCTGCTCTTCAAAT

721 CCTGCCGCTCGTCCAACGACTCGTCAAATTCTCGAGAAACTT

<210> 2

<211> 254

<212> PRT

<213>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）表達(dá)產(chǎn)物

<400> 2

1 GACTGGAAAACTCTTGGATCTGGCTCGTTTGGCAAGGTTTACAAGGGCACTTATCTTGGA

1 D W K T L G S G S F G K V Y K G T Y L G

61 ATCGACGTCGCCATCAAGGAAGTCTTACCATCTACTGAATACGACGTGGCSAAATACTTT

21 I D V A I K E V L P S T E Y D V A K Y F

121 GAGCGTGAATGGCGTCTCATGAAGGAATCTCGCCATCCTAATATCGTCCTCTTTCTTGGT

41 E R E W R L M K E S R H P N I V L F L G

181 CTCTCTCGTGCTCCCGAGCCAGACAATCGCATTTTCATCGTCTCCGAGTTCATAGACAAC

61 L S R A P E P D N R I F I V S E F I D N

241 GGCAACCTGCGTCATTACATTCACGACAAGAACAAACCRTTCCCGTGGCGTCTTCGATTG

81 G N L R H Y I H D K N K P F P W R L R L

301 TCTTTTGCCACAGATATTGCCCGTGCGCTTGCATATTTACATGCTCGAAAATGCATACAT

101 S F A T D I A R A L A Y L H A R K C I H

361 CGAGATTTGAAAGGCGAAAACCTGCTTGTCACCGCTAATGGTCGTTTGAAGATTACAGAC

121 R D L K G E N L L V T A N G R L K I T D

421 TTTGGCTTTGCTCGGATAGCTGCCCGAAGCGAAGACGAATCSAARCGACTCACGTTTTGT

141 F G F A R I A A R S E D E S X R L T F C

481 GGRACCGATTCGTACATGTCTCCCGAAATCCTCCTTGGAGAGGAGTTTGATCTCCCTACC

161 G T D S Y M S P E I L L G E E F D L P T

541 GACATATTCTCCTTYGGTATCATYCTCTGTGAGATCGCTGCYCGCCGACTTGCGGACGAC

181 D I F S F G I I L C E I A A R R L A D D

601 CATCATTTCAAGCGAGCYGCACCSACTTTCTCCATMGATGCAGATGAGATCCGCAGTCTC

201 H H F K R A A P T F S I D A D E I R S L

661 GCTAATCCAGGATGTCCGCCTGACTTGATATCATTGTGCATTGAATGCTGCTCTTCAAAT

221 A N P G C P P D L I S L C I E C C S L N

721 CCTGCCGCTCGTCCAACGACTCGTCAAATTCTCGAGAAACTT

241 P A A R P T T R Q I L E K L

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>3

GCTGATATCGGATCCGACTGGAAAACTCTTGGAT 35

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

CTTACGAGGACATCAAAGGCGACT 24