本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是一種來源于小麥的能夠提高植物抗旱能力的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：干旱是影響植物生長、物種分布和限制作物產(chǎn)量提高的重要因素之一。利用基因工程培育抗旱植物，致力于發(fā)掘作物抗旱相關(guān)的新基因，并將之運(yùn)用到作物抗旱品種的篩選與改良上，是當(dāng)今作物抗逆基因工程研究的熱點之一。在長期的進(jìn)化過程中，高等植物逐漸演變產(chǎn)生了一套感受和傳導(dǎo)干旱信號的系統(tǒng)，并形成了一系列生理或發(fā)育機(jī)制來響應(yīng)環(huán)境中的這種脅迫，最大限度的減輕干旱脅迫造成的傷害。植物抗旱相關(guān)基因可分為2類。第一類基因是功能基因，包括：（1）滲透調(diào)節(jié)基因，如吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）和甜菜堿醛脫氫酶基因（BADH）等；（2）參與活性氧清除的基因，如超氧化物歧化酶基因（SOD）、過氧化物酶基因（POD）、過氧化氫酶（CAT）等；（3）脫水保護(hù)基因，如胚胎發(fā)生晚期富集蛋白基因（LEA）、水通道蛋白基因（PIP、TIP、NLM和SIP）和滲調(diào)蛋白基因（Osmotin）等。第二類基因是調(diào)節(jié)基因，主要包括：（1）傳遞信號和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因，如DREB、bZIP、MYB/MYC、ERF、WRKY和NAC等；（2）感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號的蛋白激酶基因，如CDPK、MAPK、RPK等；（3）與第二信使生成有關(guān)的酶類，如磷脂酶C等。目前，在小麥中已分離出一些抗旱相關(guān)基因，如吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）和吡咯啉-5-羧酸還原酶基因（TaP5CR）、甜菜堿醛脫氫酶基因（TaBADH）、超氧化物歧化酶基因（TaSOD）、PMA80、DHN-5、TaDHN1、水通道蛋白基因、DREB轉(zhuǎn)錄因子基因（TaDREB1、TaDREB2、TaAIDF）、bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因（LIP19、EmBP-1）、WRKY、NAC、CDPK、calreticulin、半胱氨酸蛋白酶基因（TaCP）、脂轉(zhuǎn)移蛋白基因（TaLTP1）、小G蛋白基因（TaRab2）、鐵蛋白基因（Tafet）、TaPP2Ac、TaABCIL、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因（TaGSTF6）、TaMyB2、TaPIMP1、TaMYB33、TaMYB30、TaMYB19、Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（NHX1）、凝集素基因（WGA）、vacuolarH+-PPase基因（TVP1）等。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種提高植物抗旱能力的基因及其應(yīng)用，以應(yīng)對目前抗逆分子育種過程中抗逆基因缺乏的現(xiàn)狀。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。一種提高植物抗旱能力的基因，該基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1或SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容還包括上述基因編碼的作為植物轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容還包括含有上述基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容還包括含有上述基因的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容還包括含有上述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容還包括含有上述基因的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容還包括含有上述基因的表達(dá)盒，此表達(dá)盒至少包含一個啟動子、權(quán)利要求1所述的基因及一個終止子；進(jìn)一步的，所述啟動子采用來源于煙草花葉病毒的強(qiáng)啟動子CaM35S，且權(quán)利要求1所述的基因以功能性方式與所述啟動子連接，所述終止子選自NOS終止序列或35S終止序列。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容還包括上述基因在培育高抗旱植物中的應(yīng)用；具體的，首先構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述基因的重組表達(dá)載體，然后利用此重組表達(dá)載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體，再利用此轉(zhuǎn)化體侵染目的植物，篩選陽性植株，獲得與正常植物相比抗旱性能增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：利用農(nóng)桿菌將含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體pCAMBIA2300-TaAPL1轉(zhuǎn)化擬南芥，陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株抗旱能力提高，這說明本發(fā)明的基因可提高轉(zhuǎn)基因植株中抗旱能力，從而為植物抗逆基因工程提供了強(qiáng)有力的工具。附圖說明圖1為本發(fā)明TaAPL1的基因結(jié)構(gòu)圖。圖2為植物APL-like蛋白聚類分析圖（上部分）與myb_SHAQKYF和Myb_CC_LHEQLE結(jié)構(gòu)域序列比對圖（下部分）。圖3為本發(fā)明TaAPL1-D亞細(xì)胞定位，A、明場，B、GFP綠色熒光，C、細(xì)胞核DAPI紅色熒光，D、疊加圖像。圖4為本發(fā)明TaAPL1-D轉(zhuǎn)錄激活載體構(gòu)建，A、TaAPL1-D氨基酸序列及結(jié)構(gòu)域，B、轉(zhuǎn)錄激活載體構(gòu)建片段，C、TaAPL1-D轉(zhuǎn)錄激活載體構(gòu)建示意圖。圖5為本發(fā)明TaAPL1-D轉(zhuǎn)錄激活活性分析。圖6為本發(fā)明TaAPL1-D植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。圖7為本發(fā)明石麥15TaAPL1滲透脅迫處理后表達(dá)量變化圖，描述石麥15小麥幼苗16%PEG8000處理后根和葉片中TaAPL1表達(dá)模式，分別于0、1、3、6、9、12、24、48小時取材料，采用實時熒光定量PCR的方法，小麥Actin基因作為內(nèi)參。圖8為本發(fā)明野生型擬南芥和轉(zhuǎn)TaAPL1-D擬南芥干旱脅迫反應(yīng)，A、表型分析，B、萌發(fā)率，C、失水率，D、丙二醛含量分析，E、脯氨酸含量分析。圖9為本發(fā)明轉(zhuǎn)TaAPL1-D擬南芥滲透脅迫處理前后干旱脅迫通路相關(guān)基因的表達(dá)分析。具體實施方式以下實施例詳細(xì)說明了本發(fā)明。本發(fā)明所使用的各種試劑耗材及各項設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過市場購買直接獲得。在各個生化試驗例中，若未特別指明，所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1、具有的克隆與序列分析1.1材料處理精選石麥15種子在光照培養(yǎng)箱中用自來水培養(yǎng)至二葉一心期，培養(yǎng)溫度22±1℃，每天光照14h。選取生長發(fā)育一致幼苗20-25株置培養(yǎng)皿中，16%聚乙二醇（PEG8000）處理，取樣期間保持全天光照，分別于0，1，3，6，9，12，24，48h取葉片和根系，液氮速凍后于-70℃冰箱保存；試驗分別設(shè)置3個重復(fù)。1.2小麥總RNA提取和cDNA第一鏈的合成采用RNAisoPlus（TaKaRa，中國大連）提取小麥總RNA。操作按試劑盒說明進(jìn)行。紫外分光光度計法測定總RNA的濃度并鑒定純度；用電泳鑒定其完整性。采用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit（TaKaRa，中國大連）進(jìn)行第一鏈cDNA合成。操作按試劑盒說明進(jìn)行。1.3基因（TaAPL1）的克隆Affymetrix小麥表達(dá)譜芯片分析表明，冬小麥品種石麥15MYB-CC類轉(zhuǎn)錄因子基因（GenBankNo.BJ243280）滲透脅迫后在葉中上調(diào)表達(dá)，在滲透脅迫后3h、9h和27h分別為對照的1.6倍、2.6倍和3.3倍，呈現(xiàn)表達(dá)量隨脅迫時間延長而提高的趨勢。NCBIBlastx比對顯示，該基因為MYB-CC類轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為TaAPL1。通過序列分析比對，設(shè)計引物序列如下：基因名稱上鏈(5′-3′)下鏈(5′-3′)TaAPL1-AGCTTCTGGACGAACACGG（SEQIDNO：4）CACTAGAACTCTACATGGCAAG（SEQIDNO：5）TaAPL1-BGCTTCTGGACGAACACGG（SEQIDNO：6）CACTAGAACTCTACATGGCAAG（SEQIDNO：7）TaAPL1-DGACTGGCGGCTGATTTGG（SEQIDNO：8）CACTAGAACTCTACATGGCAAG（SEQIDNO：9）20μLPCR反應(yīng)體系包含2×PfuPCRMasterMix10μL（天根生化），引物各1μL（10μmol?L-1），模板cDNA2μL（20ng?L-1），ddH2O6μL。PCR擴(kuò)增程序：94oC預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環(huán)；72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物克隆使用DNAA-TailingKit和pMD18-Tvector(TaKaRa，中國大連)。轉(zhuǎn)化菌株使用大腸桿菌DH5α。測序服務(wù)由立菲生物技術(shù)有限公司提供。TaAPL1序列為SEQIDNo.1（TaAPL1-A）、SEQIDNo.2（TaAPL1-B）和SEQIDNo.3（TaAPL1-D）。TaAPL1-A的編碼區(qū)長1248bp，編碼蛋白由415個氨基酸組成；TaAPL1-B的編碼區(qū)長1152bp，編碼蛋白由383個氨基酸組成；TaAPL1-D的編碼區(qū)長1161bp，編碼蛋白由386個氨基酸組成。TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D核苷酸序列一致性分別為92.2%、92.9%、90.4%；氨基酸序列一致性分別為86.1%、86.6%、93.0%（DNAStar;http:/www.DNAStar.com）。聚類分析結(jié)果表明，植物APL-like基因分為2組，分別對應(yīng)單子葉植物和雙子葉植物；APL-like的2個結(jié)構(gòu)域myb_SHAQKYF和Myb_CC_LHEQLE在植物中高度保守（圖1）。1.5TaAPL1基因結(jié)構(gòu)分析根據(jù)TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D設(shè)計引物篩選石麥15基因組BAC文庫，分離出含有TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D的BAC單克隆，分別構(gòu)建10kb亞克隆文庫，通過亞克隆測序獲得TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D的基因組序列。通過比較TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D的cDNA和gDNA序列發(fā)現(xiàn)，TaAPL1-A和TaAPL1-D具有相同的基因結(jié)構(gòu)，編碼區(qū)由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成；TaAPL1-B基因結(jié)構(gòu)不同于TaAPL1-A和TaAPL1-D，其編碼區(qū)由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成（圖2）。TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D在其5′非翻譯區(qū)均含有1個內(nèi)含子，長度分別為1000bp、1657bp和1333bp。TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D基因結(jié)構(gòu)從單基因水平說明，小麥A基因組和D基因組的同源程度高于B基因組，這與目前關(guān)于普通小麥3個基因組的起源和進(jìn)化理論相吻合。1.6TaAPL1染色體定位根據(jù)TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D基因組序列比對中國春小麥基因組序列信息發(fā)現(xiàn)，3個序列與位于染色體6AS、6BS和6DS上的TaAPL序列高度一致，這提示TaAPL1位于小麥第6同源群短臂上(https://urgi.versailles.inra.fr/download/iwgsc/Gene_models)。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D基因組序列設(shè)計引物，引物序列為：上鏈5'-GAGCAACTAGAGGTAACAGTGT-3'（SEQIDNO：10），下鏈5'-CTGGCCTTCTGTTGTTCTAG-3'（SEQIDNO：11）。以中國春缺四體材料（N6AT6B、N6AT6D、N6BT6A、N6BT6D、N6DT6A、N6DT6B）為模板，通過克隆測序分析TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D的染色體定位。20μLPCR反應(yīng)體系包含2×PfuPCRMasterMix10μL（天根生化），引物各1μL（10μmol?L-1），模板DNA2μL（20ng?L-1），ddH2O6μL。PCR擴(kuò)增程序：94oC預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物克隆使用DNAA-TailingKit和pMD18-Tvector(TaKaRa，中國大連)。轉(zhuǎn)化菌株使用大腸桿菌DH5α。測序服務(wù)由立菲生物技術(shù)有限公司提供。每個PCR產(chǎn)物隨機(jī)挑取12個克隆測序，測序結(jié)果表明，TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D分別位于小麥染色體6A、6B和6D上。實施例2、基因的亞細(xì)胞定位2.1TaAPL1基因的亞細(xì)胞定位表達(dá)載體的構(gòu)建TaAPL1-D亞細(xì)胞定位表達(dá)載體構(gòu)建使用pCAMBIA1300-sGFP（利用限制性內(nèi)切酶NcoI和EcoRI將35S啟動子-sGFP-NOS終止子連接到pCAMBIA1300載體的多克隆位點區(qū)）。根據(jù)TaAPL1-D序列設(shè)計引物，上游引物：5'-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAGCACACAGAGTGTA-3'（SEQIDNO：12），下游引物：5'-GCCCTTGCTCACCATGGATCCCGGTTCACTTTCAAGATC-3'（SEQIDNO：13）。20μLPCR反應(yīng)體系包含2×PfuPCRMasterMix10μL（TIANGEN），引物各1μL（10μmol?L-1），模板質(zhì)粒DNA2μL（20ng?L-1），ddH2O6μL。PCR擴(kuò)增程序：94oC預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環(huán)；72℃延伸8min。采用瓊脂糖凝膠電泳回收TaAPL1-DPCR產(chǎn)物。載體pCAMBIA1300-sGFP經(jīng)XbaI和BamHI酶切后，采用瓊脂糖凝膠電泳回收酶切大片段。利用石家莊惠友生物科技有限公司的快速克隆試劑ClonExpressII將PCR產(chǎn)物定向克隆到載體pCAMBIA1300-sGFP上，轉(zhuǎn)化使用大腸桿菌DH5α。2.2TaAPL1的亞細(xì)胞定位TaAPL1-D亞細(xì)胞定位表達(dá)載體經(jīng)測序正確后，大量提取質(zhì)粒至濃度達(dá)0.8-1.0g?L-1。金粉包埋后，Bio-Rad臺式基因槍（PDS-1000/He）轟擊洋蔥表皮細(xì)胞。暗培養(yǎng)24h，激光共聚焦掃描顯微鏡（LeicaSP8）觀察熒光分布情況。結(jié)果表明，熒光信號分布在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，這說明TaAPL1在細(xì)胞核中表達(dá)（圖3）。實施例3、基因的轉(zhuǎn)錄活性分析3.1石麥15MYB-CC類轉(zhuǎn)錄因子基因TaAPL1轉(zhuǎn)錄激活載體構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活載體構(gòu)建使用pGBKT7。轉(zhuǎn)錄激活載體pGBKT7-TaAPL1F、pGBKT7-TaAPL1N、pGBKT7-TaAPL1C、pGBKT7-TaAPL1M構(gòu)建如圖4。以含有TaAPL1-DcDNA序列的質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增分別在片段TaAPL1F、TaAPL1N、TaAPL1C、TaAPL1M的5'和3'端引入BamHI和PstI酶切位點。引物序列如下：20μLPCR反應(yīng)體系包含2×PfuPCRMasterMix10μL（TIANGEN），引物各1μL（10μmol?L-1），模板質(zhì)粒DNA2μL（20ng?L-1），ddH2O6μL。PCR擴(kuò)增程序：94oC預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1-3min，30個循環(huán)；72℃延伸8min。采用瓊脂糖凝膠電泳回收TaAPL1-DPCR產(chǎn)物。載體pGBKT7和PCR產(chǎn)物分別經(jīng)BamHI和PstI酶切后，采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收酶切片段（TIANGEN）。PCR產(chǎn)物和和pGBKT7連接使用T4DNA連接酶（NEB）。轉(zhuǎn)化菌株分別使用大腸桿菌DH5α。3.2酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備蘸取酵母AH109菌液于YPDA平板上劃線，30℃培養(yǎng)2-3天。挑取單克隆至YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)16-20h。使用1.5mL離心管收集菌液，4000rpm室溫離心5min，棄上清。向上述菌體中加入1mL滅菌的蒸餾水，重懸菌體，4000rpm室溫離心5min，棄上清。依次加入：160μL滅菌蒸餾水、20μL10×TE、20μLLiAC，即為AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞。3.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)在酵母感受態(tài)細(xì)胞中加入20μL的硅魚精（10mg/mL）和3-5μL的TaAPL1轉(zhuǎn)錄激活載體質(zhì)粒。按順序依次加入：960μLPEG3350、120μL10×TE、120μLLiAC震蕩混勻。30℃1800rpm震蕩培養(yǎng)30min。42℃15min，6000rpm離心15s，棄上清。向上述菌體中加入150μL的滅菌蒸餾水，重懸菌體，然后于-Trp的培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2-3天。3.4轉(zhuǎn)錄活性定性分析待單菌落長到直徑約2mm后，挑取單菌落于YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃230rpm振蕩培養(yǎng)過夜，6000rpm離心15s，棄上清。在菌體中加入20μL的滅菌蒸餾水中，混勻，點樣劃線于-Trp-His-Ade的培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2-3天。在-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3天后，取濾紙扣于培養(yǎng)皿上，菌面朝上，放在液氮中1min，室溫解凍1min，重復(fù)3次，將濾紙放入X-Gal染色液中，30℃溫育，實時觀察染色情況。在轉(zhuǎn)化載體pGBKT7-TaAPL1F、pGBKT7-TaAPL1N的酵母細(xì)胞中觀察到β-半乳糖苷酶活性，二在pGBKT7-TaAPL1C、pGBKT7-TaAPL1M中酵母細(xì)胞無β-半乳糖苷酶活性（圖5）。結(jié)果表明，TaAPL1具有轉(zhuǎn)錄活性，轉(zhuǎn)錄激活域位于蛋白的N端，C端可能具有抑制轉(zhuǎn)錄激活活性的元件。實施例4、基因的表達(dá)分析4.1材料處理精選石麥15種子在光照培養(yǎng)箱中用自來水培養(yǎng)至二葉一心期，培養(yǎng)溫度22±1℃，每天光照14h。選取生長發(fā)育一致幼苗20-25株置培養(yǎng)皿中，16%聚乙二醇（PEG8000）處理，取樣期間保持全天光照，分別于0，1，3，6，9，12，24，48h取葉片和根系，液氮速凍后于-70℃冰箱保存；試驗分別設(shè)置3個重復(fù)。4.2小麥總RNA提取和cDNA第一鏈的合成采用RNAisoPlus（TaKaRa，中國大連）提取小麥總RNA。操作按試劑盒說明進(jìn)行。紫外分光光度計法測定總RNA的濃度并鑒定純度；用電泳鑒定其完整性。采用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit（TaKaRa，中國大連）進(jìn)行第一鏈cDNA合成。操作按試劑盒說明進(jìn)行。4.3定量PCR反應(yīng)1）以一鏈cDNA為模板，采用SYBRRPremixExTaqTMII（TaKaRa）進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)引物如下：2）根據(jù)TaKaRaSYBRRPremixExTaqTMII試劑盒說明進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程序：95℃2min；95℃30s,59℃30s,72℃30s,40個循環(huán)。以小麥β-actin基因作為內(nèi)參,反應(yīng)在ABIPrism7500熒光定量PCR儀上運(yùn)行,3次重復(fù)。采用2–ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。滲透脅迫下，根和葉中表達(dá)量顯著提高，根中3h表達(dá)量達(dá)到峰值，而葉中24h時出現(xiàn)峰值；葉中TaAPL1表達(dá)量高于根中；TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D分別在小麥幼苗根和葉片中呈現(xiàn)相同的表達(dá)模式（圖6）。定量PCR結(jié)果表明，TaAPL1-A、TaAPL1-B和TaAPL1-D均為干旱誘導(dǎo)表達(dá)基因，在小麥干旱誘導(dǎo)反應(yīng)中承擔(dān)相似的功能。實施例5、基因的遺傳轉(zhuǎn)化5.1石麥15MYB-CC類轉(zhuǎn)錄因子基因TaAPL1植物表達(dá)載體構(gòu)建植物表達(dá)載體構(gòu)建使用pCAMBIA2300-35S-OCS。植物表達(dá)載體構(gòu)建pCAMBIA2300-TaAPL1如圖7。以TaAPL1-DcDNA序列為模板，通過PCR擴(kuò)增分別TaAPL1-D的5'和3'端引入BamHI和PstI酶切位點。引物序列如下：上鏈5′-CGGGATCCGACTGGCGGCTGATTTGG-3（SEQIDNO：28）′，下鏈5′-TGCACTGCAGCACTAGAACTCTACATGGCAAG-3′（SEQIDNO：29）。20μLPCR反應(yīng)體系包含2×PfuPCRMasterMix10μL（TIANGEN），引物各1μL（10μmol?L-1），模板質(zhì)粒DNA2μL（20ng?L-1），ddH2O6μL。PCR擴(kuò)增程序：94oC預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環(huán)；72℃延伸8min。采用瓊脂糖凝膠電泳回收TaAPL1-DPCR產(chǎn)物。載體pCAMBIA2300和PCR產(chǎn)物分別經(jīng)BamHI和PstI酶切后，采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收酶切片段（TIANGEN）。PCR產(chǎn)物和和pCAMBIA2300連接使用T4DNA連接酶（NEB）。轉(zhuǎn)化菌株分別使用大腸桿菌DH5α。通過BamHI和PstI酶切和測序?qū)?gòu)建的植物表達(dá)載體進(jìn)行驗證。5.2農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化1）農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備從新鮮YEB（5g/LTryptone；1g/LYeastextract；5g/LSucrose；0.5g/LMgSO4；瓊脂15g/L；50mg/L利福平）平板上挑取農(nóng)桿菌GV3101的單菌落，接種于5ml液體YEB培養(yǎng)基（含50mg/L利福平）中，28℃250rpm振搖培養(yǎng)過夜；取1ml菌液接種于50ml液體YEB培養(yǎng)基（含50mg/L利福平）中擴(kuò)大培養(yǎng)，28℃250rpm振搖培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8；冰浴30min，4℃5000rpm離心10min收集菌體，重懸浮于10ml預(yù)冷的10%甘油中；再次4℃5000rpm離心10min收集菌體，重懸于1ml預(yù)冷的10%甘油中，按100μl/管分裝；液氮速凍后，放于-70℃冰箱保存。2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101受態(tài)細(xì)胞（100μl）冰浴解凍，加入2μl重組質(zhì)粒，混勻，冰浴45min；液氮速凍1min；）37℃水浴3min；加入1mlYEB液體培養(yǎng)基，28℃200rpm恢復(fù)培養(yǎng)3h。取20μl農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液涂布于YEB固體平板（含50mg/L利福平，50mg/L卡那霉素）上，28℃培養(yǎng)2-3d，挑取單菌落，PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。5.3擬南芥轉(zhuǎn)化1）擬南芥培養(yǎng)稱取一定數(shù)量的擬南芥種子（約50粒/mg），加入適量水，避光4℃春化2-3天。蛭石與營養(yǎng)土按體積比1：1比例混合，分裝到花盆中，土層表面撒上薄薄的一層蛭石以抑制真菌的生長，加水使土充分潤濕。用100μl移液器播種，每盆大約12-18粒。保鮮膜密封花盆，培養(yǎng)室中培養(yǎng)（22℃，16h光照；16℃，8h黑暗），托盤中的水量以保持濕潤為準(zhǔn)。待幼苗出土兩片子葉充分展開后，揭去保鮮膜。約3周后擬南芥抽出初生苔，剪去初生苔以便使其抽出更多的次生苔，以便增加花的數(shù)量。待次生苔上長出一定數(shù)量的花蕾（尚未綻開）后用于擬南芥的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化前1天將擬南芥苗澆透。2）轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌菌液的制備與擬南芥轉(zhuǎn)化取PCR檢測正確的農(nóng)桿菌菌液5μl接種于5mlYEB（Kan1:100，Rif1:50）液體培養(yǎng)基中，28℃，250rpm培養(yǎng)30h。菌液按1：400轉(zhuǎn)接到300mlYEB液體培養(yǎng)基中，28℃，250rpm培養(yǎng)14h至OD6001.5-2.0。7000rpm，4℃離心15min收集菌液，重懸菌體于2倍體積的轉(zhuǎn)化滲透液中（1/2MS+1.5%Sucrose，6-BA：0.01mg/L，VB1：10mg/L，VB6：1mg/L，SilwetL-77：0.02%）。將擬南芥（生態(tài)型Columbia-0）倒置，使花蕾朝下并浸入滲透液中，保持5min（長勢強(qiáng)5min，長勢弱3min）。轉(zhuǎn)化后的植株平放，蓋好保鮮膜。低光強(qiáng)度下生長24-48h后置于正常光照條件下生長，直到開花結(jié)莢收集種子。3）轉(zhuǎn)基因植株的鑒定稱取25-30mg擬南芥種子于1.5ml離心管中，10%次氯酸鈉消毒10min，滅菌水沖洗去除次氯酸鈉，加水混勻?qū)⒎N子均勻撒在1/2MS（Kan50mg/L）固體平板上（1/2MS+0.8%瓊脂）。避光4℃春化2-3d。具有卡那霉素抗性的幼苗在抗性平板上正常生長呈綠色，根發(fā)育正常；非抗性幼苗黃色，但植株較小且無根。平板上的綠苗長至4個葉片時移至土中，蓋上保鮮膜保水3d后揭去。幼苗長至8-10個葉片且較健壯時，剪取葉片提取基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測。采用同樣方法篩選，直至獲得T3種子。實施例6轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性6.1轉(zhuǎn)TaAPL1基因擬南芥抗旱性鑒定轉(zhuǎn)TaAPL1擬南芥和野生型擬南芥在溫室培養(yǎng)3周，所有擬南芥生長良好，未發(fā)現(xiàn)明顯的表型變化。停水2周后，野生型植株呈現(xiàn)嚴(yán)重的失水和萎蔫癥狀，而轉(zhuǎn)基因植株葉片仍為綠色，萎蔫癥狀明顯減輕。復(fù)水2天后，野生型植株大部分死亡，而不同株系中均有一定比例的轉(zhuǎn)基因植株能夠正常生長（圖8A）。將轉(zhuǎn)TaAPL1擬南芥和野生型擬南芥播種在含有16%PEG的MS固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率遠(yuǎn)高于野生型（圖8B）。通過稱量離體葉片鮮重的方法對葉片失水率進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，在所有取樣時間點上野生型植株失水率均高于轉(zhuǎn)基因植株（圖8C）。采用400mmol?L-1甘露醇模擬干旱脅迫，轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量高于野生型，而丙二醇含量低于野生型（圖8D，8E）。這些結(jié)果表明，過量表達(dá)TaAPL1能夠提高擬南芥的抗旱能力。6.2轉(zhuǎn)TaAPL1基因擬南芥抗旱反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)分析TaAPL1的過量表達(dá)能夠提高擬南芥的抗旱性。為了探討轉(zhuǎn)基因擬南芥中抗旱相關(guān)基因的表達(dá)水平是否發(fā)生改變，選擇了3個基因（DREB2A，P5CS1和RD29A）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平分析（圖9）。1）材料處理轉(zhuǎn)TaAPL1擬南芥和野生型擬南芥在溫室培養(yǎng)3周后停水，待野生型植株呈現(xiàn)明顯失水和萎蔫癥狀時取樣。液氮速凍后于-70℃冰箱保存；試驗分別設(shè)置3個重復(fù)。2）擬南芥總RNA提取和cDNA第一鏈的合成采用RNAisoPlus（TaKaRa，中國大連）提取小麥總RNA。操作按試劑盒說明進(jìn)行。紫外分光光度計法測定總RNA的濃度并鑒定純度；用電泳鑒定其完整性。采用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit（TaKaRa，中國大連）進(jìn)行第一鏈cDNA合成。操作按試劑盒說明進(jìn)行。3）定量PCR反應(yīng)a.以一鏈cDNA為模板，采用SYBRRPremixExTaqTMII（TaKaRa）進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)引物如下：b.根據(jù)TaKaRaSYBRRPremixExTaqTMII試劑盒說明進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程序：95℃2min；95℃30s,59℃30s,72℃30s,40個循環(huán)。以擬南芥β-actin基因作為內(nèi)參,反應(yīng)在ABIPrism7500熒光定量PCR儀上運(yùn)行,3次重復(fù)。采用2–ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。實時定量PCR結(jié)果顯示，DREB2A，P5CS1和RD29A在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)水平均高于野生型。這些基因表達(dá)水平的改變說明，基因TaAPL1可能通過提高抗旱相關(guān)基因表達(dá)水平，從而提高植物的抗旱性。上述描述僅作為本發(fā)明可實施的技術(shù)方案提出，不作為對其技術(shù)方案本身的單一限制條件。序列表<110>石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院<120>一種提高植物抗旱能力的基因及其應(yīng)用<160>37<210>1<211>1248<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>1ATGAGCACACAGAGTGTACTTCCTGTGAAAGATATCATTGCTCCTGACAGCATGGCTCAC60ACCTGCAATGTTCCACAACCTTCAGCCCATCAAATGTTCAATGCTAAATCTGAAATTTAC120AGTTCGGCAGATGGTATTTCCCGCGTCTCATATGCTGACCTATCAGACCCGAATTCATCG180AGCTCTTCCACATTCTGTGCAAGCATGTACTCGGCGTCACCGACGAACTCCAAATTATGC240TGGCAAATCAGCGGTTTGCCTTTCCTGCCTCATCCTCCTAAATGTGAGCAGCAGCAGTTT300TCAGCTGCGCAGTCATCGATCTCTGCTCTGTTGTTTGCTGCTGATCACAGCGATGGTAGT360CAAGGTCATGATGAACATTCACATGATCTCAAGGACTTCCTTAACCTCTCCGGCAATGCT420TCTGACAGTAGCTTCCGTGGAGGAGGCAGTTCCATGGATTTCAGTGAGCAGCTGGAGTTT480CAGTTATTGTCTGAACAACTTGGGATTGCCATCACCGACAACGAGGAGAGCCCTCGGTTA540GATGACATATATGGCATAGCGCCGCAATGCTCACCTAGTCTACTATCCCCTTCCTCTGAC600CATGAGGATCTGCGCAGTGGGGGTTCTCCGGTTAAAGTCCAGTTGAGTTCATCACCTTCT660TCATCTGGAGCAACAACATGTAGCAAAACGAGAATGAGATGGACACTTGAGCTCCATGAG720CGTTTTGTGGAGGCTCTGAAAAAGCTCGGAGGACTGGAAAAGGCAACTCCCAAGGGTGTG780CTGAAGCTTATGAAGGTAGAAGGCTTGACGATCTTTCACGTAAAGAGCCATTTGCAGAAC840TATCGACATGTGAAGTATATTCCGGAGAAAAAAGAAGTGAAGAGACCATGTTCAGAAGAT900AACAAGGCAAAATCAACATCTGGAATTGATTCTGGCAAAAAGAAGAGTTTTCAAATGGCT960GAAGCTCTACGGATGCAAATGGAGGTTCAGAAACAGCTCCATGAGCAACTAGAGGTGCAA1020AGGAAATTACAACTGCGCATAGAGGAGCATGCAAGATATTTGCAGCGGATACTAGAACAA1080CAGAAGGCCAGAAAATCTCTGGTACCGAAACCAGAGGAGAAAACAGAGGCCAGCACCACT1140TCAGCTCCGTCGCTGAAGTGTAAAATTTCCGACACCGAAATAGAACAGAACTTGCAAATG1200GATAGCAGAAGGCCAGAGCTACAACTTGATCTTGAAAGTGAACCGTAA1248<210>2<211>1152<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>2ATGAGCACACAGAATGTAATTCCTATGAAACATATCATTGCTCCTGACATCAGGGCTCAC60ACCTGCAATGCTCCACAACCTTCAGTCCATCAAATGTTCAATGCTAAATCCGATATTTAC120AGTTCGGCAGATGATACTTCCCGAGTCTCGTATGCTGACCTATCAGACCCGAATTCATCC180AGCTCTTCCACATTCTGCACAAGCATGTACTCATCGTCGTCGACAAAACCCAGTGGATTT240TCTTTCCTGCCCCATCCTTCTAAATGTGAGCAGCAGCAGGTATCAGCTGCAAAATCATTG300AGCTCTTCTTTGCTGTTTGCTGCTGATCTGAGCACTGGCGTTCATGGAGGCAATGCCATG360GATTTCAGTGAGCAGCTGGAGTTTCAGTTCTTGTCTGAACAACTTGGGATTGCCATCACC420GACAACGAGGAGATCCCTCGGTTAGATGACATATATGGCATACCGCCGCAATGCTCGCCT480ATTCTTGTATCGCCTTCATCTGACCATGAGGGTCTGCGCAGTGGGGGTTCTCCGGTCAAA540GTCCAGTTGAGTTCATCACCATCATCATCGGGAGCTACAGCATGTAGCAAAACGAGAATG600AGATGGACACTTGAGCTCCATGAGCGTTTTGTGGAGGCTCTGAAAAAGCTCGGAGGACCG660GAAAAGGCAACTCCCAAGGGTGTGCTGAAGCTTATGAAGGTAGAAGGCTTGACAATCTTT720CACGTAAAGAGCCATTTGCAGAACTATCGACATGTGAAGTATATTCCGGAGAAAAAAGAA780GTGAAGAGAACCTGTTCAGAAGATAACAAGGCAAAATCAGCACCTGGAATTGATTCTGGC840AAAAAGAAGAGTTTTCAAATGGCGGAAGCACTACGGATGCAAATGGAGGTTCAGAAACAG900CTCCATGAGCAACTAGAGGTGCAAAGGAAATTACAGCTGCGCATAGAGGAGCATGCAAGA960TATTTGCAGCAGATACTAGAACAACAGAAGGCCAGAAAATCCCCGGTACCGAAACCAAAG1020GAGGAAACAGAGGTCAACACCACTTCAGCTCCGTCGCTGAAGCGTAAACTTTCAGACACC1080AAAATAGAACACAACTCGCAGATGGATAGCAGAAGGCCAGAGCTACAACTTGATCTTGAA1140AGTGAACCATGA1152<210>3<211>1161<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>3ATGAGCACACAGAGTGTAATTCCTGTGAAACATTTCATTGCTCCTGACATCAGGGCTCAC60ACCTGCAATGCTCCACAACCTTCAGTCCATCAAATGTTCAATGCTAAATCCGATATTTAC120AGTTCGGCAGATGATACTTCCCGAGTCTCGTATGCTGACCTATCAGACCCGAATTCATCC180AGCTCTTCCACATTCTGCACAAGCATGTACTCATCGTCGTCGACAAAACCCAGTGGATTT240TCTTTCCTGCCCCATCCTTCTAAATGTGAGCAGCAGCAGGTATCAGCTGCAAAATCATCG300AGCTCTTCTTTGCTGTTTGCTGCTGATCCAAGCACTGGCGTTCATGGTGATCTTGAACAT360CCACTTGATCTCAAGGACTTCCTTAACCTCTCCGGCAACGCTTCTGACAGTAGCTTCCGT420GGAGGAGGCAATGCCATGGATTTCAGTGAGCAGCTGGAGTTTCAGTTCTTGTCTGAACAA480CTTGGGATTGCCATCACCGACAACGAGGAGAGCCCTCGGTTAGATGACATATATGGCATA540CCGCCGCAATGCTCACCTAGTCTAGTATCCCCTTCCTCTGACCATGAGGATCTGCGCAGT600GGGGGTTCTCCGGTTGAAGCCCAGTTGACGTCATCACATTCTTCATCTGGAGCAACATGT660AGCAAAACGAGAATGAGATGGACACTTGAGCTCCATGAGCGTTTTGTGGAGGCTCTGAAA720AAGCTCGGAGGACCGGAAAAGGCAACTCCCAAGGGTGTGCTGAAGCTTATGAAGGTAGAA780GGCTTGACAATCTTTCACGTAAAGAGCCATTTGCAGAACTATCGACATGTGAAGTATATT840CCGGAGAAAAAAGAAGTGAAGAGACCATGTTCAGAAGATAACAACGCAAAATCAGCATCT900GGAATTGATTCTGGCAACAAGAAGAGTTTTCAAATGGCGGAAACTCTACGGATGCAAATG960GAGGTTCAGAAACAGCTCCATGAGCAACTAGAGGTGCAAAGGGAATTACAGCTGCGCATA1020GAGGAGCATGCAAGATATTTGCAGCAGATACTAGAACAACAGAAGGCCAGAAAATCTACG1080GTGCCGAAACCAGAGGAGAAAACAGAGGTCAACACCACTTCAGCTCCGCCGCTGAAGCGT1140AAAATTTCAGACACCGAATAG1161<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4GCTTCTGGACGAACACGG18<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5CACTAGAACTCTACATGGCAAG22<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6GCTTCTGGACGAACACGG18<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>7CACTAGAACTCTACATGGCAAG22<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>8GACTGGCGGCTGATTTGG18<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>9CACTAGAACTCTACATGGCAAG22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>10GAGCAACTAGAGGTAACAGTGT22<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>11CTGGCCTTCTGTTGTTCTAG20<210>12<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>12GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAGCACACAGAGTGTA39<210>13<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>13GCCCTTGCTCACCATGGATCCCGGTTCACTTTCAAGATC39<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>14CGGGATCCATGAGCACACAGAGTG24<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>15TGCACTGCAGCTATTCGGTGTCTG24<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>16TGCACTGCAGGAAATCCATGGCATTG26<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>17CGGGATCCATGAGTGAGCAGCTGGAG26<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>18CGGGATCCATGTCACCTAGTCTAGTATC28<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>19TGCACTGCAGCTTCTTGTTGCCAG24<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>20ACTAGAGGTGCAAAGGAAATTACAA25<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>21AAGTTCTGTTCTATTTCGGTGTCG24<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>22TGAGTTCATCACCATCATCATCG23<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>23TTTGCCAGAATCAATTCCAGG21<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>24GAGCAACTAGAGGTGCAAAGGG22<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>25GTTTTCTCCTCTGGTTTCGGC21<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>26AGGATACTTGGCAAACAAACGA22<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>27CAATGGCTTCTACGAGACCGA21<210>28<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>28CGGGATCCGACTGGCGGCTGATTTGG26<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>29TGCACTGCAGCACTAGAACTCTACATGGCAAG32<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>30GCGCATAGTTTCTGATGCAA20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>31TGCAACTTCGTGATCCTCTG20<210>32<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>32ATCACTTGGCTCCACTGTTGTTC23<210>33<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>33ACAAAACACACATAAACATCCAAAGT26<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>34CTGGAGAATGGTGCGGAAGA20<210>35<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>35CAGATAGCGAATCCTGCTGTTGT23<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>36TCGCTGACCGTATGAGCAAAG21<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>37TGTGAACGATTCCTGGACCTG21當(dāng)前第1頁1 2 3