本發(fā)明涉及雞白介素2技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種通過密碼子優(yōu)化雞IL-2基因提高雞的IL-2蛋白表達效率的方法。

背景技術(shù)：

IL-2即白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，又名T細(xì)胞生長因子(T cell growth factor，TCRF)。IL-2是在促有絲分裂素或特異抗原刺激下，由T淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生的在機體免疫調(diào)節(jié)作用的一種細(xì)胞因子。IL-2的主要生物學(xué)功能包括活化T細(xì)胞，促進細(xì)胞因子產(chǎn)生；促進NK細(xì)胞的增殖，并維持其長期生長；促使B胞增殖和產(chǎn)生免疫球蛋白，刺激并提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力；促進Th0和CTL的增殖等。IL-2是調(diào)控機體免疫應(yīng)答的重要因子，也參與抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視。

Schauenstein等在1982年首次發(fā)現(xiàn)雞脾淋巴細(xì)胞能分泌具有類似哺乳動物IL-2活性的細(xì)胞因子，Sundick等在1997年成功獲得了雞的IL-2基因，但在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，與哺乳動物的IL-2相比，雞的IL-2具有很強的種屬特異性和差異性，因此許多在哺乳動物IL-2研究中應(yīng)用成熟的技術(shù)方法都無法應(yīng)用于雞IL-2的研究。自從DNA疫苗被世界各地科研人員廣泛關(guān)注以來，已經(jīng)有研制成功的DNA疫苗進入臨床試驗階段，因此通過將雞的IL-2基因作為抗原目的基因構(gòu)建DNA疫苗來高效表達雞的IL-2蛋白是研究雞IL-2的一種可行方法。目前DNA疫苗應(yīng)用的關(guān)鍵問題是如何增強其免疫效果，提高誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答效率。將雞的IL-2作為佐劑以及免疫增強劑在構(gòu)建新型基因工程疫苗方面呈現(xiàn)出一定的應(yīng)用前景。

在抗原蛋白基因的角度來講，提高DNA疫苗免疫原性的最首要的方法是密碼子優(yōu)化。有研究表明，DNA疫苗質(zhì)粒攜帶的外源目的基因蛋白的高效表達與宿主細(xì)胞信號肽以及目的基因密碼子和宿主密碼子偏好性是否匹配等密切相關(guān)。不同物種在表達蛋白時對密碼子的偏嗜性不同，不同動物細(xì)胞在表達外源基因過程中使用氨基酸密碼子的頻率與病毒蛋白之間存在一定的差異，將目的基因?qū)λ拗魑锓N進行密碼子優(yōu)化，盡量多采用宿主偏愛的密碼子，提高外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的密碼子適用指數(shù)(CAI)和最優(yōu)密碼子使用頻率(FOP)，盡量避免使用稀有密碼子可以顯著提高外源基因的表達水平。因為基因的鳥嘌呤G和胞嘧啶C的含量的理想?yún)^(qū)間為30％-70％，所以優(yōu)化基因堿基中GC的含有率，可增強外源基因的穩(wěn)定性和提高表達水平。大量的研究表明，將DNA疫苗的目的基因按照被免疫目標(biāo)物種的密碼子使用偏好進行優(yōu)化后，可以顯著提高目的基因在該宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達水平。與未優(yōu)化的原基因相比，密碼子優(yōu)化后的基因的蛋白表達量可以提高約5-20倍。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種通過密碼子優(yōu)化雞IL-2基因提高雞的IL-2蛋白表達效率的方法，根據(jù)雞的密碼子偏嗜性進行優(yōu)化后，提高雞IL-2的蛋白表達效率，為雞IL-2構(gòu)建DNA疫苗或作為佐劑奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種通過密碼子優(yōu)化雞IL-2基因提高雞的IL-2蛋白表達效率的方法，將雞的IL-2基因根據(jù)雞的密碼子的偏嗜性進行優(yōu)化，得到的優(yōu)化后的基因optiCKIL-2；將優(yōu)化基因optiCKIL-2連接至真核表達載體pCAGGS構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGoptiCKIL-2。

所述基因optiCKIL-2序列如optiCKIL-2seq所示。

與IL-2基因相比，所述基因optiCKIL-2基因密碼子適用指數(shù)(CAI)為0.99，最優(yōu)密碼子使用頻率為95％，基因中GC含量為57％，優(yōu)化前后兩個基因的氨基酸同源性為100％。

所述真核表達載體為限制性內(nèi)切酶EcoRI和NheI同時酶切質(zhì)粒pCAGGS得到的載體片段。

一種構(gòu)建雞白介素2高效表達質(zhì)粒的方法，包括如下步驟:

S1)克隆IL-2基因，利用密碼子優(yōu)化軟件OPTIMWIZ，根據(jù)雞的密碼子偏嗜性優(yōu)化CKIL-2基因得到優(yōu)化后基因optiCKIL-2，其序列如optiCKIL-2seq所示

S2)將基因optiCKIL-2克隆至載體pUC57-Amp，構(gòu)建質(zhì)粒pUCoptiCKIL-2；

S3)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NheI處理質(zhì)粒pUCoptiCKIL-2，切下含有基因optiCKIL-2的目的條帶，回收目的片段；同時用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NheI雙酶切處理真核表達質(zhì)粒pCAGGS；

S4)連接S3)回收的目的片段optiCKIL-2與酶切處理后的質(zhì)粒pCAGGS，構(gòu)建重組pCAGGoptiCKIL-2。

一種雞白介素2高效表達質(zhì)粒，其特征在于，由真核表達質(zhì)粒pCAGGS和雞的IL-2基因根據(jù)雞的密碼子的偏嗜性進行優(yōu)化，得到的優(yōu)化后的基因optiCKIL-2；所述基因optiCKIL-2序列如optiCKIL-2seq所示。

本發(fā)明的有益效果為：所述通過密碼子優(yōu)化雞IL-2基因提高雞的IL-2蛋白表達效率的方法，根據(jù)雞的密碼子偏嗜性進行優(yōu)化后，提高雞IL-2的蛋白表達效率，為雞IL-2構(gòu)建DNA疫苗或作為佐劑奠定基礎(chǔ)。

附圖說明：

圖1為CKIL-2基因的優(yōu)化前后的密碼子使用頻率CAI對比結(jié)果。

圖2為CKIL-2基因的優(yōu)化前后最優(yōu)密碼子使用頻率(FOP)對比結(jié)果。

圖3為CKIL-2基因的優(yōu)化前后GC含量對比結(jié)果。

圖4為質(zhì)粒pUCCKIL-2酶切分析，其中M：DL5000；1：pUCCKIL-2/EcoRI；2：pUCCKIL-2/NheI；3：pUCCKIL-2；4：pUCCKIL-2/EcoRI/NheI。

圖5為質(zhì)粒pUCoptiCKIL-2酶切分析，其中M：DL5000；1：pUCoptiCKIL-2；2、3、4：pUCoptiCKIL-2/EcoRI/NheI。

圖6質(zhì)粒pCAGGCKIL-2酶切分析，其中M：DL5000；1：pCAGGCKIL-2；2：pCAGGCKIL-2/EcoRI/NheI 3：pCAGGCKIL-2/NheI；4：pCAGGCKIL-2/EcoRI。

圖7質(zhì)粒pCAGGoptiCKIL-2酶切分析，其中M:DL5000；1:pCAGGoptiCKIL-2/EoRI；2:pCAGGoptiCKIL-2/NheI；3：pCAGGoptiCKIL-2/EcoRI/NheI；4:pCAGGoptiCKIL-2/EcoRI/NheI；5:pCAGGoptiCKIL-2。

圖8質(zhì)粒在293T細(xì)胞中蛋白表達產(chǎn)物Western-blot結(jié)果，其中1.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCAGGCKIL-2的293T細(xì)胞；2.未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞；3.蛋白Marker；4.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCAGGoptiCKIL-2的293T細(xì)胞。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的發(fā)明目的，技術(shù)方案及技術(shù)效果更加清楚明白，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明做進一步的說明。應(yīng)理解，此處所描述的具體實施例及相關(guān)附圖，僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

1.1質(zhì)粒和菌株

真核表達質(zhì)粒pCAGGS和工程菌DH5α均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室保存。

1.2方法

1.2.1基因的獲取及密碼子優(yōu)化

根據(jù)NCBI(National Center for Biotechnology)序列數(shù)據(jù)庫公布的雞的IL-2基因組序列(AY510091.1)，合成雞的IL-2基因稱為CKIL-2。利用密碼子優(yōu)化軟件OPTIMWIZ，根據(jù)雞的密碼子偏嗜性優(yōu)化CKIL-2基因得到優(yōu)化后基因optiCKIL-2。參照圖1，圖2，和圖3，密碼子優(yōu)化后optiCKIL-2基因密碼子適用指數(shù)(CAI)從原來的0.78變?yōu)楝F(xiàn)在的0.99，最優(yōu)密碼子使用頻率從原來的40％變?yōu)楹髞淼?5％，基因中GC含量由原來優(yōu)化前的37％變?yōu)閮?yōu)化后的57％，優(yōu)化前后兩個基因的氨基酸同源性為100％，序列對比如下表1，下劃線表示優(yōu)化的序列。

表1優(yōu)化前后CKIL-2與optiCKIL-2核苷酸對比表

optiCKIL-2seq 1 ATGATGTGCAAGGTGCTGATCTTCGGCTGCATCTCCGTGGCCATGCTGATGACCACCGCT

CKIL-2seq 1 ATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGCTGTATTTCGGTAGCAATGCTAATGACTACAGCT

optiCKIL-2seq 61 TACGGCGCCAGCCTGTCCAGCGAGAAGTGGAAGACCCTGCAGACCCTGATCAAGGACCTG

CKIL-2seq 61 TATGGAGCATCTCTATCATCAGAAAAATGGAAAACTCTTCAAACATTAATAAAGGATTTA

optiCKIL-2seq 121 GAGATTCTGGAGAACATCAAGAACAAGATCCACCTGGAGCTGTATACCCCCACCGAGACC

CKIL-2seq 121 GAAATATTGGAAAATATCAAGAATAAGATTCATCTCGAGCTCTACACACCAACTGAGACC

optiCKIL-2seq 181 CAGGAGTGCACACAGCAGACCCTGCAGTGCTACCTGGGCGAGGTGGTGACCCTGAAGAAG

CKIL-2seq 181 CAGGAGTGCACCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGAGAAGTGGTTACTCTGAAGAAA

optiCKIL-2seq 241 GAGACAGAGGACGACACCGAGATCAAGGAGGAGTTCGTGACCGCCATCCAGAACATCGAG

CKIL-2seql 241 GAAACTGAAGATGACACTGAAATTAAAGAAGAATTTGTAACTGCTATTCAAAATATCGAA

optiCKIL-2seq 301 AAGAACCTGAAGAGCCTGACCGGCCTGAACCACACCGGCAGCGAATGCAAGATCTGCGAG

CKIL-2seq 301 AAGAACCTCAAGAGTCTTACGGGTCTAAATCACACCGGAAGTGAATGCAAGATCTGTGAA

optiCKIL-2seq 361 GCCAACAACAAGAAGAAGTTCCCCGACTTCCTGCACGAGCTGACCAACTTCGTGAGGTAC

CKIL-2seql 361 GCTAACAACAAGAAAAAATTTCCTGATTTTCTCCATGAACTGACCAACTTTGTGAGATAT

optiCKIL-2seq421 CTGCAGAAGTGA

CKIL-2seq 421 CTGCAAAAATAA

1.2.2表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將CKIL-2基因和優(yōu)化后基因optiCKIL-2分別克隆至載體pUC57-Amp，構(gòu)建質(zhì)粒質(zhì)粒pUCCKIL-2和pUCoptiCKIL-2。

目的片段回收分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NheI處理質(zhì)粒pUCCKIL-2和pUCoptiCKIL-2。酶切反應(yīng)體系如下表2：

表2：酶切反應(yīng)體系

將酶切產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳，如圖4和圖5所示，雙酶切獲得了500bp左右的條帶。

切下含有基因CKIL-2和optiCKIL-2的目的條帶凝膠后，按照天根通用型DNA純化回收試劑盒說明書進行膠回收，并進行測序，測序結(jié)果與CKIL-2和optiCKIL-2一致，無位點突變。

同時用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NheI雙酶切處理真核表達質(zhì)粒pCAGGS。

2.回收產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化分別將回收的基因CKIL-2和optiCKIL-2片段與處理后的質(zhì)粒pCAGGS連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGCKIL-2和pCAGGoptiCKIL-2。連接體系如下表3：

表3連接體系

將上述混合物混勻，16℃連接過夜。將獲得的連接產(chǎn)物10μL加到100mL感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱沖擊1.5min后，迅速冰浴2～3min。加500μL不含抗菌素的LB液體培養(yǎng)基，置于搖床中，37℃，150r/min搖動1h。取上述菌液涂布于含氨芐青霉素(終濃度為100μg/mL)的LB固體選擇培養(yǎng)基平板上，待菌液完全吸收后放入溫箱，37℃倒置培養(yǎng)12h～16h。

3.陽性菌落的篩選和鑒定。從每個培養(yǎng)基平板中隨即挑取8個單菌落接種于1000μL含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h后，用天根質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠電泳確定出3個疑似陽性克隆質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定及測序鑒定。如圖6和圖7所上市，重組質(zhì)粒pCAGGCKIL-2和pCAGGoptiCKIL-2雙酶切得到了500bp左右的條帶，測序結(jié)果序列一致，無突變位點，說明重組質(zhì)粒pCAGGCKIL-2和pCAGGoptiCKIL-2構(gòu)建成功。

1.2.3表達質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達

質(zhì)粒DNA的制備將獲得的陽性克隆轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，擴大培養(yǎng)。使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒(MN公司產(chǎn)品)抽提質(zhì)粒，步驟如下：將100mL菌液，以10000r/min離心10min，棄菌液上清；加8mL的RES-EF于上述離心管中，充分重懸菌體；向上述離心管中加8mL的LYS-EF，上下顛倒5次，室溫放置2min；加8mL的NEU-EF于上述混合液中，上下顛倒10-15次，然后冰上放置5min；潤洗柱子，從柱子邊緣加15mL的EQU-EF，待柱中的液體過濾完后，將上述混合液加入柱中；待柱中液體過濾完后，從柱子邊緣加5mL的FIL-EF；待柱中液體過濾完后，棄濾膜，加35mL的ENDO-EF到柱中；待柱中液體過濾完后，加15mL的WASH-EF于柱中；將柱子放在15mL離心管上，加5mL的ELU-EF，待柱中液體全部過濾到管中；向上述管中加3.5mL(0.7倍體積)的異丙醇；12000r/min，離心30min；棄上清液，加入2mL 70％乙醇，12000r/min，離心5min；棄上清液，盡量吸干離心管底部液體，開蓋放置5min；向管中加200μL H2O-EF，用槍頭吹打底部白色沉淀，使其充分溶解；用分光光度儀測提取質(zhì)粒的濃度。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24h，將293T細(xì)胞均勻鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞匯合度達到70％左右進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染時用500μL Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒，吹打混勻；向質(zhì)粒稀釋液中加入10μL的Lipofectamine2000，并輕輕震蕩混勻；室溫下孵育20min；將6孔細(xì)胞板中的培養(yǎng)液吸出并使用Opti-MEM或PBS洗2-3次，并加400μL Opti-MEM培養(yǎng)液；將靜置了20min的混合液加入到6孔板中，輕輕晃動細(xì)胞板使均勻分布；將細(xì)胞板置于CO2濃度為5％的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h，檢測表達情況。

Western blot檢測目的蛋白的表達將在6孔板表達的外源蛋白的293T細(xì)胞，用PBS清洗3次后，每孔加入100uL蛋白酶抑制劑PMSF和裂解液RIPA的混合液，反復(fù)吹打，并收集至1.5mL離心管中；5000r/min 4℃離心5min，取上清與5×SDS混合，沸水中煮10min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在進行SDS-PAGE凝膠電泳時，將樣品加入孔中。先恒壓80V電泳，當(dāng)樣品進入下層膠后改為恒壓120V電泳直至溴酚藍達到凝膠底部為止。電泳完畢后，根據(jù)目的蛋白大小切膠，測量膠片大小，將切好的膠置于轉(zhuǎn)膠緩沖液中室溫平衡5min；裁剪硝酸纖維素膜和濾紙，并置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min，同時浸泡濾紙；用濕電轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜。

完成轉(zhuǎn)膜后，取下硝酸纖維素膜，用TBST漂洗3次，每次5min，漂洗后將硝酸纖維素膜放入BSA封閉液中，室溫封閉2h，或者4℃冰箱過夜；再取出硝酸纖維素膜用TBST漂洗3次，每次5min；放入一抗稀釋液中室溫低速孵育2h；回收一抗，用TBST將硝酸纖維素膜漂洗3次，每次5min；然后將硝酸纖維素膜放入二抗的稀釋液中，避光室溫孵育1h，孵育后用TBST將硝酸纖維素膜漂洗3次，每次10min。用掃膜儀進行掃膜，分析處理圖片后保存。

參照圖8，Western blot結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pCAGGS的293T細(xì)胞均無特異性條帶，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCAGGCKIL-2和pCAGGoptiCKIL-2的293T細(xì)胞均產(chǎn)生約19KDa大小的特異性條帶，說明質(zhì)粒pCAGGCKIL-2和pCAGGoptiCKIL-2均能在體外表達雞IL-2特異性蛋白，且重組質(zhì)粒pCAGGoptiCKIL-2表達蛋白的效率明顯高于質(zhì)粒pCAGGCKIL-2。說明，將雞的IL-2基因根據(jù)雞的密碼子偏嗜性進行優(yōu)化后，可以提高雞IL-2的蛋白表達效率，為雞IL-2構(gòu)建DNA疫苗或作為佐劑奠定基礎(chǔ)。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其架構(gòu)形式能夠靈活多變，可以派生系列產(chǎn)品。只是做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明由所提交的權(quán)利要求書確定的專利保護范圍。