本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及長非編碼RNA--TUG1在診斷及制備治療子癇前期藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

子癇前期是全球最常見妊娠期合并癥之一，也是妊娠期并發(fā)癥相關(guān)死亡的主要原因之一,世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)報(bào)道，子癇前期或者子癇直接導(dǎo)致全球每年約14％(約8500)的孕產(chǎn)婦死亡，同時(shí)是胎兒早產(chǎn)和胎兒生長受限以及孕產(chǎn)婦死亡最常見的原因之一。雖然目前內(nèi)科治療得到了很大的進(jìn)步,但病人總體發(fā)生率依然相對較高。隨著基因轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基因診斷和分子靶向治療成為子癇前期治療中一個熱點(diǎn)話題。其中長非編碼的異常表達(dá)對疾病(例如子癇前期)的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。因此,研究長非編碼RNA異常表達(dá)參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的的分子機(jī)制，對制定特定的診斷方法和個性化的治療策略至關(guān)重要。

在過去的十年里,基于快速出現(xiàn)的高通量測序的基因表達(dá)分析技術(shù)和生物信息學(xué)推動了大規(guī)模的人類基因組學(xué)的研究,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了非編碼RNAs。人類基因組中只有2％的編碼轉(zhuǎn)錄成蛋白,而絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄成非編碼RNAs，包括小分子核糖核酸、長非編碼rna(lncRNAs)和假基因。最近,miRNA在細(xì)胞進(jìn)程的各個方面的作用已經(jīng)得到證實(shí)，然而,lncRNAs的功能研究不是很透徹。ENCODE計(jì)劃中GENECODE研究組新數(shù)據(jù)顯示有成千上萬的lncRNAs,但只有其中的一些有生物學(xué)功能。有趣的是,這些lncRNAs通過染色質(zhì)重塑參與調(diào)控多種細(xì)胞進(jìn)程,包括重組干細(xì)胞多能性,父母的印記和腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移以及表觀遺傳修飾和吸附miRNAs。

最近,大量的研究顯示，異常lncRNAs表達(dá)與多樣的人類疾病相關(guān)。例如,lncRNA ROR可通過抑制甲基轉(zhuǎn)移酶G9A,促進(jìn)TESC的啟動子區(qū)H3K9去甲基化參與腫瘤發(fā)生。同時(shí),AOC4P通過與波形蛋白綁定和促進(jìn)其降解，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)從而抑制肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移。此外,上調(diào)的SPRY4-IT1通過與HUR綁定，抑制子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，遷移和血管形成能力。這些發(fā)現(xiàn)表明lncRNAs在人類疾病尤其是子癇前期的發(fā)生發(fā)展過程中扮演至關(guān)重要的角色。因此,發(fā)現(xiàn)更多的子癇前期相關(guān)的lncRNAs并研究他們的生物功能和機(jī)制，對更好地理解子癇前期發(fā)生發(fā)展的的分子生物學(xué)有重要的意義。

TUG1是一條長度為7598bp的lncRNA,其序列如SEQ ID NO：1所示，即

其位于人類染色體22q12.2。我們發(fā)現(xiàn)TUG1在子癇前期孕婦胎盤組織中較正常孕婦胎盤中表達(dá)量下調(diào)。在敲除TUG1后，研究了TUG1在子癇前期發(fā)生和發(fā)展的作用并研究了TUG1在子癇前期孕婦滋養(yǎng)細(xì)胞中的相關(guān)靶基因的功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)目的

本發(fā)明的目的是提供TUG1在診斷子癇前期及在制備治療子癇前期藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及一種長鏈非編碼RNA，其核苷酸序列為SeqNO:1；

一種長鏈非編碼RNA在制備治療子癇前期藥物中的應(yīng)用；

一種長非編碼RNA在制備診斷子癇前期試劑中的應(yīng)用；

一種檢測TUG1的引物，如SEQ ID NO：4、5所示，即：SEQ ID NO：4 TUG1 F TAGCAGTTCCCCAATCCTTG，SEQ I D NO：5TUG1R CACAAATTCCCATCATTCCC；。

兩種干擾TUG1的siRNA,如序列2、3所示，即：SEQ ID NO：2 si-TUG1-1#(sense 5-GGGAUAUAGCCAGAGAACAAUUCUA-3)；SEQ ID NO：3(sense 5-GCUUGGCUUCUAUUCUGAAUCCUUU-3)

一種試劑盒，包括所述引物；

一種包括所述長鏈非編碼RNA的藥物組合物；

所述引物在制備診斷子癇前期試劑中的應(yīng)用；

所述藥物組合物在制備治療子癇前期藥物中的應(yīng)用。

所述藥物組合物，其中還包括輔料。輔料包括：(lip2000,Opti-mem培養(yǎng)液,PBS磷酸緩沖鹽溶液，0.9％Nacl)。

所述試劑盒，所述引物中的濃度分別為10mol/L。

技術(shù)方案

通過qPCR篩查臨床組織中TUG1的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在子癇前期孕婦胎盤組織中TUG1的表達(dá)量較正常孕婦胎盤中表達(dá)量低。固而猜想：TUG1是否參與了子癇前期疾病的發(fā)病過程。

隨后選用國際認(rèn)可的正常滋養(yǎng)細(xì)胞(即HTR-8/SVneo細(xì)胞株)作為實(shí)驗(yàn)研究對象，設(shè)計(jì)TUG1的干擾序列，以lip2000為轉(zhuǎn)染載體將已設(shè)計(jì)有效的干擾序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞后通過敲低滋養(yǎng)細(xì)胞中TUG1的表達(dá)來模擬子癇前期疾病疾病的發(fā)生，發(fā)展及預(yù)后等過程。通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測在干擾序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞后細(xì)胞的功能表型如增殖，凋亡，遷移和侵襲能力等。從而證明在正常的滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo中敲低TUG1的表達(dá)，影響了滋養(yǎng)細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)或加速子癇前期疾病的發(fā)病進(jìn)程。

通過基因轉(zhuǎn)錄組測序，檢測TUG1的可能參與細(xì)胞功能(如增殖，凋亡或遷移)的相關(guān)下游靶基因，隨后對TUG1調(diào)控機(jī)制作初步探討，通過核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)以及FISH手段發(fā)現(xiàn)TUG1更多的存在于滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核中，考慮到TUG1可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控相應(yīng)的靶基因，通過RIP和CHIP實(shí)驗(yàn)檢測TUG1通過綁定EZH2蛋白抑制下游靶基因KLF2和RND3的表達(dá)。

轉(zhuǎn)染過程所需的各種試劑，

(1)lip2000，一種多用途的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，適用于DNA、RNA和寡核苷酸的轉(zhuǎn)染，對大多數(shù)真核細(xì)胞具有很高的轉(zhuǎn)染效率。其獨(dú)特的配方使其可直接加入培養(yǎng)基中，血清的存在不會影響轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而將PVT1干擾序列轉(zhuǎn)進(jìn)到細(xì)胞內(nèi)。

(2)Opti-mem培養(yǎng)液，含HEPES，2400mg/l碳酸氫鈉，次黃嘌呤，胸腺嘧啶，丙酮酸鈉，L-谷氨酰胺，微量元素，生長因子，以及減量至1.1mg/l的酚紅，作為轉(zhuǎn)染試劑的輔料，其本身對細(xì)胞無任何害處，而更好更有效的轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞中，以獲得預(yù)期目的。

(3)PBS磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline)一般作為溶劑，起溶解保護(hù)試劑的作用。它是生物化學(xué)研究中使用最為廣泛的一種緩沖液，主要成分為Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它們有二級解離，緩沖的pH值范圍很廣；而NaCl和KCl主要作用為增加鹽離子濃度。排除其本身對實(shí)驗(yàn)對象的影響。

(4)0.9％Nacl，生理鹽水(醫(yī)用)：一般作為溶劑。在轉(zhuǎn)染干擾序列之前用0.9％Nacl給預(yù)處理的細(xì)胞洗清，將死亡的細(xì)胞去掉，并增加轉(zhuǎn)染的效果。排除其本身對實(shí)驗(yàn)對象的影響。

組織收集

我們收集了52對2015年至2016年在江蘇省人民醫(yī)院，江蘇省婦幼保健院接受剖宮產(chǎn)手術(shù)，診斷患有子癇前期的孕婦胎盤組織和不含有任何基礎(chǔ)疾病的正常孕婦胎盤組織。并記錄臨床的特點(diǎn)：包括孕婦年齡，有無吸煙史，孕周數(shù)，收縮壓，舒張壓以，蛋白尿以及胎兒體重。組織樣本收集的均為第一時(shí)間液氮或儲存在-80℃,直至RNA提取。該研究經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。獲得所有病人的書面知情同意。

細(xì)胞系

選取滋養(yǎng)細(xì)胞(HTR-8/SVneo)來自加拿大女皇大學(xué)提供。HTR-8/SVneo細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；培養(yǎng)基中均含有5％的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的鏈霉素。5％CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2-3天更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％-90％時(shí)傳代。所有細(xì)胞系被短串聯(lián)重復(fù)序列的DNA分析驗(yàn)證。

RNA提取和定量PCR分析

根據(jù)試劑的使用說明，用Trizol試劑分離總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)用TaKaRa Prime Script試劑盒(TaKaRa,大連,中國)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最終體積為20μl。結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，采用相對量法與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的分析。計(jì)算公式為：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

選用于轉(zhuǎn)染的載體(即lip2000)。TUG1的干擾序列即：SEQ ID NO：2si-TUG1-1#(sense 5-GGGAUAUAGCCAGAGAACAAUUCUA-3)；SEQ ID NO：3(sense 5-GCUUGGCUUCUAUUCUGAAUCCUUU-3)及亂序?qū)φ?si-NC)均購自Invitrogen公司(Invitrogen公司，CA，USA)。將細(xì)胞HTR-8/SVneo按每孔2×105個細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，于轉(zhuǎn)染前6h吸棄原有培養(yǎng)基，換成無雙抗培養(yǎng)基；取10μL脂質(zhì)體稀釋于240μL的OPTI-MEM中，溫和吹打混勻室溫下孵育5min；取100pmol siRNA,si-NC分別稀釋于250μL OPTI-MEM中，吹打混勻室溫下孵育5min；將孵育好的脂質(zhì)體與siRNA或質(zhì)粒稀釋液混合，溫和吹打混勻。于室溫下繼續(xù)孵育20min；將上述混合物均勻滴入事先加好1.5mL OPTI-MEM的6孔培養(yǎng)板中，輕輕混勻。37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h后，換完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞提取RNA或蛋白進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR或蛋白免疫印跡分析(western blotting)。

細(xì)胞增殖活性檢測

MTT實(shí)驗(yàn)，將處理后的細(xì)胞按每孔2000-3000個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞80％貼壁后，細(xì)胞同步化12h，棄去原有培養(yǎng)基。每個樣本設(shè)置6個復(fù)孔，每孔總反應(yīng)體積為200μl。每孔加入20μl的MTT反應(yīng)液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h。棄去上清液，每孔加入150μl二甲亞砜(DMSO)，震蕩10min，酶標(biāo)儀測定490nm波長處的吸光度。

EdU實(shí)驗(yàn)，將2.5ul的干擾序列處理24孔板中細(xì)胞，36h后在每孔中加入10μM EdU試劑。2h后，用4％多聚甲醛固定30分鐘。清洗，使用Click-iTR Edu試劑盒染色30分鐘，隨后用DAPI染色15分鐘，隨后使用倒置熒光顯微鏡拍攝(奧林巴斯，日本)。最后，使用Image-Pro Plus軟件分析。

流式細(xì)胞術(shù)

凋亡檢測，用胰酶消化收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的HTR-8/SVneo細(xì)胞，隨后根據(jù)FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒(BD)及其使用說明予以Annexin V-FITC熒光探針和碘化丙錠(PI)染色。流式細(xì)胞儀檢測和分析。

細(xì)胞周期檢測，根據(jù)說明書使用CycleTESTTM PLUS DNA試劑盒(BD)予以PI染色，隨后用FACScan分析。

細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

24孔板中放置8μm孔徑大小的Transwell小室。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，用50mg/l BD Matrigel 1:6稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，包被好的小室放入24孔板中，孵箱中孵育6h。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS或者0.9％生理鹽水清洗1-2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至3x105。取細(xì)胞懸液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入700μl含10％FBS的培養(yǎng)基，放入孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24h。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞密度至3x104。取細(xì)胞懸液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入700μl含10％FBS的培養(yǎng)基，放入孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24h。取小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，用0.1％結(jié)晶紫將小室外底面的細(xì)胞染色利用倒置顯微鏡對Transwell小室底膜上下室側(cè)附著的染色的細(xì)胞拍照計(jì)數(shù)。

亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位

根據(jù)使用說明書使用PARIS試劑盒(Life Technologies，USA)分離HTR-8/SVneo細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。使用qPCR方法檢測PVT1、GAPDH和U1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布。GAPDH為細(xì)胞質(zhì)參照，U1為細(xì)胞核參照。以總RNA百分比呈現(xiàn)PVT1、GAPDH和U1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)情況。

原位雜交技術(shù)(FISH)

根據(jù)PVT1基因轉(zhuǎn)錄本的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)相對應(yīng)的探針(由上海博谷生物科技公司合成)，將HTR-8/SVneo細(xì)胞種植于含有15mm爬片6孔板里，待細(xì)胞至80％左右時(shí)，棄培養(yǎng)基用PBS清洗兩遍后，加2ml的甲醇固定30min后送樣，由上海博谷生物科技公司進(jìn)行接下來的處理，選用倒置銀光顯微鏡拍照，定性檢測PVT1在細(xì)胞中的亞定位，進(jìn)一步驗(yàn)證核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

RNA測序

將細(xì)胞種植于六孔板中，待細(xì)胞長至80％左右后給于10ul的lip2000si-PVT1和si-NC處理，48h后用Trizol處理收集細(xì)胞，送樣，由北京基因檢測機(jī)構(gòu)實(shí)施，選用Illumina進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)，得到并處理相應(yīng)的數(shù)據(jù)。RNA免疫印跡(RIP)

裂解HTR-8/SVneo細(xì)胞供內(nèi)源性PRC2復(fù)合物免疫印跡實(shí)驗(yàn)使用。將細(xì)胞上清與包被分別識別EZH2、SNRNP70和對照IgG的蛋白A/G瓊脂糖磁珠在4℃孵育6個小時(shí)。隨后，清洗磁珠，用0.1％SDS/0.5mg/ml蛋白酶K在55℃孵育30分鐘以去除蛋白。提取RNA供qPCR分析。

染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)

使用4％多聚甲醛固HTR-8/SVneo細(xì)胞，孵育10分鐘以產(chǎn)生DNA-蛋白交聯(lián)。超聲裂解細(xì)胞以產(chǎn)生200-300bp的染色體碎片，隨后用EZH2和H3K27me3特異性抗體和對照IgG抗體孵育沉淀?；謴?fù)染色質(zhì)DNA，隨后使用qPCR檢測分析。蛋白質(zhì)免疫印跡(Westblotting)

將變性好的細(xì)胞蛋白裂解產(chǎn)物加入至預(yù)先制好的10％變性聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)的加樣孔中，分離樣本中蛋白。隨后轉(zhuǎn)至NC膜，并以特異性抗體孵育。最后用ECL發(fā)光液壓片曝光。GAPDH抗體為對照，TP53INP1抗體購自CST公司，ANGPTL4抗體購自Proteintech公司。

數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)皆用SPSS17.0軟件分析，以三次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間差異用雙尾Student’sT檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。單因素分析中p<0.05的隨后再使用多因素分析。

附圖說明

圖1、TUG1在子癇前期孕婦胎盤組織中表達(dá)下調(diào)

1a TUG1在子癇前期孕婦胎盤組織(n＝52)表達(dá)較正常組織下調(diào)

1b TUG1在子癇前期孕婦胎盤組織(n＝52)表達(dá)較正常組織下調(diào)

圖2、TUG1對滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖能力的影響

2a在HTR-8/SVneo細(xì)胞中敲低TUG1的表達(dá)

2b敲低TUG1表達(dá)抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖能力

2c敲低TUG1能夠使HTR-8/SVneo細(xì)胞克隆形成能力減弱

2d敲低TUG1能夠減弱HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖能力

圖3 TUG1對HTR-8/SVneo細(xì)胞周期、凋亡、遷移和侵襲的影響

3a敲低TUG1能夠促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo凋亡

3b敲低TUG1誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期

3c敲低TUG1能夠抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移能力

3e敲低TUG1能夠抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞的侵襲能力

圖4通過測序檢測參與TUG1介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞生長的潛在下游靶基因

4a-c細(xì)胞測序的相關(guān)性分析以及GO分析

4d-e敲低TUG1驗(yàn)證KLF2和RND3是其潛在的靶基因

圖5 TUG1通過結(jié)合EZH2蛋白,抑制KLF2和RND3啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄

5a-b TUG1定位于細(xì)胞核

5c RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TUG1與EZH2結(jié)合

5d-f蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)(CHIP)，驗(yàn)證得到TUG1通過與EZH2蛋白的綁定抑制KLF2和RND3的表達(dá)

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。

實(shí)施例中末注明具體條件的的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照Sambrook，J等人編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黃培堂等譯，科學(xué)出版社.2002.8)中所述的條件及方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進(jìn)行，其它沒有詳細(xì)描述的技術(shù)相應(yīng)于本領(lǐng)域人員來說是熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。

本發(fā)明的材料：本申請中提及的細(xì)胞株以及培養(yǎng)基均有商品供應(yīng)或以別的途徑能為公眾所得，它們僅作舉例，對本發(fā)明不是唯一的，可分別用其它適合的工具和生物材料來代替。

實(shí)施例1

檢測TUG1在組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

取0.1g組織，液氮研磨充分(成粉末狀)或1-5×107細(xì)胞棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS潤洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以無酶槍頭吹打混勻，靜置5min，將裂解液移入預(yù)先標(biāo)記好的無酶1.5ml的離心管中。4℃7500g離心5分鐘，取上清加入1/5體積的氯仿，顛倒混勻30s，靜置2min。4℃，12000g離心，15min。溶液分三層(水相-白色沉淀-紅色有機(jī)物)，轉(zhuǎn)移水相層至新的1.5ml離心管中，盡量不要吸到白色沉淀。加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，放置5-10min。4℃，12000g離心，10min。吸棄上清，加入1ml 75％的乙醇(現(xiàn)配)，洗滌RNA沉淀。4℃，7500g離心，5min，棄上清。盡量去除75％的酒精，于室溫中晾干，約15min。用無RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。

紫外吸收測定法測定RNA的濃度。使用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，測量前先用溶解RNA用的DEPC水調(diào)零。在260nm處讀值1為表示40ng/μl，RNA溶液的A260/A280的比值用于RNA純度的檢測，比值范圍在1.8到2.1表明符合要求。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。配制1％的瓊脂糖膠。加熱溶解瓊脂糖，冷卻，加入1μl溴化乙錠(EB,10mg/ml)。搖勻后倒膠，待膠冷凝后，置于電泳槽中，浸于1×TAE緩沖液中平衡10min，待用。點(diǎn)樣。按1:4(v/v)將5×核酸電泳上樣緩沖液與樣本混合，準(zhǔn)確將各樣本含有1μg的RNA加入凝膠孔中。80V恒壓電泳50min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

Tris-乙酸(TAE)緩沖液配方(1L)50×：

實(shí)時(shí)定量PCR

子癇前期孕婦胎盤組織及正常孕婦胎盤組織標(biāo)本，HTR-8/SVneo細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)用TaKaRa PrimeScript試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37℃15min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；85℃5sec(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))。根據(jù)Genebank提供的基因序列，設(shè)計(jì)引物序列，

QPCR應(yīng)用7300PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA樣品采用三部法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。反應(yīng)體系：

反應(yīng)條件：

結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，采用相對量法與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的分析。計(jì)算公式為：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

TUG1的引物如下：

Primer F 5’-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG-3’，見SEQ ID NO：4，

Primer R 5’-CACAAATTCCCATCATTCCC-3’，見SEQ ID NO：5。

結(jié)果表明,lncRNA TUG1在子癇前期孕婦胎盤組織表達(dá)較正常組織下調(diào)(圖1A)。我們利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測了52對子癇前期孕婦胎盤組織表達(dá)較正常組織中TUG1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示與正常孕婦胎盤組織相比，TUG1的表達(dá)在67.31％(35/52)的子癇前期孕婦胎盤組織中較正常組織表達(dá)降低(圖1B)。提示TUG1可能在子癇前期疾病的診斷，發(fā)生發(fā)展及治療中扮演著重要的作用。

Table 1子癇前期孕婦和正常妊娠孕婦的臨床數(shù)據(jù)

實(shí)施例2。

為了研究TUG1對正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo細(xì)胞表型的影響。

首先，選取正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo細(xì)胞系作為本實(shí)驗(yàn)的研究對象，利用lip2000作為載體，轉(zhuǎn)染TUG1干擾序列以敲低TUG1的表達(dá)模擬子癇前期的發(fā)病過程，MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),在HTR-8/SVneo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TUG1的干擾序列，敲低TUG1表達(dá)后抑制細(xì)胞生長。(圖2B)。此外,克隆形成試驗(yàn)結(jié)果表明,下調(diào)TUG1后HTR-8/SVneo細(xì)胞克隆形成能力減弱(圖2C)。此外,EDU染色證明,敲低TUG1后減少HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖,而過表達(dá)TUG1后HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖增強(qiáng)(圖2D)。由此可知，這些數(shù)據(jù)表明,TUG1敲低后抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖能力。

實(shí)施例3

TUG1對胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo周期和凋亡的影響

為了研究是否TUG1對HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖影響了細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換,以正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo細(xì)胞系作為研究對象，利用lip2000作為載體，轉(zhuǎn)染TUG1干擾序列以敲低TUG1的表達(dá)模擬子癇前期的發(fā)病過程。利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。結(jié)果表明,HTR-8/SVneo細(xì)胞轉(zhuǎn)染TUG1干擾序列后，發(fā)現(xiàn)敲低TUG1的表達(dá)后細(xì)胞周期阻滯在G1/G0期(圖3B)。此外,我們進(jìn)行了流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡是否參與了TUG1敲低后誘導(dǎo)的細(xì)胞生長受抑。如圖3A所示,早期凋亡(UR)和晚期凋亡率(LR)在TUG1敲低的HTR-8/SVneo細(xì)胞中高于對照組細(xì)胞。TUG1影響了滋養(yǎng)細(xì)胞的周期和凋亡。

實(shí)施例4

TUG1參與HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲

滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移子癇前期發(fā)病機(jī)制中的一個重要方面。HTR-8/SVneo細(xì)胞系作為研究對象，利用lip2000作為載體，轉(zhuǎn)染TUG1干擾序列以敲低TUG1的表達(dá)模擬子癇前期的發(fā)病過程。利用transwells實(shí)驗(yàn)研究了TUG1敲低以后對HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲能力影響。結(jié)果表明,敲低TUG1后與對照組細(xì)胞相比，抑制了滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo遷移能力,抑制侵襲能力(圖3C和D)。這些結(jié)果表明,敲低TUG1表達(dá)后抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的表型,阻礙了滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo的遷移和侵襲?？梢?，TUG1的低表達(dá)表達(dá)影響著正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo的細(xì)胞遷移和侵襲能力，進(jìn)一步影響著胎盤的淺著床，誘導(dǎo)子癇前期疾病的發(fā)生，給藥TUG1可以治療子癇前期疾病。

討論

在過去的十年里,隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展,越來越多的lncRNAs被人們認(rèn)知。在多種人類疾病中包括子癇前期中l(wèi)ncRNA呈異常表達(dá)。例如,在子癇前期中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá)異常影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖及凋亡能力。此外,一些研究顯示,lncRNAs比蛋白質(zhì)編碼基因更具組織特異性,這說明lncRNA更有可能作為不同腫瘤更加敏感的生物標(biāo)志物。因此,發(fā)現(xiàn)子癇前期相關(guān)的lncRNAs,研究他們的臨床意義和生物功能，可促進(jìn)lncRNA指導(dǎo)的子癇前期的診斷和治療。

本研究中,我們發(fā)現(xiàn)了一個新的lncRNA TUG1并證明其在子癇前期組織中表達(dá)下調(diào)。下調(diào)的TUG1表達(dá)與子癇前期發(fā)病機(jī)制有著密切的關(guān)系。此外，敲低TUG1后抑制細(xì)胞增殖,遷移和侵襲,促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。此外,我們認(rèn)為敲低TUG1介導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞生長抑制在一定程度上依賴于KLF2和RND3的表達(dá)。在這里,我們首次證實(shí)TUG1在人類滋養(yǎng)細(xì)胞中行使相關(guān)功能，是通過抑制的滋養(yǎng)細(xì)胞抑制因子KLF2和RND3的表達(dá)。lncRNAs通過各種機(jī)制調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),如招募染色質(zhì)調(diào)節(jié)酶到靶基因和順式或反式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄,作為腳手架結(jié)合相關(guān)分子原件或吸附miRNA。在這項(xiàng)研究中,我們發(fā)現(xiàn)在HTR-8/SVneo細(xì)胞中TUG1可以結(jié)合EZH2,招募他們到KLF2和RND3啟動子區(qū)域抑制其轉(zhuǎn)錄。

EZH2-PRC2的核心單元,是一個組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，催化靶基因的H3K27三甲基化；本實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步證明，在滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo中KLF2與RND3共同轉(zhuǎn)錄，可被TUG1募集的EZH2抑制。KLF2是一個細(xì)胞抑制因子大家庭的重要成員之一,已被確定為一個新的細(xì)胞平衡調(diào)節(jié)器。我們的結(jié)果也表明了,上調(diào)其表達(dá)水平可以抑制滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減弱細(xì)胞的遷移和侵襲能力。綜上所述,我們的研究結(jié)果表明,lncRNA TUG1表達(dá)減少可能導(dǎo)致胎盤的淺著床，誘發(fā)子癇前期的發(fā)生和發(fā)展。

我們的研究首次發(fā)現(xiàn),在子癇前期孕婦胎盤組織和細(xì)胞TUG1表達(dá)下調(diào)。在子癇前期孕婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞HT-8/SVneo敲低TUG1的表達(dá)，表現(xiàn)出細(xì)胞抑制功能，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖、遷移減少以及細(xì)胞凋亡增加。此外。我們的發(fā)現(xiàn)會進(jìn)一步豐富子癇前期發(fā)病機(jī)制,并促進(jìn)lncRNA指導(dǎo)的診斷和治療。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇省人民醫(yī)院

<120> 一種長非編碼RNA及其在診斷／治療子癇前期中的應(yīng)用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7598

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcctgctttc ctgaccctct ccgccattta aagaaacagt accgggggcg ggccgagcga 60

cgcagccggg acggtagctg cggtgcggac cggaggagcc atcttgtctc gtcgccgggg 120

agtcaggccc ctaaatcgaa gaagccctgg cgcgccctcc ccccctcccg ggtctggtag 180

ggcgaaggaa cgggcgtgcg gtcgatcgag cgatcggttg gcggctcttt ctcctgctct 240

ggcatccagc tcttggggcg caggcccggc cgccgcggcg cgcgcccggt ggccgttggc 300

gctcgcgccg cgtctttctt ctcgtacgca gaactcgggc ggcggcctat gcgtttgcga 360

ttcgacgagg agtcgtccgg gtggtcggcg gcggcgggca gctgctccgc cccgctccgg 420

gggaggcggc ggcggcagcg gccgcgggat ttggagcggc cggggaggcg ggggtggccg 480

gggccggctt ggaggcctgg cgccaccctt cggggcctgc aaggacccag ttgggggggc 540

aggagggggc cggaggatgg ttggttgtgg gatttctact ttgccttttc ctccttatgc 600

cgccttagtg aggggcggga gctctggcgg cagccccggg gtggggagac gagctccgga 660

gtcggaagag ctgggttttc ttccgggcct agccaccagt tggcggagtg accttaggcg 720

agtcactctg taatttgtct gcgcctcagt ttcctcctct gcctatcaat gtgtgtgggg 780

ttgaaatcgc tttgtaaact ataaagcgtg ggtgtacgta aaggatggtt attgtttata 840

attttttttg agttgtaaga aaacttagca gttccccaat ccttgggttt tgaacctggg 900

aaccttggat tggagttggg gatccccaaa cttcctgaaa ttgtgggaat gtgcggtttg 960

ggggaatgat gggaatttgt gggaatgtgc gttttagggg aatgatgatc catcgctagc 1020

aagttttcca agggggctgt gacccagaag agttaagaat cacaatttct tcatgctaca 1080

gagaggaaac tgaggcctag atgtcatttg ggacccttca caaccatttt gaagccctgt 1140

ttgagtccct gggatatgtg agctgtttct atgcataatg gatattcggg gttaacaaca 1200

gtcccctgct tggcttctat tctgaatcct tttctttcac catggggtgc ctgaagggtg 1260

gctgatgcat atggtacaat ggcacccagt gtaaagcagc tacaattagg agtggatgtg 1320

ttctgtagca tcctatttaa ataagcctat tttatccttt ggcccgtcaa ctctgttatc 1380

tgctgcttgt actggtgcct gtacttttct gactctcatt gaccatattc cacgaccatg 1440

gttgtcatcc attacttgat cctactttac atgtctaggc tgtgtggttg gtggtgaata 1500

ggcttctttt tacatggtgc tgccagccca gctaattaat ggtgcacgtg gacttttagc 1560

aagcgggctc actggaagag actgaacctg gcatggaatt cctgaagatg tttggggttt 1620

ttttctttct taatcgaaag ttaacattgt ctgaaaagtt ttgttagaac tactgcggaa 1680

cctcaaaatc agtagatttg gaagtgattc aaagctaaac tttttccttg gccctccttg 1740

tgttctaatt gcttgcaagt gtaatactag gatgtccaag atgccagttt ttgcttcttt 1800

gttagttgtc agctgctttt atcaaatttc aggccattat ccaacaaaca ctataaaaat 1860

gtttgaacaa ttggatttca aacattttcg ttttgtggag tggtgctcac caagtggtac 1920

agccctaagc aagtgaacac aaacacattt aagtgtattt tgtctgatta gatgttagcc 1980

agttatgcta tttcattcaa atgtctgaaa aaatcaattg actattccct tttcctaaag 2040

ggcagagaca gataatctca cttccagaga aatgacttgg agaaaaaaaa gtgttggtct 2100

ttttgctctt ttgtaattaa atccggatgt acctcaaaag acttaagact gtggtgataa 2160

gatgctttcc tcagcagaaa ggagggaaaa aaaacaactg gaactcaaag cttgaaattc 2220

tgtggcaaaa catgagatgt ccaggattgg aggttgaaaa gatttcacta cagtgttctg 2280

caatagttgg agcagataac tttcagtgta gccacagcca tggactccag atttccagat 2340

tttcaagacc tggacctgga acccgaaaga gcttgtcacg atgcggcagg aacactggag 2400

gtagattttt ttttattttt gaattttggg actgttgacc ttgctgtgag aaaagagaca 2460

acgactgagc aagcactacc accagcactg ttactgggaa ttagaagacc tgagtttctg 2520

tccagaccct cagtgcaaac tgaggatgct ccatccaaag tgaattatga tagcagactc 2580

cttgaaagca gggtccttgt ttagtgcatc tttgcccaca tacaccacaa catatcaaga 2640

tgcatttatt aggaaggagg agtttagaga gcaggctatc agaataacca ctcacctaca 2700

gacctggtac ctggattttt gcccgagatg attcctacca ccttactact gacgaagaca 2760

cccattccag tggaccactg tgacccagga ggcattcagc catcatgatg tggcctttac 2820

ctccactcct gtcttgttct acccagattc agcacagccc tttatagtga agtcagagtc 2880

ctcaagccaa atagctaaag ctgttttatc acaacaaagg cctagtttgt tccatgagtg 2940

tgcatttcat ttcttcagtt aaagccttca gagacacaca ataaatttgg accaggggat 3000

tttttagtta ttaatgctct ctgaagaaag gcaacatctt tttgagagca gcattggacc 3060

acaccccaca atctcaaatg attgaaattc atgaacatct aggatcccgt gaaggtcact 3120

ggaccctgtt ttttctactt caaatcctgt agtagcctac tgaatgagaa aacatattct 3180

gacccattgg gatcaaatca aaggcacagt gaactcctca tagcatcttc tttggaatta 3240

ctcaggaacc agaacttttt acacaaatgt aagaaattct accaaggagt ccccttacct 3300

aacagcatct cacaaggctg caccagattc cagaaaaggc ttctcttgat acatcaaggt 3360

agaacctcta tgcattttgt gaccgactta ttcttagatc attggttttc caaaggcttt 3420

gtggccatga agccctttga gtgaaaactg tgcagaagcc cagagtaaaa gtgaagctgc 3480

tctggatgaa gtagtgaagc aagagtaggg gcctgaatcc tgctacaact atcttccttt 3540

accaccgtgg tgacacctaa ggggacttcc ttacaacacc ttgaactctt ccgaacacag 3600

tttgaaaacc actgccccag acagcaatat gtttgacctg aatggcattc caatcttttc 3660

tgtacctcca ctcagcacag ttcatgttca gtagatgctg aacattctta gaaatactgt 3720

gtgtgaactt agaaaagtgc aagaagacag gcatgtcttt gaccccagga atgatcattt 3780

gctgaagatg gtgtcaagtg aacctagatt aacagccctc cactccagat ggatatccag 3840

tgattcctag aatgggatat agccagagaa caattctatg caccctacac tgacagactc 3900

ccttaagcaa caccagatgc tctactggta cttgaagtac atgactttga agtcttgacc 3960

ctccatgaat acctgaatta tcagcaagcg ggttttgaag ctggtgcctc attgaggcca 4020

tattagagca acttgtacat ttgacctctt gttatcagcc atggtactct acttcgtgtg 4080

caagagataa ctatgaaagc caaattcaaa tactggcaac atttcctaaa ggggctcaat 4140

atctatcatt cgtcttcttt tccaaactac acatcactgt atgactcaac cagtagcagt 4200

tatattgccc cttggttttt attcagttta actactgttt ccaagataaa tgagctaata 4260

agctttaaaa aaaaaaaaaa aaaaggctga attctttttt cttcatcact ggcatatctg 4320

cctattctcc agaattatta tgactattca gctcacttta acagttgaac ttcaagcgac 4380

aatctttgaa caccccttct catgtgattt aaaatgaaac catttggaaa agtttcttct 4440

agccagtaat agattttttt tttaattgct ctgccttgtg ccgagagatg ttcttttaag 4500

atgaatcttt tgatgtctga taccaccaaa tataggtggt agggagagtt ggaggctggc 4560

cctttgagca ggccattagc ttacttgctg ggcatttccg atagcttatt gcctaccttt 4620

ttgctggaaa caaactgatt tgaaaaacaa aatctatgaa gactgcagct aaggatttta 4680

tcggtagact taagagcttt tgtccttgtg gatattttag tggaaccaca tcagtctcaa 4740

tactgtcatt ttacactgac tcagagcagc tgacttcatt ccttgccatg atatatattt 4800

aaggcaggca ttgtaacaga cataaagaca acttatctgt ttcagcagga aggattcagt 4860

ttatgaactc tcagaccaga tcatgttgaa caaggagact ttgatgtgtg tcatgagaaa 4920

actcattctt tacttcccag tcaatttaaa ggccagctat cctgagctac tcgaatgaat 4980

gcactggtta aacattggaa atagtttgtt tatatccttg tctctctcta ggccaattgt 5040

gattacatga ctcgactcta catctcgtca aacaaggcct aggtctggtt gctgtagact 5100

gctcgccctc aacaaataaa atctggttga ctagcctcct tgtatataca actattattt 5160

gttaagaaga aattatcgtc aattttctac taccttccaa ttgtcagctc tttttttcct 5220

ctctggtttt tcctatactt tacagaaaaa gacattgatc tatactgcca ttccctctaa 5280

tcctgccata ctcagtcaaa aggaatgact taagatgaag atgatcatct gctcgagtct 5340

aaaatataca ttgtatataa gaattggtga ttagaaaagc aaaaaaccta aaacttaaat 5400

ctaggagtct gtatactgtc tccatgtctc catgcctcag atctcatcta aatctttgaa 5460

cagcaccatt caaccaatct gaggccttga cttgcttgta agatgattct cagagatcgg 5520

ctgagttaaa aaagatgacg acttgattac caaagaaagt agggccaact ttgacaaatc 5580

tggctctgct gaccctgtca ctcccagatg tagcatagac tcctaaacag aacctcaagt 5640

ctgattgagg ataaggcctt ctcctgagct gaaagttctt tggcagatga gcaagaaact 5700

gaaagctgat gtacctgact ggctctgtaa gatcagaaaa ctgtatccag aataagccct 5760

atggattaac ccctgagtac ccagagtaaa aactaattta cagaacttcc ttattgatct 5820

gctggttctt ccagatcata ttctggctat tggtatggct ggcctttctg aaggtaccct 5880

gcttgtctat tttcctgact cagctcttgc ctgccttttt cacatgttgc tgcaattaga 5940

ctcaccgtga ggactacagt caatttcagt ctatcttgtg cccaatacaa caaggatttt 6000

taatagtaac aacccacacc tcacccacta ggactcaatg ttcacaacag gaaggaccat 6060

tgctgcatac tccttgacca gcaacttttt tgaagatatt tttaagtgca gagtaggcct 6120

ctattcctgt atgtaattgt tcattttcag cacctggaac ctcatctatc gggtctggaa 6180

ggaatacagc agttcgaaag ccgcgtccat ttctctcctt cagtagtgca gaaatgagtc 6240

cgattcacca gtacacacag aactgtacca gttcaaccta gcaaaagaag aaaagtttcc 6300

actgtactta aaatttacag ctgactcaaa ttgcctcaca gaattatttg atgtagaagg 6360

ctagttgtct tacttcagat cagcaggaca gttgggctct cagactcatg accactgagt 6420

ttgcttgtgt tgaaactgtg gtttcatcca acatatgcta ttggacatga ttattattcc 6480

attcaaatgg attacagact tcttgaggac aggacaaact tatctctcat ggtgtttttt 6540

tagaatactt ttataaccaa ggaagaaacc atgccagctg ttaccattca acttcttaag 6600

cagagattaa gctttttcat atctgttctt atcctggaca tcagtagttt ttaattgccc 6660

agcatccgtt ccatcttgta acaactccct gatgtttctt aaaaccacct cttcctattt 6720

tcagtctgtg gtttggacag tctgacccaa ccttgagctt tgtgggtgaa catgtaattc 6780

agacctcatc aatcagcaaa tccatctgaa ctgtggagga gaagctctct ttactgaggg 6840

tgctttagct ttgtaggatg aaaacctcaa actaacaggg cctaccatgt agagaatgaa 6900

gccagtgcag gggaaagcag agccaaaata tggagagact tgaatcctga tgacagcgtt 6960

tgtgcccctg gatccaaccg tgcctgaagc tagaatatcc cctggacttt tcagttatgt 7020

gaaccaataa ataccctttt ttgcttaagt tactttgagt tgggtttctg ttacttgaaa 7080

ttgaatccac actaatatat ctaccaacat tgagacttga cagatccaag tatttattaa 7140

gctagaggtc atggtcactg aaattacttt ccaaagtgga agacaaaatg aaacaggaac 7200

tgagggaata tttaagatcc cacagaagcg taaaaatgac atggtagaaa gtaatagaaa 7260

acctaaatgt ctgtcattaa aggataggtt aaggtgtggt tcagccatat aggaatatct 7320

cgtatctgtt aaaatgaata aagtacattc attgtgtatg gaaaaatggc catgatacat 7380

taggtgaaac aagttattaa tagaaaagtg tacagtgtga actcatttta aaatgtgtgt 7440

gcttatgttt ataaatgcat agaaaggtct attcacagct ttctttgaac agtgtagatc 7500

acatgaaact ttcaacttta tacatttctg tattaatatt ttacactacc cacattattt 7560

ttaaacttta ttttaaataa agaattttta aaattaaa 7598

<210> 2

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcuuggcuuc uauucugaau ccuuu 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tagcagttcc ccaatccttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cacaaattcc catcattccc 20