本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種納米-雙環(huán)狀適配體探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤因其發(fā)生率高、危害性大、難以治愈、疾病癥狀嚴(yán)重影響生存質(zhì)量、且治療費(fèi)用昂貴等特點(diǎn)，已經(jīng)成為目前人類急需攻克的一大類疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織最近公布的統(tǒng)計(jì)資料顯示，目前全世界癌癥患者約達(dá)1400萬，每年新發(fā)病人數(shù)約700萬，每年約有500萬人死于癌癥，也就是說，約每6秒鐘就有1人死于癌癥。同時，中國國家癌癥登記中心（NCCR)發(fā)布的2015年中國癌癥的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)也顯示出，2015 年中國預(yù)計(jì)有429.2 萬例新增癌癥病例和 281.4萬例癌癥死亡病例。

在癌癥的眾多分型中，血癌，也叫做白血病，作為臨床上較為常見的血液惡性疾病，也是最為多發(fā)的腫瘤之一。據(jù)報(bào)道，我國各地區(qū)血癌的發(fā)病率在各種腫瘤中占第六位。

作為一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，克隆性血癌細(xì)胞主要表現(xiàn)為通過增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等，通過在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他非造血組織和器官，同時抑制正常造血功能來影響人的健康。主要癥狀包括發(fā)熱、炎癥以及出血等，但因?yàn)檠┚哂袠O高的異質(zhì)性，所以患者病情的臨床表現(xiàn)也是多樣化的,在診斷中主訴癥狀有較大差異,進(jìn)而易引起漏診或誤診,而延誤患者的治療。雖然近年來,隨著細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)及免疫學(xué)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，血癌的臨床確診率得到大幅提升。對于典型血癌，因其具有特殊的形態(tài)學(xué)特點(diǎn),通?？赏ㄟ^血常規(guī)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)予以確診。但對于不具典型的血癌，則因發(fā)病較為特殊,臨床表現(xiàn)多樣而又復(fù)雜,所以要實(shí)現(xiàn)即時準(zhǔn)確的診斷有較大難度。有報(bào)道稱,血癌的臨床誤診率高達(dá)25%。并且由于分型和預(yù)后分層復(fù)雜，在血癌的治療方案上，并沒有一個統(tǒng)一化的治療方法，而是需要結(jié)合細(xì)致的分型和預(yù)后分層制定治療方案。目前主要幾類治療方法為，化學(xué)治療﹑放射治療﹑靶向治療、免疫治療、干細(xì)胞移植等。

綜上所述，開發(fā)一種基于靶向診療于一體的、高靈敏度并且高特異性診斷血癌的探針意義重大。

對于靶向識別腫瘤細(xì)胞，適配體探針作為能夠特異性和腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物相結(jié)合的一段單鏈寡核苷酸DNA，就是一項(xiàng)非常好的新型的技術(shù)，其具有分子量小，穩(wěn)定性好，低毒性并且檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛用于對體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的檢測研究。但由于環(huán)境中大量核酸酶的存在，線性適配體會發(fā)生降解。如人們熟知的T4 DNA聚合酶就具有單鏈DNA特異性的3'到5'端的外切酶活性。而環(huán)狀DNA獨(dú)特的閉合結(jié)構(gòu)賦予其缺乏酶識別端口的特點(diǎn)，因此可以避免被DNA剪切酶的識別，從而免于酶解，而最終維持穩(wěn)定性。同樣，利用DNA的堿基互補(bǔ)配對原理，來控制DNA二級結(jié)構(gòu)的研究在核酸領(lǐng)域也有報(bào)道。

另一方面，在納米技術(shù)這一相對成熟的研究領(lǐng)域，有報(bào)道表明，適配體探針和納米材料相結(jié)合能夠提升其特異性，并且，納米材料作為性能良好的小體積容器，具有同時承載多個元件的特點(diǎn)，可以為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

基于上述研究背景，本發(fā)明根據(jù)線性適配體探針易降解這一缺陷，提出了環(huán)狀適配體的概念，將一段已經(jīng)篩選到的能夠特異性識別血癌細(xì)胞株Rccf-CEM的線性適配體探針進(jìn)行閉環(huán)結(jié)構(gòu)改造，利用其獨(dú)特的雙環(huán)雜交結(jié)構(gòu)使得其在形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)從而隱藏端口的同時，也能夠控制二級結(jié)構(gòu)，使其功能段的序列暴露出來，進(jìn)而維持了特異性。然后，將上述雙環(huán)適配體探針和修飾有羧基的納米材料PAMAM-G4.5相結(jié)合，以進(jìn)一步增強(qiáng)其特異性，并為下一步連接更多原件和有效抑制被捕獲細(xì)胞的活性提供可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，是提供一種極其穩(wěn)定的納米-雙環(huán)狀適配體探針，并用于血癌細(xì)胞的特異性檢測和活性抑制。

為解決上述技術(shù)問題本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下：

一種極其穩(wěn)定的納米-雙環(huán)狀適配體探針（G-dApR），它以由羧基修飾的樹枝狀納米PAMAM分子，與FAM基團(tuán)和biotion基團(tuán)修飾的具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀適配體探針（dApR）通過streptavidin抗體相結(jié)合所組成；

其中，環(huán)狀適配體探針dApR的合成，是由堿基數(shù)目不同的一個單環(huán)狀適配體和一個單環(huán)狀寡核苷酸雜交互補(bǔ)得到的，同時包含賦予探針特異性的功能區(qū)和改善探針穩(wěn)定性的雙環(huán)DNA區(qū)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

其中，單環(huán)狀適配體和單環(huán)狀寡核苷酸均由與之相對應(yīng)的線性單鏈DNA閉環(huán)反應(yīng)得到：

線性單鏈DNA包括線性適配體鏈（Ap）和線性寡核苷酸鏈(C1)。

其中，所述的線性適配體鏈（Ap）為：

5'-GGTTAGATTTCTAGACTCATAT(biotin)AGCTCAATCAATCTACGACTCGAT（FAM）C TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTAC-3'；

線性適配體鏈閉環(huán)所需要的模板（T- Ap）為：

5'-GTC TAG AAA TCT AAC CGT ACA GTA TTT TCC-3'；

其中，線性寡核苷酸鏈(C1)為：

5'- AGCTATATGAGTCTA GGTCGT AGATTGATTG -3'；

所述的線性寡核苷酸鏈閉環(huán)所需要的模板（T-C1）為：

5'- ATA TAG CTC AAT CAA T -3'。

其中，上述具有高特異性的線性適配體鏈（Ap）的設(shè)計(jì)是基于Cell-SELEX技術(shù)，以血癌細(xì)胞Rccf-CEM細(xì)胞表面高表達(dá)的蛋白PTK7為識別靶標(biāo)，并借助序列結(jié)構(gòu)分析的權(quán)威科研軟件(http://mfold.rna.albany.edu/)設(shè)計(jì)的；

并且，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，設(shè)計(jì)可使線性適配體探針Ap閉環(huán)的模板寡核苷酸T- Ap、可與閉環(huán)后的Ap部分序列互補(bǔ)配對形成雙環(huán)結(jié)構(gòu)的小環(huán)的線性寡核苷酸C1、以及C1閉環(huán)所需模板T-C1，其中，T- Ap和Ap的3’端和5’端兩個端口的部分序列互補(bǔ)，C1和T-C1的3’端和5’端兩個端口的部分序列互補(bǔ)，C1和部分Ap部分序列互補(bǔ)，并且，Ap含有Biotin和FAM兩個基團(tuán)；

上述納米-雙環(huán)狀適配體探針的制備方法包括具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀適配體探針（dApR）的合成，以及將具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀適配體探針（dApR）和納米材料PAMAM相結(jié)合兩大步驟：

其中，所述具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀適配體探針dApR的合成方法，包括如下步驟：

（1）將線性適配體 Ap或線性寡核苷酸C1（10nM）加入到含有其1/3體積的 ATP 和1/2體積的Polynucleotide Kinase（T4 PNK）酶的緩沖液體系中，用dd H₂O稀釋十倍后，置于37℃金屬浴中，震蕩反應(yīng)30 min后，90℃退火5min，降至室溫，得到磷酸化的Ap或C1；

（2）將T- Ap或T-C1（10nM）按照Ap和T- Ap或C1和T-C1的反應(yīng)摩爾比為1：1.3的比例分別加入到步驟（1）得到的溶液中，并加入步驟（1）Ap或C1體積的2倍的10×Ligase Buffer 及4倍體積的dd H₂O ，混勻，置于恒溫金屬浴中90℃退火5min后，55 ℃振蕩反應(yīng)2 h，待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后，加入步驟（1）Ap或C1體積的1/3體積T4 DNA Ligase ，于金屬浴中16 ℃反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后，65℃失活10min，降至室溫，得到Ap和T- Ap或C1和T-C1相雜交互補(bǔ)而形成的環(huán)狀DNA；

（3）向步驟（2）得到的體系中分別加入步驟（1）Ap或C1體積的6倍體積的dd H₂O 、4倍體積的10×T4 DNA Polymerase Buffer、1/3體積的及T4 DNA Polymerase，混勻后于恒溫金屬浴中37℃振蕩反應(yīng)16 h，結(jié)束后85 ℃失活10 min，降至室溫，得到單鏈的環(huán)狀適配體ApR或單鏈環(huán)狀寡核苷酸C1；

（4）向上述體系中分別加入其體積1/10的3 M醋酸鈉溶液（20 μL）和其體積2.5倍無水乙醇（500 μL），充分混勻后，豎直于-20 ℃放置1 h，結(jié)束后離心棄去上清，保留底部沉淀。沉淀用500 μL 的70% 乙醇（-20℃）打散，于4℃離心棄去上清，保留底部沉淀，將產(chǎn)物干燥。得到純化后的單鏈的環(huán)狀適配體ApR或單鏈環(huán)狀寡核苷酸C1。

（5）將步驟（4）得到的堿基數(shù)目較多的單鏈的環(huán)狀適配體ApR和堿基數(shù)目較少的單鏈環(huán)狀寡核苷酸C1進(jìn)行互補(bǔ)雜交，得到含功能區(qū)（特異性）和雙環(huán)DNA區(qū)（穩(wěn)定性）的適配體探針dApR。

其中，所述的納米-雙鏈環(huán)狀適配體探針G-dApR制備方法，包括如下步驟：

（1）取末端為128個羧基的4.5代聚酰胺-胺型樹枝狀分子（G4.5）溶于 dd H2O中，并按照10倍于G4.5 的摩爾比例加入過量EDC、NHS后，溫和攪拌活化反應(yīng)2 h。將上述反應(yīng)得到的體系置于10,000 MWCO透析袋中，透析24h，得到末端羧基活化的G4.5溶液；

（2）向步驟（1）得到的溶液中加入鏈霉親和素（Stre），溫和攪拌反應(yīng)過夜，次日加入環(huán)狀結(jié)構(gòu)適配體探針dApR，溫和攪拌反應(yīng)2 h，G4.5、dApR和Stre的摩爾比（2-4）：（2-4）：1。反應(yīng)結(jié)束后，用50,000超濾管離心，最終得到G-dApR納米-適配體探針。

制備得到的納米-雙環(huán)狀適配體探針可用于特異性捕獲高表達(dá)腫瘤標(biāo)志物蛋白PTK7的血癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)可視化檢測，并且能有效抑制被捕獲細(xì)胞的活性。

其中，將目標(biāo)腫瘤細(xì)胞Rccf-CEM分別與上述的線性適配體Ap、具有雙環(huán)狀結(jié)構(gòu)的適配體探針dApR、以及納米-雙鏈環(huán)狀適配體探針G-dApR共孵育，探針的和靶蛋白相結(jié)合則使得被識別的細(xì)胞具有熒光信號，以此判斷G-dApR捕獲識別目標(biāo)血癌細(xì)胞的水平。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提出的將常規(guī)的線性適配體探針改造成具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的適配體探針，在序列不發(fā)生改變的情況下，適當(dāng)控制適配體的二級結(jié)構(gòu)：首先，形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以有效躲避多種酶的降解；其次，雙環(huán)結(jié)構(gòu)的存在限制了功能功能段序列和非功能段的自身折疊等可能，進(jìn)一步提高穩(wěn)定性的同時，更維持甚至提升了探針的特異性。除此之外，本發(fā)明將適配體探針和納米材料相結(jié)合的實(shí)踐，不僅改善了探針的特異性，更有效抑制了被捕獲血癌細(xì)胞的活性。

綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：G-dApR探針具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.特異性強(qiáng)；2.穩(wěn)定性好：3.有效抑制被捕獲到的血癌細(xì)胞的活性。本發(fā)明在大大改善穩(wěn)定性的同時實(shí)現(xiàn)高特異性捕獲血癌細(xì)胞并抑制其活性，在血癌的診斷和治療中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，有望于突破血癌臨床診斷難的技術(shù)瓶頸。

附圖說明

圖1：為本發(fā)明所述的單環(huán)狀DNA閉環(huán)反應(yīng)電泳驗(yàn)證結(jié)果圖。圖中：1泳道為：Ap；2泳道為：ApR；3泳道為：線性C1；4泳道為：環(huán)狀C1。

圖2：為本發(fā)明所述的具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的的探針閉環(huán)的電泳驗(yàn)證結(jié)果。圖中：1泳道為：Ap；2泳道為：ApR；3泳道為：具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的適配體探針dApR。

圖3：為本發(fā)明的探針構(gòu)建過程中得到的幾個改造結(jié)構(gòu)后的環(huán)狀適配體探針和陰性對照相比對目標(biāo)血癌細(xì)胞的特異性捕獲的能力的流式驗(yàn)證結(jié)果圖。

圖4：為驗(yàn)證本發(fā)明所述的納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR是否構(gòu)建成功的電泳檢測結(jié)果圖。圖中：Maker泳道的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（Low Molecular Weight DNA Ladder）；1泳道為：dApR；2泳道為：G-dApR。

圖5：為激光共聚焦顯微鏡下三個不同通道模式下觀察到的納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR的形態(tài)。其中，Photo為明場模式下拍攝到的圖像，F(xiàn)AM為明場同一視野和焦距下FAM通道所拍攝的圖像，代表探針中熒光基團(tuán)FAM被激發(fā)后所發(fā)射出的熒光，Merge代表上述兩個通道的疊加。

圖6：為本發(fā)明所述的納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR的Zeta電位檢測結(jié)果，其中樣本1、2、3分別代表G、dApR和G-dApR。

圖7：為本發(fā)明所述的納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR在三個不同PH值緩沖液環(huán)境中放置不同時間后檢測到的其中G-dApR的殘余量（% G-dApR ramaining）所繪制的柱狀結(jié)果圖；

圖8：為本發(fā)明所述的納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR分別與目標(biāo)細(xì)胞Rccf-CEM和非目標(biāo)細(xì)胞Ramos共孵育后用激光共聚焦顯微鏡檢測觀察其于目標(biāo)細(xì)胞特異性結(jié)合的結(jié)果圖。圖中：分別展示了在相同拍攝條件的得到的DAPI通道、FAM通道，以及代表上述兩個通道相疊加的圖像。

圖9：為不同濃度的本發(fā)明所述的納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR，與目標(biāo)細(xì)胞Rccf-CEM和非目標(biāo)細(xì)胞Ramos共培養(yǎng)24h后，用MTT檢測法得到的，G-dApR對目標(biāo)細(xì)胞以及非目標(biāo)細(xì)胞的活性抑制的程度的柱形圖。

圖10：為不同濃度的本發(fā)明所述的納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR、以及本發(fā)明所用的納米材料G與目標(biāo)細(xì)胞Rccf-CEM和非目標(biāo)細(xì)胞Ramos共培養(yǎng)24h后，用AO/EB染色法處理后的細(xì)胞在熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果圖，反映G-dApR促使目標(biāo)細(xì)胞和非目標(biāo)細(xì)胞凋亡的程度。

圖11：為本發(fā)明所述的納米-雙鏈環(huán)狀適配體探針G-dApR，在用裸鼠構(gòu)建的模擬的體內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞條件下對其檢測結(jié)果。其中Photo代表在明場模式下拍攝到的圖像，Hochest以及FAM通道分別代表和明場模式相同拍攝條件、這兩種熒光檢測模式下，拍攝到的照片。Merge1代表Hochest和FAM兩個通道圖像的疊加，Merge2代表Photo、Hochest以及FAM三個通道下的圖像疊加。

圖12雙環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀適配體探針dApR的合成示意圖。

圖13納米-雙鏈環(huán)狀適配體探針G-dApR的合成示意圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1：線性適配體的設(shè)計(jì)

以目標(biāo)血癌細(xì)胞RccF-CEM細(xì)胞膜表面高表達(dá)的腫瘤生物標(biāo)記物蛋白PTK7為模板，基于Cell-SELEX技術(shù)，設(shè)計(jì)可與PTK7蛋白高特異性結(jié)合的適線性配體Ap；

依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，設(shè)計(jì)可使線性Ap閉環(huán)的模板T-Ap、可與閉環(huán)后的Ap部分序列互補(bǔ)配對形成雙環(huán)結(jié)構(gòu)的小環(huán)的線性C1、以及C1閉環(huán)所需模板T-C1，其中，T-Ap和Ap的3’端和5’端兩個端口的部分序列互補(bǔ)，C1和T-C1的3’端和5’端兩個端口的部分序列互補(bǔ)，C1和部分Ap部分序列互補(bǔ)，并且，Ap含有Biotin和FAM兩個基團(tuán)。

所用到的引物序列如下：

其中，線性適配體鏈（Ap）為：

5'-GGTTAGATTTCTAGACTCATAT(biotin)AGCTCAATCAATCTACGACTCGAT（FAM）C TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTAC-3'；

線性適配體鏈閉環(huán)所需要的模板（T-Ap）為：

5'-GTC TAG AAA TCT AAC CGT ACA GTA TTT TCC-3'；

其中，線性寡核苷酸鏈(C1)為：

5'- AGCTATATGAGTCTA GGTCGT AGATTGATTG -3'；

所述的線性寡核苷酸鏈閉環(huán)所需要的模板（T-C1）為：

5'- ATA TAG CTC AAT CAA T -3'。

實(shí)施例2：將線性適配體改造為具有功能區(qū)和雙環(huán)區(qū)的適配體探針

將稀釋為10μM的Ap經(jīng)形單環(huán)成環(huán)反應(yīng)。反應(yīng)步驟為：（1）于恒溫金屬浴37℃中振蕩反應(yīng)30 min進(jìn)行磷酸化反應(yīng)；（2）55 ℃振蕩反應(yīng)2 h進(jìn)行l(wèi)igase連接反應(yīng)；（3）去模板；（4）產(chǎn)物純化，；最終得到單一的、閉合環(huán)狀A(yù)pR，按照同法得到C1，并且C1的較ApR小。然后將ApR和C1進(jìn)行互補(bǔ)雜交，得到具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域的適配體探針。

具體包括如下步驟：

（1）將線性適配體 Ap或線性寡核苷酸C1（10nM）加入到含有其1/3體積的 ATP 和1/2體積的Polynucleotide Kinase（T4 PNK）酶的緩沖液體系中，用dd H₂O稀釋十倍后，置于37℃金屬浴中，震蕩反應(yīng)30 min后，90℃退火5min，降至室溫，得到磷酸化的Ap或C1；

（2）將T- Ap或T-C1（10nM）按照Ap和T- Ap或C1和T-C1的反應(yīng)摩爾比為1：1.3的比例分別加入到步驟（1）得到的溶液中，并加入步驟（1）Ap或C1體積的2倍的10×Ligase Buffer 及4倍體積的dd H₂O ，混勻，置于恒溫金屬浴中90℃退火5min后，55 ℃振蕩反應(yīng)2 h，待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后，加入T4 DNA Ligase ，于金屬浴中16 ℃反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后，65℃失活10min，降至室溫，得到Ap和T- Ap或C1和T-C1相雜交互補(bǔ)而形成的環(huán)狀DNA；（3）向步驟（2）得到的體系中分別加入步驟（1）Ap或C1體積的6倍體積的dd H₂O 、4倍體積的10×T4 DNA Polymerase Buffer、1/3體積的及T4 DNA Polymerase，混勻后于恒溫金屬浴中37℃振蕩反應(yīng)16 h，結(jié)束后85 ℃失活10 min，降至室溫，得到單鏈的環(huán)狀適配體ApR或單鏈環(huán)狀寡核苷酸C1；

（4）向步驟（3）獲得的體系中分別加入其體積1/10的3 M醋酸鈉溶液（20 μL）和2.5倍體積無水乙醇（500 μL），充分混勻后，豎直于-20 ℃放置1 h，結(jié)束后離心棄去上清，保留底部沉淀。沉淀用500 μL 的70% 乙醇（-20℃）打散，于4℃離心棄去上清，保留底部沉淀，將產(chǎn)物干燥。得到純化后的單鏈的環(huán)狀適配體ApR或單鏈環(huán)狀寡核苷酸C1。

（5）將步驟（4）得到的堿基數(shù)目較多的單鏈的環(huán)狀適配體ApR和堿基數(shù)目較少的單鏈環(huán)狀寡核苷酸C1進(jìn)行互補(bǔ)雜交，得到含功能區(qū)（特異性）和雙環(huán)DNA區(qū)（穩(wěn)定性）的適配體探針dApR。

實(shí)施例3：變性膠電泳驗(yàn)證具有功能區(qū)和雙環(huán)區(qū)的適配體探針構(gòu)建成功

第一部分為采用變性膠電泳技術(shù)驗(yàn)證單環(huán)閉環(huán)產(chǎn)物的成功合成，首先，制備10% 變性大塊凝膠（Urea-PAGE），將合成的單環(huán)狀適配體ApR和用于雙環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)建的內(nèi)環(huán)C1，以及與之相對應(yīng)的線性單鏈DNA，在相同條件下，經(jīng)行變性膠電泳，根據(jù)環(huán)狀DNA的泳動速度相對于線性DNA較慢的定論來驗(yàn)證單環(huán)狀適配體的構(gòu)建工作是否成功。如圖1所示，環(huán)狀DNA的條帶明顯高于線性DNA的，說明泳動速度更慢，證明單環(huán)狀DNA的成功構(gòu)建。

第二部分，在驗(yàn)證單環(huán)閉環(huán)合成成功之后，以第一部分相同的方法來驗(yàn)證雙環(huán)適配體的構(gòu)建工作是否成功。如圖2所示，具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的dApR的條帶一次高于單環(huán)狀的ApR、和線性適配體Ap，證明具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的適配體探針的成功構(gòu)建。

實(shí)施例4:用流式細(xì)胞儀考察雙環(huán)狀適配體探針特異性捕獲目標(biāo)細(xì)胞的能力

為了驗(yàn)證經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造的適配體仍然具有特異性識別捕獲目標(biāo)腫瘤細(xì)胞的能力，采用流式細(xì)胞術(shù)的方法，來觀察將環(huán)狀適配體探針和目標(biāo)細(xì)胞共孵育后的細(xì)胞被捕獲的情況。

具體方法為：于常規(guī)條件下培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞懸浮株Rccf-CEM，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，取約8×10⁵個細(xì)胞加入到200 μL結(jié)合緩沖液（由含有20% FBS和0.1 mg/mL yeast tRNA的PBS組成），而后，在避光條件下，分別加入5 μL線性適配體Ap、單環(huán)適配體ApR和雙環(huán)適配體dApR（10 μM），充分混勻，于37 °C孵育過夜。將上述適配體與細(xì)胞孵育液，1000 g離心10 min，棄上清留細(xì)胞沉淀。加入新鮮1 mL PBS，再次1000 g離心10 min，目的是去除未與細(xì)胞結(jié)合的游離適配體。同樣步驟重復(fù)兩次后，加入500 μL PBS懸浮細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀測試。

結(jié)果如圖3所示，與對照相比，Ap、ApR、與dApR結(jié)合Rccf-CEM 后的熒光強(qiáng)度均有明顯增加，其中dApR的熒光強(qiáng)度最高，ApR和Ap的熒光強(qiáng)度相當(dāng)，結(jié)果表明環(huán)狀適配體均能特異性識別目標(biāo)細(xì)胞，其中具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的dApR的特異性最強(qiáng)。

實(shí)施例5：納米-雙環(huán)狀適配體探針的制備

首先，稱取3g末端為128個羧基的第4.5代聚酰胺-胺型高分子（G4.5 PAMAM dendrimers，本發(fā)明中簡稱G），用N-羥基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）和1-（3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）對其末端羧基進(jìn)行活化反應(yīng)反應(yīng)2 h，置于10,000 MWCO透析袋中，透析24h，然后加入0.2 nmoL的Stre，溫和攪拌反應(yīng)過夜，次日加入0.4 nmoL實(shí)施例2獲得的雙環(huán)適配體dApR，溫和攪拌反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用50,000超濾管于低速離心機(jī)3500 g，離心10 min，重復(fù)離心兩次，最終得到納米-雙鏈環(huán)狀適配體探針G-dApR。

實(shí)施例6:聯(lián)合電泳檢測、激光共聚焦顯微鏡觀察、以及Zata電位檢測等技術(shù)手段來確定納米-雙環(huán)狀適配體探針構(gòu)建成功

為了驗(yàn)證本納米-雙鏈環(huán)狀適配體探針的成功構(gòu)建，采用了多種手段來對所得產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行表征。根據(jù)納米-雙鏈環(huán)狀適配體探針G-dApR與其構(gòu)成部分適配體探針dApR以及納米材料G的多處理化性質(zhì)差異，其中包括：（1）dApR以及G的分子量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于G-dApR的分子量；（2）G-dApR以及dApR具有熒光基團(tuán)FAM而G沒有；（3）G的Zata電位為正值，而dApR以及G-dApR為負(fù)值，等等。根據(jù)上述差異，采用的方法分別為變性膠電泳手段、激光共聚焦顯微鏡下成像觀察的手段，以及zata電位檢測的手段，來檢測G-dApR是否成功構(gòu)建。

如圖4所示，表示G-dApR的條帶位置在電泳泳道口的位置，表明起分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dApR，；如圖5所示，可以看到G-dApR具有FAM基團(tuán)的吸收特性；如圖6所示，G-dApR的Zata值為負(fù)值。上述結(jié)果均符合G-dApR應(yīng)該具有的特性。證明納米-雙鏈環(huán)狀適配體探針G-dApR構(gòu)建成功。

實(shí)施例7：在不同PH值緩沖液條件下考察納米-雙鏈環(huán)狀適配體探針的穩(wěn)定性

取等量G-dApR，置于事先制備好的相同體積的PH值分別為9.0、7.0、4.0的三種磷酸鹽緩沖液緩沖液中，同樣條件下，在室溫溫度放置，分別在第0、1、2、3、4、5、6天的相同時間點(diǎn)檢測各緩沖液中G-dApR的含量。如圖7所示，隨著時間的變化，在不同PH環(huán)境下放置一周時間內(nèi)G-dApR無明顯降解，說明穩(wěn)定性良好。

實(shí)施例8：用激光共聚焦顯微鏡下觀察納米-雙環(huán)狀適配體探針和目標(biāo)血癌細(xì)胞的特異性結(jié)合

為了檢測納米-雙環(huán)狀適配體探針特異性捕獲目標(biāo)腫瘤細(xì)胞的能力，本發(fā)明采用了激光共聚焦顯微鏡的方法觀察的手段。

具體方法為：于常規(guī)條件下培養(yǎng)本發(fā)明所需目標(biāo)腫瘤細(xì)胞，懸浮細(xì)胞株CCRF-CEM，以及也可作為陰性對照的不表達(dá)腫瘤標(biāo)志物PTK7蛋白的懸浮細(xì)胞株Ramos，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，按照每個實(shí)驗(yàn)組10⁵個細(xì)胞的量，取相應(yīng)細(xì)胞，用無菌PBS洗滌干凈后，置于經(jīng)過滅菌的500微升EP管中，并與1% BSA封閉液溶液作用30 min，離心棄掉封閉液并用無菌PBS清洗干凈后，按照每樣品500 μL的量，向樣品加入孵育液，之后分別向各實(shí)驗(yàn)組加入5 μL G-dApR（10 μM）；于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)1 h 后，洗滌除去未結(jié)合的探針G-dApR，用4%多聚甲醛在常溫條件下固定細(xì)胞，固定時間為15min，最后棄去甲醛并清洗干凈，然后用DAPI染色液避光標(biāo)記細(xì)胞核15 min；用PBS反復(fù)洗滌后，取出一點(diǎn)細(xì)胞懸液，滴加到激光共聚焦專用小皿上，并覆蓋上載玻片使形成均勻的單細(xì)胞層。

如圖9所示，本納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR和不表達(dá)把蛋白PTK7的陰性對照細(xì)胞Ramos無特異性結(jié)合，而表達(dá)把蛋白PTK7目標(biāo)腫瘤細(xì)胞CCRF-CEM的識別和捕獲性能良好。

實(shí)施例9：MTT法檢測納米-雙環(huán)狀適配體探針對血癌細(xì)胞存活率的影響

本發(fā)明也采用MTT了法檢測細(xì)胞活性的方法，來反應(yīng)納米-雙鏈環(huán)狀適配體探針G-dApR對目標(biāo)腫瘤細(xì)胞活性的調(diào)控。

具體方法為取處于對數(shù)生長期的CCRF-CEM和Ramos細(xì)胞株，經(jīng)過計(jì)數(shù)后，以10⁴個細(xì)胞/孔的量，分別懸浮于事先制得的，含有G-dApR濃度不同的無菌的培養(yǎng)基和細(xì)胞混合，并接種到96孔板中，置于5% CO₂或無CO₂培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，離心棄掉含探針的培養(yǎng)基，于每孔中加入100 μL無血清、無酚紅的1640培養(yǎng)基，并于每孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄各孔上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩搖勻10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶全部溶解，用酶標(biāo)儀（570 nm）測定各孔光吸收值（OD值），并計(jì)算納米-雙鏈環(huán)狀適配體探針G-dApR對不同細(xì)胞的抑制率：抑制率（%）=（1-探針組平均OD值/空白對照組的平均OD值）×100%。

如圖10所示，G-dApR對目標(biāo)血癌細(xì)胞CCRF-CEM的活性有輕微的抑制作用。說明本發(fā)明能夠下調(diào)目標(biāo)血癌細(xì)胞的活性。

實(shí)施例10:AO/EB染色法觀察納米-雙環(huán)狀適配體探針促使目標(biāo)血癌細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10⁵個/mL，按1.5 mL/孔接種六孔培養(yǎng)板，其中每孔加入不同濃度的G-dApR，共培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞并洗滌3次，用100~500 μL PBS懸浮細(xì)胞，并調(diào)整濃度為1×10⁵個/mL；然后加入1 μL AO/EB染色液，混勻后于室溫避光孵育15 min后，將少量染色后的細(xì)胞懸液滴加到載玻片上，并蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡的GFP模塊（λex 510 nm）下觀察拍照。

如圖11所示，隨著探針濃度的增加，目標(biāo)腫瘤細(xì)胞CCRF-CEM細(xì)胞所呈現(xiàn)的顏色為逐漸產(chǎn)生黃綠色的代表凋亡的顏色，而非目標(biāo)細(xì)胞Ramos則無明顯變化，說明本發(fā)明能夠下調(diào)目標(biāo)血癌細(xì)胞的活性。

實(shí)施例11:模擬體內(nèi)條件下對血癌細(xì)胞的檢測

為了進(jìn)一步評估納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR在動物體內(nèi)，動態(tài)條件下捕獲血癌細(xì)胞的能力，構(gòu)建了體內(nèi)含有血癌細(xì)胞的裸鼠模型來模擬臨床腫瘤病人的體內(nèi)環(huán)境。

具體方法為：首先用Hoechst 33258將目標(biāo)血癌細(xì)胞CCRF-CEM染色15 min后，靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，而后將納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR注射到裸鼠體內(nèi)30 min后，抽取裸鼠的血液，裂解紅細(xì)胞并離心分離得到WBCs和目標(biāo)血癌細(xì)胞并進(jìn)行PBS洗滌，而后進(jìn)行共聚焦顯微鏡分析。

如圖12所示，其中因?yàn)槲磳BCs 進(jìn)行熒光標(biāo)記，故只有在明場下才能觀察到它們，呈現(xiàn)亮灰色圓球狀形態(tài)（Photo）；藍(lán)色（Hoechst）代表血癌細(xì)胞的細(xì)胞核；綠色（FAM）代表G-dApR與血癌細(xì)胞的結(jié)合；Merge1是藍(lán)色、綠色疊加，其代表G-dApR與CTCs的結(jié)合；Merge2是明場、藍(lán)色、綠色和明場三個通道疊加。由此，從圖中Merge 2可看出，G-dApR可以特異性地捕獲裸鼠體內(nèi)的血癌細(xì)胞，而對WBCs無任何識別能力。證明本發(fā)明對目標(biāo)血癌細(xì)胞的特異性即使在體內(nèi)環(huán)境下也能得以維持。

綜上所述，本發(fā)明可以所構(gòu)建的納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR具有良好穩(wěn)定性，可特異性捕獲目標(biāo)血癌細(xì)胞，并且有效抑制其活性。有望于運(yùn)用到血癌病的臨床診斷，并把靶向地抑制血癌細(xì)胞的活性，達(dá)到診療于一體化的目的。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大學(xué)

<120> 一種納米-雙環(huán)狀適配體探針及其應(yīng)用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggttagattt ctagactcat atagctcaat caatctacga ctcgatctaa ctgctgcgcc 60

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<212> DNA

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gtctagaaat ctaaccgtac agtattttcc 30

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 4

atatagctca atcaat 16