本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種組合物、其應(yīng)用以及含有該組合物的試劑盒。
背景技術(shù)：
：乙型病毒性肝炎(hepatitisB，簡稱乙肝)系由乙肝病毒(HBV)引起，以乏力、食欲減退、惡心、嘔吐、厭油、肝大及肝功能異常為主要臨床表現(xiàn)。部分病例有發(fā)熱和黃疸；少數(shù)病例病程遷延轉(zhuǎn)為慢性，或發(fā)展為肝硬化甚至肝癌；重者病情進展迅猛可發(fā)展為重型肝炎；另一些感染者則成為無癥狀的病毒攜帶者。HBV-DNA定量檢測指標降低在乙肝治療中有著非常重要的意義，是乙肝轉(zhuǎn)陰的前奏，也是康復(fù)最為關(guān)鍵的一步，只有體內(nèi)的HBV-DNA定量指標降低，病毒的復(fù)制繁殖才會停止，乙肝的徹底治愈才有希望。乙肝病毒DNA檢測的臨床意義一、對醫(yī)生的診斷和用藥非常重要。通過乙肝病毒DNA檢測能夠判定判斷乙肝患者適合用哪類抗病毒藥物；乙肝病毒DNA檢測對用藥的劑量、用藥時間、是否需要聯(lián)合用藥以及用藥的效果等提供重要的參考依據(jù)，也是臨床上評價抗病毒或免疫增強藥物療效的最客觀的指標。乙肝病毒DNA檢測的臨床意義二、能夠直接反映乙肝病毒復(fù)制狀態(tài)及傳染性的最佳指標，通過乙肝病毒DNA的含量能直接反映病毒在體內(nèi)存在的數(shù)量、是否傳染，傳染性有多強。但是需要說明的一點是:乙肝病毒載量的多少并不代表肝臟的損傷程度，也無法判斷病情的嚴重程度。乙肝病毒DNA檢測的臨床意義三、反映病毒復(fù)制的活躍程度，間接地反映機體的免疫應(yīng)答水平。目前，實時熒光定量PCR(real-timePCR)是核酸(DNA或RNA)定量檢測的主要方法?，F(xiàn)已報道的乙型肝炎患者血液中HBVPgRNA的檢測方法都是基于real-timePCR技術(shù)。但這種定量方法需要參考品、標準曲線以及內(nèi)標校正，檢測結(jié)果只是一個相對定量的結(jié)果，并不能夠進行絕對定量，靈敏度也相對較低，尤其是對低拷貝數(shù)HBVPgRNA的定量仍存在一定的不足。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種組合物、其應(yīng)用以及含有該組合物的試劑盒。該組合物能夠?qū)BVpgRNA進行絕對定量，可以有效的減少背景干擾和提高檢測靈敏度，靈敏度可低至5個拷貝。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種組合物，包括引物和探針，所述引物的序列如SEQIDNo.1～3所示；所述探針的序列如SEQIDNo.4所示。本發(fā)明還提供了所述的組合物在制備擴增和/或檢測乙型肝炎病毒的試劑和/或試劑盒中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述乙型肝炎病毒為HBVpgRNA。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述擴增和/或檢測為痕量擴增和/或痕量檢測，所述檢測的靈敏度為5個拷貝/mL。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述擴增和/或檢測的反應(yīng)體系為：或在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述擴增和/或檢測的反應(yīng)程序為：在本發(fā)明的一些具體實施方案中，擴增和/或檢測乙型肝炎病毒具體為：由序列如SEQIDNo.2所示的上游引物、序列如SEQIDNo.3所示的下游引物和序列如SEQIDNo.4所示的探針定量檢測HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)，再由序列如SEQIDNo.1所示的上游引物、序列如SEQIDNo.3所示的下游引物和序列如SEQIDNo.4所示的探針定量檢測PreC-mRNA，取HBVRNA和PreC-mRNA的定量結(jié)果之差獲得HBVpgRNA的含量。HBVpgRNA結(jié)構(gòu)特點：HBVpgRNA基因結(jié)構(gòu)特殊，它的起始位置(nt1820)距離PreC-mRNA基因的起始位置(nt1788)較近，同時二者基因終點相同(圖1)。因此，本發(fā)明提供的HBVpgRNA基因定量的策略是：先用引物2(上游引物)和引物3(下游引物)定量HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)總量，再用引物1(上游引物)和引物3(下游引物)定量PreC-mRNA，兩者定量結(jié)果之差即為pgRNA水平。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括所述的組合物及分子生物學擴增中常用的助劑。本發(fā)明還提供了一種基于所述組合物或所述試劑盒的擴增和/或檢測乙型肝炎病毒的方法，取待測樣本獲得HBV核酸混合物，去除DNA后，逆轉(zhuǎn)錄后經(jīng)數(shù)字PCR，獲得HBVpgRNA的含量；所述檢測樣本為血清或血漿。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述數(shù)字PCR具體為由序列如SEQIDNo.2所示的上游引物、序列如SEQIDNo.3所示的下游引物和序列如SEQIDNo.4所示的探針定量檢測HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)，再由序列如SEQIDNo.1所示的上游引物、序列如SEQIDNo.3所示的下游引物和序列如SEQIDNo.4所示的探針定量檢測PreC-mRNA，取HBVRNA和PreC-mRNA的定量結(jié)果之差獲得HBVpgRNA的含量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的乙型肝炎患者血液中HBVPgRNA的檢測組合物達到了如下效果：1、檢測所用標本為血液，無創(chuàng)、方便獲取且可大規(guī)模應(yīng)用；2、所述的檢測組合物主要基于數(shù)字PCR技術(shù)和Taqman探針，檢測過程不依賴于擴增曲線的閾值(CT)進行定量，不受擴增效率的影響，無需依靠標準曲線來測定核酸量，而是直接采用數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)通過微滴化處理，直接數(shù)出DNA分子個數(shù)，大大簡化操作步驟，有效節(jié)約了檢測時間；3、所述的檢測組合物對HBVpgRNA檢測是絕對定量，顯著有別于real-timePCR方法的相對定量；4、所述的檢測組合物在HBVpgRNA含量極低的樣品檢測中，通過微滴化處理可以有效的減少背景干擾和提高檢測靈敏度，靈敏度可低至5個拷貝，有效的克服了現(xiàn)有的基于real-timePCR技術(shù)的檢測方法無法對低拷貝數(shù)HBVPgRNA進行定量的不足之處。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示HBVpgRNA的基因結(jié)構(gòu)特點；圖2示血液HBVpgRNA定量檢測流程圖；圖3示靈敏度檢測結(jié)果；圖4示特異性檢測結(jié)果；其中，圖4(A)示ddPCR法檢測特異性樣品的濃度圖；圖4(B)示ddPCR法檢測特異性樣品的陽性微滴圖。具體實施方式本發(fā)明公開了一種組合物、其應(yīng)用以及含有該組合物的試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的技術(shù)方案具體如下：一、引物及探針的設(shè)計：1.HBVpgRNA結(jié)構(gòu)特點：HBVpgRNA基因結(jié)構(gòu)特殊，它的起始位置(nt1820)距離PreC-mRNA基因的起始位置(nt1788)較近，同時二者基因終點相同(如圖1所示)。因此，HBVpgRNA基因定量的策略是：先用引物2(上游引物)和引物3(下游引物)定量HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)總量，再用引物1(上游引物)和引物3(下游引物)定量PreC-mRNA，兩者定量結(jié)果之差即為pgRNA水平。2.HBV基因型有A-J9種基因型，在我國以B、C基因型為主，同時存在部分A、D基因型。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載多條A～D基因型HBV參考序列，通過MEGA6.0軟件分析不同基因型HBV基因組的保守區(qū)域。按照引物和探針的設(shè)計原則(盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物內(nèi)部二聚體、引物間二聚體以及錯配的形成、探針的Tm值等)，在這些保守區(qū)域中通過Beacondesigner8.14軟件設(shè)計出針對HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA檢測的特異性引物和探針序列。通過Blast數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對上述引物和探針序列進行序列比對分析，避免與其它病毒或人類基因發(fā)生非特異結(jié)合。3.引物和探針的優(yōu)化：針對HBVpgRNA基因結(jié)構(gòu)特點和HBV基因型的多樣性，設(shè)計了多對引物和探針，經(jīng)過多輪篩選和優(yōu)化，最終確定一套靈敏度和特異度最優(yōu)的引物和探針。如表1所示。探針的5’端用FAM修飾，3’端用TAMRA修飾。表1二、實驗方法1.實驗流程：血液HBVpgRNA定量檢測流程圖見圖2。2.實驗步驟：(1)提取HBV核酸混合物。用QIAampUltraSensViruskit(Qiagen,Hilden,Germany)從200-1000μl血清或血漿樣本提取HBV核酸混合物。按說明書操作，具體如下：1)吸取200μl血清樣品至2ml的離心管中，再加800μlPBS溶液；2)加入800μlBufferAC至離心管中，吸取5.6μl的CarrierRNA溶液至離心管的蓋子中，合蓋，上下顛倒3次混勻，然后渦旋10秒；3)靜置10min；離心，1200×g，3min；4)棄上清，加300μlBufferAR加熱至60℃，再加入20μl蛋白酶K,充分渦旋；5)40℃加熱器中加熱震蕩10min；6)加300μlBufferAB，渦旋混勻，短暫離心；7)吸取700μl的溶解產(chǎn)物至柱中，合蓋，離心，3000—5000×g，1min；8)棄掉收集管，將柱子移至一個新的收集管中，再加入500μlBufferAW1，離心，6000×g，1min；9)棄掉收集管，將柱子移至一個新的收集管中，再加500μlBufferAW2，離心，20000×g，3min；10)棄掉收集管，將柱子移至一個新的1.5ml收集管中，加30μlBufferAVE，離心，6000×g，1min；11)重復(fù)洗脫，再加30μlBufferAVE，離心，6000×g，1min。(2)去除DNA反應(yīng)。a.按下列組分配制反應(yīng)體系：表2試劑使用量5×gDNAEraserBuffer2.0μlgDNAEraser1.0μlHBV核酸混合物7.0μl合計10.0μlb.反應(yīng)條件：表3溫度時間備注42℃2分鐘4℃∞保溫(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用TaKaRaPrimeScriptRTreagentKit(TaKaRa，Dalian，China)對步驟(2)產(chǎn)物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將其逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。a.按下列組分配制反應(yīng)體系：表4試劑使用量步驟2的反應(yīng)液10.0μlReverseTranscriptase1.0μlRTPrimerMix4.0μl5×ReactionBuffer4.0μlRNAsefreeH2O1.0μl合計20.0μlb.反應(yīng)條件：表5(4)數(shù)字PCR反應(yīng)。以步驟(3)的產(chǎn)物為模板，按表6和表7配置2份反應(yīng)體系，其中1份加入引物2(序列如SEQIDNo.2所示)和引物3(序列如SEQIDNo.3所示的下游引物)，目的是定量HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)總量；另1份加入引物1(序列如SEQIDNo.1所示的上游引物)和引物3(序列如SEQIDNo.3所示的下游引物)，目的是定量PreC-mRNA；其它組分和用量相同。a.配制數(shù)字PCR反應(yīng)混合液，按下列組分配制反應(yīng)體系：表6試劑使用量2×ddPCRSupermix10.0μl序列如SEQIDNo.2所示的上游引物(10μM)1.0μl序列如SEQIDNo.3所示的下游引物(10μM)1.0μl序列如SEQIDNo.4所示的Probe(10μM)0.5μlcDNA1.0μlRNAsefreeH2O6.5μl合計20.0μl表7試劑使用量2×ddPCRSupermix10.0μl序列如SEQIDNo.1所示的上游引物(10μM)1.0μl序列如SEQIDNo.3所示的下游引物(10μM)1.0μl序列如SEQIDNo.4所示的Probe(10μM)0.5μlcDNA1.0μlRNAsefreeH2O6.5μl合計20.0μlb.將配制好的PCR反應(yīng)液上樣至微滴發(fā)生卡，HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA的數(shù)字PCR反應(yīng)混合液分別制作為油包水PCR微反應(yīng)液滴，生成的微反應(yīng)液滴數(shù)量為10000～20000個，然后對所述微反應(yīng)液滴進行PCR擴增反應(yīng)。c.將生成的微滴從微滴發(fā)生卡轉(zhuǎn)移至PCR反應(yīng)板，然后進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：表8(5)讀取熒光信號：步驟(4)PCR擴增后，將PCR反應(yīng)板放入熒光讀取儀器中，在FAM通道中進行HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA的定量檢測，通過Quantasoft軟件進行定量分析，讀出“HBVRNA(PreC-mRNA+pgRNA)”、“PreC-mRNA”的拷貝數(shù)。計算出pgRNA的拷貝數(shù)。三、標準品制備從HepAD38細胞培養(yǎng)上清中的提取HBV核酸混合物(HBVRNA/DNA)，然后去除HBVDNA,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后，用高保真酶PrimSTARHSDNA聚合酶(TaKaRa，Dalian,China)、特異性引物1和引物3，通過PCR擴增目的片段，再切膠回收PCR產(chǎn)物，與pEASY-T5載體(TransgenBio,Beijing,China)連接，轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細胞，在含氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)后挑選白斑，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)菌落PCR和測序驗證為目的DNA片段后確定為陽性質(zhì)粒。用分光光度計測定陽性質(zhì)粒的吸光值，計算拷貝數(shù)/mL，然后稀釋成107拷貝/mL106拷貝/mL、105拷貝/mL、104拷貝/mL、103拷貝/mL、102拷貝/mL、101拷貝/mL、5拷貝/mL、1拷貝/mL，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｋ?、檢測方法1.靈敏度檢測：選擇上述濃度梯度的標準品，用ddPCR方法對每個濃度的樣品進行定量檢測，從而確定本方法的靈敏度。并與real-timePCR方法檢測的結(jié)果進行比較。2.特異性檢測：選擇HBV陽性血清樣品、HBV陰性血清樣品(正常人)、生理鹽水以及已知單純甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染的血清樣品，用ddPCR方法進行檢測，從而考查本方法的特異性，并與real-timePCR方法檢測的結(jié)果進行比較。3.重復(fù)性實驗：選擇106拷貝/mL、104拷貝/mL的標準品，用ddPCR方法和real-timePCR方法分別進行檢測，每個濃度樣品重復(fù)3次，計算每個樣品檢測結(jié)果的平均值(Mean)、標準差(SD)以及變異系數(shù)(CV)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的乙型肝炎患者血液中HBVPgRNA的檢測組合物達到了如下效果：1、檢測所用標本為血液，無創(chuàng)、方便獲取且可大規(guī)模應(yīng)用；2、所述的檢測組合物主要基于數(shù)字PCR技術(shù)和Taqman探針，檢測過程不依賴于擴增曲線的閾值(CT)進行定量，不受擴增效率的影響，無需依靠標準曲線來測定核酸量，而是直接采用數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)通過微滴化處理，直接數(shù)出DNA分子個數(shù)，大大簡化操作步驟，有效節(jié)約了檢測時間；3、所述的檢測組合物對HBVpgRNA檢測是絕對定量，顯著有別于real-timePCR方法的相對定量；4、所述的檢測組合物在HBVpgRNA含量極低的樣品檢測中，通過微滴化處理可以有效的減少背景干擾和提高檢測靈敏度，靈敏度可低至5個拷貝，有效的克服了現(xiàn)有的基于real-timePCR技術(shù)的檢測方法無法對低拷貝數(shù)HBVPgRNA進行定量的不足之處。本發(fā)明提供的組合物、其應(yīng)用以及含有該組合物的試劑盒中所用原料及試劑均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1引物及探針的設(shè)計HBVpgRNA結(jié)構(gòu)特點：HBVpgRNA基因結(jié)構(gòu)特殊，它的起始位置(nt1820)距離PreC-mRNA基因的起始位置(nt1788)較近，同時二者基因終點相同(圖1)。因此，HBVpgRNA基因定量的策略是：先用引物2(上游引物)和引物3(下游引物)定量HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)總量，再用引物1(上游引物)和引物3(下游引物)定量PreC-mRNA，兩者定量結(jié)果之差即為pgRNA水平。HBV基因型有A-J9種基因型，在我國以B、C基因型為主，同時存在部分A、D基因型。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載多條A～D基因型HBV參考序列，通過MEGA6.0軟件分析不同基因型HBV基因組的保守區(qū)域。按照引物和探針的設(shè)計原則(盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物內(nèi)部二聚體、引物間二聚體以及錯配的形成、探針的Tm值等)，在這些保守區(qū)域中通過Beacondesigner8.14軟件設(shè)計出針對HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA檢測的特異性引物和探針序列。通過Blast數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對上述引物和探針序列進行序列比對分析，避免與其它病毒或人類基因發(fā)生非特異結(jié)合。引物和探針的優(yōu)化：針對HBVpgRNA基因結(jié)構(gòu)特點和HBV基因型的多樣性，設(shè)計了多對引物和探針，經(jīng)過多輪篩選和優(yōu)化，最終確定一套靈敏度和特異度最優(yōu)的引物和探針。如表9所示。探針的5’端用FAM修飾，3’端用TAMRA修飾。表9實施例2(1)提取HBV核酸混合物。用QIAampUltraSensViruskit(Qiagen,Hilden,Germany)從200-1000μl血清或血漿樣本提取HBV核酸混合物。按說明書操作，具體如下：1)吸取200μl血清樣品至2ml的離心管中，再加800μlPBS溶液；2)加入800μlBufferAC至離心管中，吸取5.6μl的CarrierRNA溶液至離心管的蓋子中，合蓋，上下顛倒3次混勻，然后渦旋10秒；3)靜置10min；離心，1200×g，3min；4)棄上清，加300μlBufferAR加熱至60℃，再加入20μl蛋白酶K,充分渦旋；5)40℃加熱器中加熱震蕩10min；6)加300μlBufferAB，渦旋混勻，短暫離心；7)吸取700μl的溶解產(chǎn)物至柱中，合蓋，離心，3000—5000×g，1min；8)棄掉收集管，將柱子移至一個新的收集管中，再加入500μlBufferAW1，離心，6000×g，1min；9)棄掉收集管，將柱子移至一個新的收集管中，再加500μlBufferAW2，離心，20000×g，3min；10)棄掉收集管，將柱子移至一個新的1.5ml收集管中，加30μlBufferAVE，離心，6000×g，1min；11)重復(fù)洗脫，再加30μlBufferAVE，離心，6000×g，1min。(2)去除DNA反應(yīng)。a.按下列組分配制反應(yīng)體系：表10試劑使用量5×gDNAEraserBuffer2.0μlgDNAEraser1.0μlHBV核酸混合物7.0μl合計10.0μlb.反應(yīng)條件：表11溫度時間備注42℃2分鐘4℃∞保溫(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用TaKaRaPrimeScriptRTreagentKit(TaKaRa，Dalian，China)對步驟(2)產(chǎn)物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將其逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。a.按下列組分配制反應(yīng)體系：表12b.反應(yīng)條件：表13(4)數(shù)字PCR反應(yīng)。以步驟(3)的產(chǎn)物為模板，按表14和表15配置2份反應(yīng)體系，其中1份加入引物2和引物3，目的是定量HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)總量；另1份加入引物1和引物3，目的是定量PreC-mRNA；其它組分和用量相同。a.配制數(shù)字PCR反應(yīng)混合液，按下列組分配制反應(yīng)體系：表14試劑使用量2×ddPCRSupermix10.0μl序列如SEQIDNo.2所示的上游引物(10μM)1.0μl序列如SEQIDNo.3所示的下游引物(10μM)1.0μl序列如SEQIDNo.4所示的Probe(10μM)0.5μlcDNA1.0μlRNAsefreeH2O6.5μl合計20.0μl表15b.將配制好的PCR反應(yīng)液上樣至微滴發(fā)生卡，HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA的數(shù)字PCR反應(yīng)混合液分別制作為油包水PCR微反應(yīng)液滴，生成的微反應(yīng)液滴數(shù)量為10000～20000個，然后對所述微反應(yīng)液滴進行PCR擴增反應(yīng)。c.將生成的微滴從微滴發(fā)生卡轉(zhuǎn)移至PCR反應(yīng)板，然后進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：表16讀取熒光信號：步驟(4)PCR擴增后，將PCR反應(yīng)板放入熒光讀取儀器中，在FAM通道中進行HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA的定量檢測，通過Quantasoft軟件進行定量分析，讀出“HBVRNA(PreC-mRNA+pgRNA)”、“PreC-mRNA”的拷貝數(shù)。計算出pgRNA的拷貝數(shù)。實施例3標準品制備從HepAD38細胞培養(yǎng)上清中的提取HBV核酸混合物(HBVRNA/DNA)，然后去除HBVDNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后，用高保真酶PrimSTARHSDNA聚合酶(TaKaRa，Dalian,China)、特異性引物1(序列如SEQIDNo.1所示)和引物3(序列如SEQIDNo.3所示)，通過PCR擴增目的片段，再切膠回收PCR產(chǎn)物，與pEASY-T5載體(TransgenBio,Beijing,China)連接，轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細胞，在含氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)后挑選白斑，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)菌落PCR和測序驗證為目的DNA片段后確定為陽性質(zhì)粒。用分光光度計測定陽性質(zhì)粒的吸光值，計算拷貝數(shù)/mL，然后稀釋成107拷貝/mL106拷貝/mL、105拷貝/mL、104拷貝/mL、103拷貝/mL、102拷貝/mL、101拷貝/mL、5拷貝/mL、1拷貝/mL，-20℃保存?zhèn)溆?。實施?靈敏度檢測選擇實施例3制得的濃度梯度的標準品，用ddPCR方法對每個濃度的樣品進行定量檢測，從而確定本方法的靈敏度。并與real-timePCR方法檢測的結(jié)果進行比較。表17結(jié)果：ddPCR方法在大于等于5拷貝/mL樣品中每次重復(fù)均能檢出HBVpgRNA，而在1拷貝/mL樣品中部分重復(fù)未能檢測HBVpgRNA，說明本方法具有較高的靈敏度,檢測范圍可至5拷貝/mL(如表17、圖3所示)。要顯著(P＜0.05)高于Real-timePCR方法(103拷貝/mL)實施例5特異性檢測選擇HBV陽性血清樣品、HBV陰性血清樣品(正常人)、生理鹽水以及已知單純甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染的血清樣品，用ddPCR方法進行檢測，從而考查本方法的特異性，并與real-timePCR方法檢測的結(jié)果進行比較。表18結(jié)果：ddPCR方法在檢測HBV陰性樣品(正常人)、生理鹽水、HAV、HCV樣品，均沒有陽性微滴(如圖4(A)、圖4(B)所示)。在低拷貝:如5拷貝/ml、10拷貝/ml的陽性樣品中，ddPCR法可檢測到陽性微滴，而Real-timePCR方法擴增曲線平直，與閾值線無交點，未能檢測到目的基因。因此，表明本方法具有更優(yōu)(P＜0.05)的特異性。實施例6重復(fù)性實驗選擇106拷貝/mL、104拷貝/mL的標準品(實施例3制得)，用ddPCR方法和real-timePCR方法分別進行檢測，每個濃度樣品重復(fù)3次，計算每個樣品檢測結(jié)果的平均值(Mean)、標準差(SD)以及變異系數(shù)(CV)。表19結(jié)果：ddPCR方法無論在檢測高拷貝或低拷貝濃度樣品中，均表現(xiàn)出很好的重復(fù)性。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCELISTING<110>重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院<120>一種組合物、其應(yīng)用以及含有該組合物的試劑盒<130>MP1617552<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1ggtctgttcaccagcacc18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2cctctgcctaatcatctca19<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3aggtgtcaatgtccatgc18<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4caaagccacccaaggcacagc21當前第1頁1 2 3