本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過長片段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）對牡蠣皰疹病毒（Ostreid herpesvirus1,OsHV-1）全基因組DNA的富集方法。

背景技術(shù)：

牡蠣皰疹病毒是首個被發(fā)現(xiàn)感染無脊椎動物的皰疹病毒，該病毒最早報道于1991年，目前已引起包括我國在內(nèi)的全球11個國家和地區(qū)的多種海水養(yǎng)殖雙殼貝類的大規(guī)模死亡。由于無脊椎動物皰疹病毒發(fā)現(xiàn)和研究起步晚，又缺乏無脊椎動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)和建系技術(shù)，還無法得到純凈的牡蠣皰疹病毒粒子或其基因組DNA。這一缺陷嚴(yán)重阻礙了牡蠣皰疹病毒相關(guān)研究的推進(jìn)，以及基于核酸的分子檢測方法的改進(jìn)。

目前人和脊椎動物皰疹病毒粒子和全基因組DNA的富集，主要通過兩種途徑完成：一是皰疹病毒人工感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞系增殖后進(jìn)行純化，二是基于RNA探針的靶序列富集技術(shù)。但這兩種方法的應(yīng)用都有一定的前提條件，體外培養(yǎng)細(xì)胞系增殖純化需要有宿主細(xì)胞的體外培養(yǎng)和建系技術(shù)，靶序列富集技術(shù)需要有商品化的RNA探針。如前所述，目前還不掌握無脊椎動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，而商品化的RNA探針也僅限于部分人皰疹病毒。因此，上述技術(shù)都不能應(yīng)用到包括牡蠣皰疹病毒在內(nèi)的無脊椎動物皰疹病毒基因組DNA富集工作中去。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種牡蠣皰疹病毒全基因組DNA富集方法，可彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白；同時，該技術(shù)對其他無脊椎動物皰疹病毒等雙鏈DNA病毒全基因組DNA的富集也有極好的借鑒作用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：1）組織樣品勻漿：取病貝外套膜和腮組織10-15g，經(jīng)過濾海水洗滌2-5次，然后用剪刀剪碎組織；加入90-135ml的滅菌海水，使用組織勻漿器勻漿組織；2）低速離心去除雜質(zhì)：將步驟1）中得到組織勻漿液依次在250g、1000g和4000g離心力下離心；每次離心后去除沉淀，取上清液；3）基因組DNA提?。阂圆襟E2）中上清液180μL為靶物質(zhì)，使用DNA提取試劑盒，提取DNA作為長片段PCR擴(kuò)增的模板；4）長片段PCR擴(kuò)增：以步驟3）中提取得到DNA 1.0μL為模板，分別采用23對引物，在25μL體系中進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增；5）PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：取步驟4）得到的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物4.5μL，加入1.5μL 的上樣緩沖液混合后，在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠中，110伏電壓下電泳50 min；凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，存在約10Kb的特異性條帶，則確定成功擴(kuò)增。

優(yōu)選的，在所述步驟4）中，所述的25μL長片段PCR反應(yīng)體系組成分如下：5×PCR緩沖液 5μL、dNTP 1.5-3μL、GXL DNA 聚合酶 0.5-1μL、濃度為10.0 μmol/L的上游引物和下游引物各0.5-1μL、DNA模板1-2μL，另外加超純水12.5-15.5μL。

優(yōu)選的，在所述步驟4）中，所述的長片段PCR的程序如下：首先94 ℃預(yù)變性1 min；然后98 ℃變性10 s，50-54℃變性15 s，68℃延伸10min，35個循環(huán)，4℃保存。

優(yōu)選的，在所述步驟4）中，所述長片段PCR所用的23對引物序列為：

G1F：CCCGCACACATACGCACTACATAAA

G1R：GGTTTCCAGTAGGGTGTTTAAGAGC

G2F：GCAATCCAGTTCCCAAACCAATAGG

G2R：ATCGCTTCCTATCACCTTGTGGTCT

G3F：CCGTGAAATATCTGCCAAGGTGTTG

G3R：CGACCAGGAGAACATGAACGACTTT

G4F：GCCCTCCTATTGGTACAAGATTGCT

G4R：GAGCACAAACACTACCGCATACATG

G5F：GCTTGTTTCTTGGTGTCTGAGGTCA

G5R：ATGGCAGAAATAGAAACCCGAGGTC

G6F：ATCCCAGTCTGTCAAATGCTCTCTC

G6R：CCAGATATGAAGAGGAAGGGATGTC

G7F：ATGCCTGGGCGTAATTGTCTCTTGA

G7R：CCAACTCTTCATCGTCACTCATCTC

G8F：GGGCGTTCACTTTAGACTTCCAATC

G8R：TTCCCTGGCGATACTCTCATAGACA

G9F：GGTCCGTCAACATCGAGAAAGAGAA

G9R：CACGATAAATATGCTGCCTGGGTCA

G10F：AGGGCGAGCATGGTCACATTTCAAA

G10R：GGGATATTCTGAGGGTTGTTGTGGA

G11F：GCCCAATAAACCTACAGAGGATGAG

G11R：ATGGCAGATTCAGGAGAGGGTTGTA

G12F：TGGCTTCTGTGGTGGTAGTTGTTGT

G12R：CGGCATTACCAAATATAGGCACACG

G13F：GGCACGCTCATTCTTACAACTCTTG

G13R：CAACCAATCAGATCGACGAGACTCA

G14-2F：GCGATGCCTTAATTGTTGCCAGAGT

G14-2R：TCCTGTGGAATGGTTGTTGGTGATG

G15F：GCAAACGAAAGAGCGGCTATAACAG

G15R：CTCCGTCATCGGTGTTATTACTAGG

G16F：GTCGGTTGTGGGTTTGGAAATGTAG

G16R：CTGGAAGCGAGTGTCAAGGTTAAAC

G17F：GCAGTTTGATTCATGTGTGGCAGAG

G17R：GCCATCCACCTCATATCCATTTCTC

G18F：GGATGATGGATTGTTGGACGAGAGA

G18R：GCTGCGGTCAGTACATGGTCATTTA

G19F：CGTGAAGACGCCATGAAGAGAAGTT

G19R：TCTGCCAGCCTCTGTGAACTTGTAA

G20F：TTGGCAGATGAGGACACCTTATACC

G20R：TTCCTGATTCCTCCACGCCATAACA

G21F：GGCAGCTAGTAAGGTCAATCTCAAC

G21R：TGGTTCCCTGGCGACGTTTACATAA

G22F：CGAAACGACAGGTTGAAGTGAGG

G22R：CAATGAATCGCCAATTAAGGAGG

G23F：CCATTTGTCAATCTCGGTTCTGC

G23R：GGAGGTGGGGTTTGAATACGAAG；其中，引物序列方向均為5’到3’，F(xiàn)代表上游引物，R代表下游引物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明是以牡蠣皰疹病毒種內(nèi)相對保守的基因序列為模板，設(shè)計23對長片段PCR用引物。這些引物可以特異性地覆蓋牡蠣皰疹病毒全基因組，并被經(jīng)過優(yōu)化的長片段PCR反應(yīng)體系和程序所擴(kuò)增，完成對對牡蠣皰疹病毒基因組DNA富集的目的，克服了之前無法富集和純化病毒基因組DNA的問題。同時，該方法不僅可以用于新鮮組織樣本內(nèi)牡蠣皰疹病毒基因組DNA的富集，也可以用于冷凍保存組織樣本內(nèi)牡蠣皰疹病毒基因組DNA的富集。

附圖說明

圖1：櫛孔扇貝感染牡蠣皰疹病毒長片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；M：Trans15K DNA Marker；1-23：使用第1至23對長片段PCR引物（見表1），擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物；

圖2：健康櫛孔扇貝長片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；M：Trans15K DNA Marker；1-23：使用第1至23對長片段PCR引物（見表1），擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物；

圖3：魁蚶感染牡蠣皰疹病毒長片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；M：Trans15K DNA Marker；1-23：使用第1至23對長片段PCR引物（見表1），擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物；

圖4：新鮮魁蚶感染牡蠣皰疹病毒長片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；M：Trans15K DNA Marker；1-23：使用第1至23對長片段PCR引物（見表1），擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：

如圖1、2、3、4所示，一種牡蠣皰疹病毒全基因組DNA富集方法，包括如下步驟：1）組織樣品勻漿：取病貝外套膜和腮組織10-15g，經(jīng)過濾海水洗滌2-5次，然后用剪刀剪碎組織；加入90-135ml的滅菌海水，使用組織勻漿器勻漿組織；2）低速離心去除雜質(zhì)：將步驟1）中得到組織勻漿液依次分別在250g、1000g和4000g離心力下離心；每次離心后去除沉淀，取上清液；3）基因組DNA提?。阂圆襟E2）中上清液180μL為靶物質(zhì)，使用DNA提取試劑盒，提取DNA作為長片段PCR擴(kuò)增的模板；4）長片段PCR擴(kuò)增：以步驟3）中提取得到DNA 1.0μL為模板，分別采用23對引物，在25μL體系中進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增；5）PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：取步驟4）得到的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物4.5μL，加入1.5μL 的上樣緩沖液混合后，在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠中，110伏電壓下電泳50 min；凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，存在約10Kb的特異性條帶，則確定成功擴(kuò)增。

步驟4）中，所述的25μL長片段PCR反應(yīng)體系組成分如下：5×PCR緩沖液 5μL、dNTP 1.5-3μL、GXL DNA 聚合酶 0.5-1μL、濃度為10.0 μmol/L的上游引物和下游引物各0.5-1μL、DNA模板1-2μL，另外加超純水12.5-15.5μL。

在步驟4）中長片段PCR的程序如下：首先94 ℃預(yù)變性1 min；然后98 ℃變性10 s，50-54℃變性15 s，68℃延伸10min，35個循環(huán)，4℃保存。

步驟4）中的長片段PCR所用的23對引物序列為：

G1F：CCCGCACACATACGCACTACATAAA

G1R：GGTTTCCAGTAGGGTGTTTAAGAGC

G2F：GCAATCCAGTTCCCAAACCAATAGG

G2R：ATCGCTTCCTATCACCTTGTGGTCT

G3F：CCGTGAAATATCTGCCAAGGTGTTG

G3R：CGACCAGGAGAACATGAACGACTTT

G4F：GCCCTCCTATTGGTACAAGATTGCT

G4R：GAGCACAAACACTACCGCATACATG

G5F：GCTTGTTTCTTGGTGTCTGAGGTCA

G5R：ATGGCAGAAATAGAAACCCGAGGTC

G6F：ATCCCAGTCTGTCAAATGCTCTCTC

G6R：CCAGATATGAAGAGGAAGGGATGTC

G7F：ATGCCTGGGCGTAATTGTCTCTTGA

G7R：CCAACTCTTCATCGTCACTCATCTC

G8F：GGGCGTTCACTTTAGACTTCCAATC

G8R：TTCCCTGGCGATACTCTCATAGACA

G9F：GGTCCGTCAACATCGAGAAAGAGAA

G9R：CACGATAAATATGCTGCCTGGGTCA

G10F：AGGGCGAGCATGGTCACATTTCAAA

G10R：GGGATATTCTGAGGGTTGTTGTGGA

G11F：GCCCAATAAACCTACAGAGGATGAG

G11R：ATGGCAGATTCAGGAGAGGGTTGTA

G12F：TGGCTTCTGTGGTGGTAGTTGTTGT

G12R：CGGCATTACCAAATATAGGCACACG

G13F：GGCACGCTCATTCTTACAACTCTTG

G13R：CAACCAATCAGATCGACGAGACTCA

G14-2F：GCGATGCCTTAATTGTTGCCAGAGT

G14-2R：TCCTGTGGAATGGTTGTTGGTGATG

G15F：GCAAACGAAAGAGCGGCTATAACAG

G15R：CTCCGTCATCGGTGTTATTACTAGG

G16F：GTCGGTTGTGGGTTTGGAAATGTAG

G16R：CTGGAAGCGAGTGTCAAGGTTAAAC

G17F：GCAGTTTGATTCATGTGTGGCAGAG

G17R：GCCATCCACCTCATATCCATTTCTC

G18F：GGATGATGGATTGTTGGACGAGAGA

G18R：GCTGCGGTCAGTACATGGTCATTTA

G19F：CGTGAAGACGCCATGAAGAGAAGTT

G19R：TCTGCCAGCCTCTGTGAACTTGTAA

G20F：TTGGCAGATGAGGACACCTTATACC

G20R：TTCCTGATTCCTCCACGCCATAACA

G21F：GGCAGCTAGTAAGGTCAATCTCAAC

G21R：TGGTTCCCTGGCGACGTTTACATAA

G22F：CGAAACGACAGGTTGAAGTGAGG

G22R：CAATGAATCGCCAATTAAGGAGG

G23F：CCATTTGTCAATCTCGGTTCTGC

G23R：GGAGGTGGGGTTTGAATACGAAG；其中，引物序列方向均為5’到3’，F(xiàn)代表上游引物，R代表下游引物。

實(shí)施例一

櫛孔扇貝感染牡蠣皰疹病毒基因組DNA的富集

1. 組織樣品勻漿

取感染（患病）和未感染（健康）牡蠣皰疹病毒櫛孔扇貝外套膜和腮組織各10g，經(jīng)過濾海水洗滌3次，用剪刀剪至約3mm³大小碎塊；

按1：9（w/v）的比例加入90ml的滅菌海水，使用組織勻漿器勻漿組織：最大轉(zhuǎn)速，勻漿3次，每次10秒。

2.低速離心去除宿主組織和細(xì)胞

將上述得到的組織勻漿液依次經(jīng)過250g、1000g和4000g離心力離心20min；每次離心后去除沉淀，取上清液。

3.上清液DNA提取

取最后一次離心后得到的上清液各180 μL，使用DNeasy^? 血液&組織DNA提取試劑盒提取DNA作為模板。

4.長片段PCR擴(kuò)增

使用Takara PrimeSTAR^? GXL DNA 聚合酶及配套的緩沖液，配制成25 μL的PCR反應(yīng)體系，其具體成分如下：5×PCR緩沖液 5 μL、dNTP 2μL、GXL DNA 聚合酶 0.5μL、濃度為10.0 μmol/L的上游引物和下游引物各0.5μL、DNA模板 1 μL，另外加超純水15.5μL。

所用的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋菏紫?4 ℃預(yù)變性1 min；然后98 ℃變性10 s，50℃變性15 s，68℃延伸10min，35個循環(huán)，4℃保存。

5. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

取步驟4中的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物各4.5 μL，加入1.5μL 的上樣緩沖液(GeneFinder與6×loading buffer按1∶9體積混合)混合后，在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠中，110伏電壓下電泳50 min；通過凝膠成像系統(tǒng)觀察是否存在10 Kb左右的特異性條帶。

圖1和2分別示感染和未感染櫛孔扇貝組織DNA長片段PCR擴(kuò)增結(jié)果。

實(shí)施例二

魁蚶感染牡蠣皰疹病毒基因組DNA的富集

1. 組織樣品勻漿

取感染牡蠣皰疹病毒魁蚶外套膜和腮組織15g經(jīng)過濾海水洗滌4次，用剪刀剪至約3 mm³大小碎塊；

按1：9（w/v）的比例加入135ml的滅菌海水，使用組織勻漿器勻漿組織：最大轉(zhuǎn)速，勻漿3次，每次10秒。

2.低速離心去除宿主組織和細(xì)胞

將上述得到的組織勻漿液依次經(jīng)過250g、1000g和4000g離心力離心20min；每次離心后去除沉淀，取上清液。

3.上清液DNA提取

取最后一次離心后得到的上清液180μL，使用DNeasy^? 血液&組織DNA提取試劑盒提取DNA作為模板。

4.長片段PCR擴(kuò)增

使用Takara PrimeSTAR^? GXL DNA 聚合酶及配套的緩沖液，配制成25 μL的PCR反應(yīng)體系，其具體成分如下：5×PCR緩沖液 5 μL、dNTP 3μL、GXL DNA 聚合酶 1μL、濃度為10.0 μmol/L的上游引物和下游引物各0.75μL、DNA模板 2 μL，另外加超純水12.5μL。

所用的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋菏紫?4 ℃預(yù)變性1 min；然后98 ℃變性10 s，54℃變性15 s，68℃延伸10min，35個循環(huán)，4℃保存。

5. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

取步驟4中的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物各4.5μL，加入1.5μL 的上樣緩沖液(GeneFinder與6×loading buffer按1∶9體積混合)混合后，在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠中，110伏電壓下電泳50 min；通過凝膠成像系統(tǒng)觀察是否存在10 Kb左右的特異性條帶。如圖3所示。

實(shí)施例三

新鮮魁蚶感染牡蠣皰疹病毒基因組DNA的富集

1. 組織樣品勻漿

取感染牡蠣皰疹病毒魁蚶外套膜和腮組織12g經(jīng)過濾海水洗滌4次，用剪刀剪至約3 mm³大小碎塊；

按1：9（w/v）的比例加入108ml滅菌海水，使用組織勻漿器勻漿組織：最大轉(zhuǎn)速，勻漿3次，每次10秒。

2.低速離心去除宿主組織和細(xì)胞

將上述得到的組織勻漿液依次經(jīng)過250g、1000g和4000g離心力離心20min；每次離心后去除沉淀，取上清液。

3.上清液DNA提取

取最后一次離心后得到的上清液180μL，使用DNeasy^? 血液&組織DNA提取試劑盒提取DNA作為模板。

4.長片段PCR擴(kuò)增

使用Takara PrimeSTAR^? GXL DNA 聚合酶及配套的緩沖液，配制成25 μL的PCR反應(yīng)體系，其具體成分如下：5×PCR緩沖液 5μL、dNTP 1.5μL、GXL DNA 聚合酶 1μL、濃度為10.0 μmol/L的上游引物和下游引物各1 μL、DNA模板 1 μL，另外加超純水14.5μL。

所用的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋菏紫?4 ℃預(yù)變性1 min；然后98℃變性10s，52.5℃變性15 s，68℃延伸10min，35個循環(huán)，4℃保存。

5. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

取步驟4中的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物各4.5 μL，加入1.5μL 的上樣緩沖液(GeneFinder與6×loading buffer按1∶9體積混合)混合后，在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠中，110伏電壓下電泳50 min；通過凝膠成像系統(tǒng)觀察是否存在10 Kb左右的特異性條帶。如圖4所示。

本發(fā)明其次提供一套牡蠣皰疹病毒全基因組DNA的長片段PCR擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)的核心是從眾多盡心設(shè)計和反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，得到的23對長片段PCR引物。這些引物滿足以下條件：均來位于牡蠣皰疹病毒基因組的保守區(qū)，可以覆蓋整個病毒基因組，具有相似的溶解溫度（TM值）和擴(kuò)增長度（10-13Kb），后續(xù)PCR可使用同一PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，使操作過程更加快速和便捷。同時，還選出了最適合本發(fā)明實(shí)際應(yīng)用條件的DNA聚合酶，擴(kuò)增體系和PCR反應(yīng)程序。申請人在對牡蠣皰疹病毒已公布三個變異株基因組進(jìn)行全局比對后，發(fā)現(xiàn)該病毒種內(nèi)核苷酸序列相似度達(dá)到95%以上；這一基因組高度保守性，為發(fā)明人設(shè)計既能覆蓋病毒全基因組，又具有較高保守性的長片段PCR引物提供了基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)明人為了克服宿主DNA對長片段PCR造成的干擾問題；開創(chuàng)性的提出采用組織勻漿和差速離心的方法去除大部分宿主組織和細(xì)胞，然后再提取DNA用于下游操作。這一組織預(yù)處理方法的使用，有效的保障了長片段PCR的擴(kuò)增的效率和穩(wěn)定性，是該發(fā)明順利實(shí)施的重要一環(huán)。然后結(jié)合文獻(xiàn)報道和發(fā)明人現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從3種常用的長片段PCR擴(kuò)增用聚合酶中，篩選出穩(wěn)定性和擴(kuò)增效率高的Takara PrimeSTAR^? GXL DNA 聚合酶。最后通過優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系和程序，成功建立了牡蠣皰疹病毒的全基因組DNA富集方法。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。