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一種牡蠣皰疹病毒全基因組DNA富集方法與流程

文檔序號(hào):12097345閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種牡蠣皰疹病毒全基因組DNA富集方法,其特征在于:包括如下步驟:

1)組織樣品勻漿:取病貝外套膜和腮組織10-15g,經(jīng)過濾海水洗滌2-5次,然后用剪刀剪碎組織;加入90-135ml的滅菌海水,使用組織勻漿器勻漿組織;

2)低速離心去除雜質(zhì):將步驟1)中得到組織勻漿液依次在250g、1000g和4000g離心力下離心;每次離心后去除沉淀,取上清液;

3)基因組DNA提?。阂圆襟E2)中上清液180μL為靶物質(zhì),使用DNA提取試劑盒,提取DNA作為長片段PCR擴(kuò)增的模板;

4)長片段PCR擴(kuò)增:以步驟3)中提取得到DNA 1.0μL為模板,分別采用23對引物,在25μL體系中進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增;

5)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測:取步驟4)得到的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物4.5μL,加入1.5μL 的上樣緩沖液混合后,在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠中,110伏電壓下電泳50 min;凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照,存在約10Kb的特異性條帶,則確定成功擴(kuò)增。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣皰疹病毒全基因組DNA富集方法,其特征在于:步驟4)中,所述的25μL長片段PCR反應(yīng)體系組成分如下:5×PCR緩沖液 5μL、dNTP 1.5-3μL、GXL DNA 聚合酶 0.5-1μL、濃度為10.0 μmol/L的上游引物和下游引物各0.5-1μL、DNA模板1-2μL,另外加超純水12.5-15.5μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牡蠣皰疹病毒全基因組DNA富集方法,其特征在于:步驟4)中,所述的長片段PCR的程序如下:首先94 ℃預(yù)變性1min;然后98 ℃變性10s,50-54℃變性15s,68℃延伸10min,35個(gè)循環(huán),4℃保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的牡蠣皰疹病毒全基因組DNA富集方法,其特征在于:步驟4)中,所述長片段PCR所用的23對引物序列為:

G1F:CCCGCACACATACGCACTACATAAA

G1R:GGTTTCCAGTAGGGTGTTTAAGAGC

G2F:GCAATCCAGTTCCCAAACCAATAGG

G2R:ATCGCTTCCTATCACCTTGTGGTCT

G3F:CCGTGAAATATCTGCCAAGGTGTTG

G3R:CGACCAGGAGAACATGAACGACTTT

G4F:GCCCTCCTATTGGTACAAGATTGCT

G4R:GAGCACAAACACTACCGCATACATG

G5F:GCTTGTTTCTTGGTGTCTGAGGTCA

G5R:ATGGCAGAAATAGAAACCCGAGGTC

G6F:ATCCCAGTCTGTCAAATGCTCTCTC

G6R:CCAGATATGAAGAGGAAGGGATGTC

G7F:ATGCCTGGGCGTAATTGTCTCTTGA

G7R:CCAACTCTTCATCGTCACTCATCTC

G8F:GGGCGTTCACTTTAGACTTCCAATC

G8R:TTCCCTGGCGATACTCTCATAGACA

G9F:GGTCCGTCAACATCGAGAAAGAGAA

G9R:CACGATAAATATGCTGCCTGGGTCA

G10F:AGGGCGAGCATGGTCACATTTCAAA

G10R:GGGATATTCTGAGGGTTGTTGTGGA

G11F:GCCCAATAAACCTACAGAGGATGAG

G11R:ATGGCAGATTCAGGAGAGGGTTGTA

G12F:TGGCTTCTGTGGTGGTAGTTGTTGT

G12R:CGGCATTACCAAATATAGGCACACG

G13F:GGCACGCTCATTCTTACAACTCTTG

G13R:CAACCAATCAGATCGACGAGACTCA

G14-2F:GCGATGCCTTAATTGTTGCCAGAGT

G14-2R:TCCTGTGGAATGGTTGTTGGTGATG

G15F:GCAAACGAAAGAGCGGCTATAACAG

G15R:CTCCGTCATCGGTGTTATTACTAGG

G16F:GTCGGTTGTGGGTTTGGAAATGTAG

G16R:CTGGAAGCGAGTGTCAAGGTTAAAC

G17F:GCAGTTTGATTCATGTGTGGCAGAG

G17R:GCCATCCACCTCATATCCATTTCTC

G18F:GGATGATGGATTGTTGGACGAGAGA

G18R:GCTGCGGTCAGTACATGGTCATTTA

G19F:CGTGAAGACGCCATGAAGAGAAGTT

G19R:TCTGCCAGCCTCTGTGAACTTGTAA

G20F:TTGGCAGATGAGGACACCTTATACC

G20R:TTCCTGATTCCTCCACGCCATAACA

G21F:GGCAGCTAGTAAGGTCAATCTCAAC

G21R:TGGTTCCCTGGCGACGTTTACATAA

G22F:CGAAACGACAGGTTGAAGTGAGG

G22R:CAATGAATCGCCAATTAAGGAGG

G23F:CCATTTGTCAATCTCGGTTCTGC

G23R:GGAGGTGGGGTTTGAATACGAAG;

其中,引物序列方向均為5’到3’,F(xiàn)代表上游引物,R代表下游引物。

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