1.一種牡蠣皰疹病毒全基因組DNA富集方法,其特征在于:包括如下步驟:
1)組織樣品勻漿:取病貝外套膜和腮組織10-15g,經(jīng)過濾海水洗滌2-5次,然后用剪刀剪碎組織;加入90-135ml的滅菌海水,使用組織勻漿器勻漿組織;
2)低速離心去除雜質(zhì):將步驟1)中得到組織勻漿液依次在250g、1000g和4000g離心力下離心;每次離心后去除沉淀,取上清液;
3)基因組DNA提?。阂圆襟E2)中上清液180μL為靶物質(zhì),使用DNA提取試劑盒,提取DNA作為長片段PCR擴(kuò)增的模板;
4)長片段PCR擴(kuò)增:以步驟3)中提取得到DNA 1.0μL為模板,分別采用23對引物,在25μL體系中進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增;
5)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測:取步驟4)得到的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物4.5μL,加入1.5μL 的上樣緩沖液混合后,在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠中,110伏電壓下電泳50 min;凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照,存在約10Kb的特異性條帶,則確定成功擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣皰疹病毒全基因組DNA富集方法,其特征在于:步驟4)中,所述的25μL長片段PCR反應(yīng)體系組成分如下:5×PCR緩沖液 5μL、dNTP 1.5-3μL、GXL DNA 聚合酶 0.5-1μL、濃度為10.0 μmol/L的上游引物和下游引物各0.5-1μL、DNA模板1-2μL,另外加超純水12.5-15.5μL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牡蠣皰疹病毒全基因組DNA富集方法,其特征在于:步驟4)中,所述的長片段PCR的程序如下:首先94 ℃預(yù)變性1min;然后98 ℃變性10s,50-54℃變性15s,68℃延伸10min,35個(gè)循環(huán),4℃保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的牡蠣皰疹病毒全基因組DNA富集方法,其特征在于:步驟4)中,所述長片段PCR所用的23對引物序列為:
G1F:CCCGCACACATACGCACTACATAAA
G1R:GGTTTCCAGTAGGGTGTTTAAGAGC
G2F:GCAATCCAGTTCCCAAACCAATAGG
G2R:ATCGCTTCCTATCACCTTGTGGTCT
G3F:CCGTGAAATATCTGCCAAGGTGTTG
G3R:CGACCAGGAGAACATGAACGACTTT
G4F:GCCCTCCTATTGGTACAAGATTGCT
G4R:GAGCACAAACACTACCGCATACATG
G5F:GCTTGTTTCTTGGTGTCTGAGGTCA
G5R:ATGGCAGAAATAGAAACCCGAGGTC
G6F:ATCCCAGTCTGTCAAATGCTCTCTC
G6R:CCAGATATGAAGAGGAAGGGATGTC
G7F:ATGCCTGGGCGTAATTGTCTCTTGA
G7R:CCAACTCTTCATCGTCACTCATCTC
G8F:GGGCGTTCACTTTAGACTTCCAATC
G8R:TTCCCTGGCGATACTCTCATAGACA
G9F:GGTCCGTCAACATCGAGAAAGAGAA
G9R:CACGATAAATATGCTGCCTGGGTCA
G10F:AGGGCGAGCATGGTCACATTTCAAA
G10R:GGGATATTCTGAGGGTTGTTGTGGA
G11F:GCCCAATAAACCTACAGAGGATGAG
G11R:ATGGCAGATTCAGGAGAGGGTTGTA
G12F:TGGCTTCTGTGGTGGTAGTTGTTGT
G12R:CGGCATTACCAAATATAGGCACACG
G13F:GGCACGCTCATTCTTACAACTCTTG
G13R:CAACCAATCAGATCGACGAGACTCA
G14-2F:GCGATGCCTTAATTGTTGCCAGAGT
G14-2R:TCCTGTGGAATGGTTGTTGGTGATG
G15F:GCAAACGAAAGAGCGGCTATAACAG
G15R:CTCCGTCATCGGTGTTATTACTAGG
G16F:GTCGGTTGTGGGTTTGGAAATGTAG
G16R:CTGGAAGCGAGTGTCAAGGTTAAAC
G17F:GCAGTTTGATTCATGTGTGGCAGAG
G17R:GCCATCCACCTCATATCCATTTCTC
G18F:GGATGATGGATTGTTGGACGAGAGA
G18R:GCTGCGGTCAGTACATGGTCATTTA
G19F:CGTGAAGACGCCATGAAGAGAAGTT
G19R:TCTGCCAGCCTCTGTGAACTTGTAA
G20F:TTGGCAGATGAGGACACCTTATACC
G20R:TTCCTGATTCCTCCACGCCATAACA
G21F:GGCAGCTAGTAAGGTCAATCTCAAC
G21R:TGGTTCCCTGGCGACGTTTACATAA
G22F:CGAAACGACAGGTTGAAGTGAGG
G22R:CAATGAATCGCCAATTAAGGAGG
G23F:CCATTTGTCAATCTCGGTTCTGC
G23R:GGAGGTGGGGTTTGAATACGAAG;
其中,引物序列方向均為5’到3’,F(xiàn)代表上游引物,R代表下游引物。