本發(fā)明涉及一種微生物修復劑及其制備方法，尤其涉及一種固定化微生物溢油修復劑及其制備方法。
背景技術：
隨著海上石油開發(fā)和海上運輸業(yè)的快速發(fā)展，井噴、運輸船舶的石油泄漏、撞沉船以及輸油管道的泄漏等造成的溢油事故也日益頻發(fā)。而溢油事故發(fā)生后，雖經物理方法(如圍欄回收等)、化學方法(如噴灑消油劑等)可清除部分表面溢油，但是，殘存的石油烴長期滯留在海洋環(huán)境中，對海洋生態(tài)系統(tǒng)及人體健康會造成巨大的持久性損害。
隨著研究的深入，國內外研究者發(fā)現(xiàn)在海水和淡水中生長有200多種烴類降解微生物，包括細菌、真菌及藻類，其密度及繁殖速度與水域的油污染程度密切相關。因此，石油污染的生物修復技術也應運而生，目前主要以微生物修復為主，是國際上公認的高效修復石油污染的新技術。這種微生物修復技術中的微生物能適應各種復雜的生態(tài)環(huán)境，繁殖代謝能力極強，能快速降解石油中各種有毒物質，而且具有價格低廉、環(huán)境友好等諸多優(yōu)勢。采用該技術處理物理和化學方法無法清除的溢油是恢復生態(tài)環(huán)境的最佳途徑，對保護我國海洋生態(tài)環(huán)境，維持海洋資源的可持續(xù)性發(fā)展具有重大的科學意義和應用價值。
自上世紀七十年代開始，加入適當?shù)奈⑸镏卫硎臀廴揪捅徽J為是一個有力的策略，試驗中成功的例子如：1990年利用Alpha BioSea處理德克薩斯州海岸的原油泄漏，2000年利用Terra-zyme(TM)處理日本Nakhodka港口原油泄漏，1989年夏到1991年應用投加營養(yǎng)劑和高效烴降解菌對阿拉斯加Exxon Valdez王子海灣由于油輪泄露造成的污染進行的處理等，都取得了非常明顯的效果。
但是，在海洋溢油微生物修復過程中，卻依然存在著有效菌株流失嚴重，修復效率大幅度下降等問題。所以，針對海洋溢油修復所特有的處理環(huán)境，需要采用微生物固定化技術。固定化微生物技術與其它生物修復技術相比，能夠保持微生物高密度、高活性，減輕或消除微生物的流失，處理效率高，對環(huán)境的耐受力強，反應易控制，能夠有效提高目標區(qū)域內海洋溢油污染微生物菌劑的修復效率。
其中，包埋固定化技術作為固定化方法的一種，與吸附法、交聯(lián)法、共價結合法等其他固定化技術相比，由于制備方法簡單易操作，反應條件溫和易實現(xiàn)，微生物不易泄漏，穩(wěn)定性和重復利用性好，并且有較高的微生物活性和細胞容量，固定化效率能達到70％以上，目前應用較為廣泛。包括海藻酸鈉-CaCl2包埋與聚乙烯醇-H3BO3包埋這兩種是最常用的包埋固定化方法。而相對于海藻酸鈉-CaCl2包埋法，聚乙烯醇-H3BO3制備的固定化制劑雖機械強度較高、使用壽命較長，但聚乙烯醇因附聚作用強而成球較為困難，且用于交聯(lián)聚乙烯醇的飽和硼酸溶液對微生物的毒害大，會顯著降低在固定化后微生物的活性。海藻酸鈉-CaCl2包埋法雖反應條件溫和，包埋材料對生物無毒害，包埋的細胞具有較高的活性，但制劑機械強度較低、傳質性較差。因此，兩者均具有各自的優(yōu)缺點，并不能達到一種較為理想的狀態(tài)。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中存在的上述問題，提出了一種機械強度高、傳質性好、包埋的微生物活性高的固定化微生物溢油修復劑。
本發(fā)明的目的可通過下列技術方案來實現(xiàn)：所述修復劑以海藻酸鈉-CaCl2-生物基活性碳為載體包埋微生物制成，包埋的微生物的濃度為8×108-6×109cell/g。
本發(fā)明在現(xiàn)有的海藻酸鈉-CaCl2包埋法的基礎上，首次將生物基活性碳添加至海藻酸鈉-CaCl2包埋固定化載體中，提高了修復劑的機械強度，且由于生物基活性碳的多孔結構，可大大提高修復劑的傳質性，使營養(yǎng)物質更容易被微生物攝取，極大的提高了微生物的活性及降解效率。
在上述的一種固定化微生物溢油修復劑中，所述生物基活性碳占修復劑的質量百分比為0.8-1.5wt％。
在上述的一種固定化微生物溢油修復劑中，所述生物基活性碳為漢麻桿基活性碳。漢麻是一種傳統(tǒng)的可再生經濟作物，在我國有大面積種植，其表皮、籽實被廣泛應用于服裝、造紙、食品、醫(yī)藥等行業(yè)，而大量的漢麻桿被廢棄。因此，用漢麻桿為原料制備活性碳既有實際應用價值，也可減少資源浪費。且漢麻桿內部粗糙多孔是優(yōu)良的活性碳制備前驅體，得到的漢麻桿基活性碳具有多孔結構，可提高修復劑的傳質性，另外，將漢麻桿基活性碳加入到海藻酸鈉-CaCl2包埋法中，以提高制劑的機械強度。
在上述的一種固定化微生物溢油修復劑中，所述微生物為石油烴降解菌，進一步優(yōu)選為對1g/L原油的降解效率達50％以上的石油烴降解菌，如：銅綠假單胞菌D-1，芽孢桿菌ASS-1中的至少一種。
本發(fā)明另一個目的在于提供上述固定化微生物溢油修復劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
S1、將生物基活性碳與微生物種子液混合進行吸附，形成混合懸濁液；
S2、在上述混合懸濁液中加入30～40℃的已滅菌的海藻酸鈉溶液，混勻后得到粘稠狀混合液，粘稠狀混合液加入到CaCl2溶液中分散成球，交聯(lián)12h～24h，得到固定化微生物溢油修復劑。
本發(fā)明修復劑的制備方法簡單易操作，反應條件溫和，制得的修復劑中微生物不易泄漏，穩(wěn)定性和重復利用性好，并且有較高的微生物活性和細胞容量，對石油烴的降解率可達81-95％。
在上述的一種固定化微生物溢油修復劑的制備方法中，步驟S1中所述生物基活性碳與微生物種子液的質量比1:3～1:6。
在上述的一種固定化微生物溢油修復劑的制備方法中，步驟S1中所述生物基活性碳為漢麻桿基活性碳，粒徑為100～250目。
在上述的一種固定化微生物溢油修復劑的制備方法中，步驟S1中所述微生物種子液為石油烴降解菌，微生物種子液的濃度為1.5×1010～6.5×1010cell/mL。
在上述的一種固定化微生物溢油修復劑的制備方法中，步驟S2中所述混合懸濁液與海藻酸鈉溶液的體積比為1:10，海藻酸鈉溶液的濃度為4wt％～6wt％。
在上述的一種固定化微生物溢油修復劑的制備方法中，步驟S2中所述CaCl2溶液與海藻酸鈉溶液的體積比為5:1，CaCl2溶液的濃度為2.5wt％～3.5wt％。
作為優(yōu)選，所述漢麻桿基活性碳的制備過程為：
將原料漢麻桿清理、篩揀、干燥、粉碎，過25～35目篩得到漢麻桿粒料，將漢麻桿粒料加入到質量分數(shù)為5-15％的檸檬酸溶液中，攪拌混勻，在室溫下浸漬0.5～1.5h，然后進行活化，活化后倒入氫氧化鈉溶液中浸泡15-30min，浸泡后洗滌至pH中性，然后干燥、粉碎，過100～250目篩，得到漢麻桿基活性碳。
作為優(yōu)選，所述漢麻桿粒料與檸檬酸溶液的質量比為1:2～1:5。
作為優(yōu)選，所述活化溫度為350～700℃，保溫時間為30～90min；從室溫升至所需活化溫度的升溫速率為40～60℃/min。
作為優(yōu)選，所述氫氧化鈉溶液為10mol/L的氫氧化鈉與水按體積比為1:8～10配置而成。
作為優(yōu)選，所述浸泡的溫度為70～80℃。
作為優(yōu)選，所述干燥的溫度為100～120℃，時間為3～5h。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下幾個優(yōu)點：
1.本發(fā)明首次將生物基活性碳添加至海藻酸鈉-CaCl2包埋固定化載體中，提高了提高修復劑的機械強度，且由于生物基活性碳的多孔結構，大大提高了修復劑傳質性，使營養(yǎng)物質更容易被微生物攝取，極大的提高了微生物的活性及降解效率。
2.本發(fā)明生物基活性碳為漢麻桿基活性碳，與一般的活性碳相比，原料來源更為廣泛，價格更為低廉，且使固定化微生物的性能更優(yōu)。
3.本發(fā)明修復劑的制備方法簡單易操作，反應條件溫和，制得的修復劑中微生物不易泄漏，穩(wěn)定性和重復利用性好，并且有較高的微生物活性和細胞容量，對石油烴的降解率可達81-95％。
具體實施方式
以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實施例。
實施例1：
漢麻桿基活性碳的制備：將原料漢麻桿清理、篩揀、干燥、粉碎，過25目篩，備用。稱取上述粉碎好的漢麻桿，按漢麻桿與檸檬酸溶液的質量比1:2加入到質量分數(shù)為5％的檸檬酸溶液中，攪拌混勻，在室溫下浸漬1.5h。再將浸漬好的料液放入馬福爐中，以40℃/min的升溫速率升溫至350℃下保溫活化90min。將活化好的樣品從馬福爐中取出，冷卻后，將樣品倒入10mol/L的氫氧化鈉與水按體積比為1:8配制而成的氫氧化鈉溶液中浸泡15min。再將樣品用70℃熱水洗滌至pH中性，將洗滌好的樣品放入電熱鼓風烘箱中，在100℃干燥3h，取出后放在干燥器中冷卻。最后將制得的活化后的樣品粉碎過100目篩，制得漢麻桿基活性碳。
固定化微生物溢油修復劑的制備：將上述制得的漢麻桿基活性碳與濃度為1.5×1010cell/mL的銅綠假單胞菌D-1按質量比1:6混合進行吸附，吸附飽和后形成混合懸濁液。取10mL上述混合懸濁液并加入100mL的30℃的已滅菌的濃度為4wt％的海藻酸鈉溶液，混勻后得到粘稠狀混合液，粘稠狀混合液用注射器吸取并注入到500mL的濃度為2.5wt％的CaCl2溶液中分散成球，交聯(lián)24h，得到固定化微生物溢油修復劑。
經檢測，該固定化微生物溢油修復劑中，生物基活性碳占修復劑的質量百分比為0.9wt％，包埋的微生物的濃度為1.1×109cell/g。將其用于石油烴的降解，對1g/L石油烴的降解率為90％。
實施例2：
漢麻桿基活性碳的制備：將原料漢麻桿清理、篩揀、干燥、粉碎，過30目篩，備用。稱取上述粉碎好的漢麻桿，按漢麻桿與檸檬酸溶液的質量比1:3加入到質量分數(shù)為8％的檸檬酸溶液中，攪拌混勻，在室溫下浸漬1h。再將浸漬好的料液放入馬福爐中，以45℃/min的升溫速率升溫至400℃下保溫活化80min。將活化好的樣品從馬福爐中取出，冷卻后，將樣品倒入10mol/L的氫氧化鈉與水按體積比為1:8配制而成的氫氧化鈉溶液中浸泡20min。再將樣品用75℃熱水洗滌至pH中性，將洗滌好的樣品放入電熱鼓風烘箱中，在105℃干燥4h，取出后放在干燥器中冷卻。最后將制得的活化后的樣品粉碎過150目篩，制得漢麻桿基活性碳。
固定化微生物溢油修復劑的制備：將上述制得的漢麻桿基活性碳與濃度為3×1010cell/mL的銅綠假單胞菌D-1按質量比1:5混合進行吸附，吸附飽和后形成混合懸濁液。取10mL上述混合懸濁液并加入100mL的32℃的已滅菌的濃度為4.5wt％的海藻酸鈉溶液，混勻后得到粘稠狀混合液，粘稠狀混合液用注射器吸取并注入到500mL的濃度為2.5wt％的CaCl2溶液中分散成球，交聯(lián)20h，得到固定化微生物溢油修復劑。
經檢測，該固定化微生物溢油修復劑中，生物基活性碳修復劑的質量百分比為1.2wt％，包埋的微生物的濃度為2.0×109cell/g。將其用于石油烴的降解，對1g/L石油烴的降解率為85％。
實施例3：
漢麻桿基活性碳的制備：將原料漢麻桿清理、篩揀、干燥、粉碎，過30目篩，備用。稱取上述粉碎好的漢麻桿，按漢麻桿與檸檬酸溶液的質量比1:3加入到質量分數(shù)為10％的檸檬酸溶液中，攪拌混勻，在室溫下浸漬1h。再將浸漬好的料液放入馬福爐中，以50℃/min的升溫速率升溫至500℃下保溫活化60min。將活化好的樣品從馬福爐中取出，冷卻后，將樣品倒入10mol/L的氫氧化鈉與水按體積比為1:9配制而成的氫氧化鈉溶液中浸泡20min。再將樣品用75℃熱水洗滌至pH中性，將洗滌好的樣品放入電熱鼓風烘箱中，在110℃干燥4h，取出后放在干燥器中冷卻。最后將制得的活化后的樣品粉碎過150目篩，制得漢麻桿基活性碳。
固定化微生物溢油修復劑的制備：將上述制得的漢麻桿基活性碳與濃度為5×1010cell/mL的銅綠假單胞菌D-1按質量比1:5混合進行吸附，吸附飽和后形成混合懸濁液。取10mL上述混合懸濁液并加入100mL的35℃的已滅菌的濃度為5wt％的海藻酸鈉溶液，混勻后得到粘稠狀混合液，粘稠狀混合液用注射器吸取并注入到500mL的濃度為3wt％的CaCl2溶液中分散成球，交聯(lián)18h，得到固定化微生物溢油修復劑。
經檢測，該固定化微生物溢油修復劑中，生物基活性碳占修復劑的質量百分比為1.4wt％，包埋的微生物的濃度為3.5×109cell/g。將其用于石油烴的降解，對1g/L石油烴的降解率為91％。
實施例4：
漢麻桿基活性碳的制備：將原料漢麻桿清理、篩揀、干燥、粉碎，過35目篩，備用。稱取上述粉碎好的漢麻桿，按漢麻桿與檸檬酸溶液的質量比1:4加入到質量分數(shù)為12％的檸檬酸溶液中，攪拌混勻，在室溫下浸漬1h。再將浸漬好的料液放入馬福爐中，以55℃/min的升溫速率升溫至600℃下保溫活化50min。將活化好的樣品從馬福爐中取出，冷卻后，將樣品倒入10mol/L的氫氧化鈉與水按體積比為1:9配制而成的氫氧化鈉溶液中浸泡25min。再將樣品用80℃熱水洗滌至pH中性，將洗滌好的樣品放入電熱鼓風烘箱中，在115℃干燥3h，取出后放在干燥器中冷卻。最后將制得的活化后的樣品粉碎過200目篩，制得漢麻桿基活性碳。
固定化微生物溢油修復劑的制備：將上述制得的漢麻桿基活性碳與濃度為6×1010cell/mL的銅綠假單胞菌D-1按質量比1:4混合進行吸附，吸附飽和后形成混合懸濁液。取10mL上述混合懸濁液并加入100mL的38℃的已滅菌的濃度為5.5wt％的海藻酸鈉溶液，混勻后得到粘稠狀混合液，粘稠狀混合液用注射器吸取并注入到500mL的濃度為3wt％的CaCl2溶液中分散成球，交聯(lián)15h，得到固定化微生物溢油修復劑。
經檢測，該固定化微生物溢油修復劑中，生物基活性碳占修復劑的質量百分比為1.0wt％，包埋的微生物的濃度為4.0×109cell/g。將其用于石油烴的降解，對1g/L石油烴的降解率為89％。
實施例5：
漢麻桿基活性碳的制備：將原料漢麻桿清理、篩揀、干燥、粉碎，過35目篩，備用。稱取上述粉碎好的漢麻桿，按漢麻桿與檸檬酸溶液的質量比1:5加入到質量分數(shù)為5％的檸檬酸溶液中，攪拌混勻，在室溫下浸漬0.5h。再將浸漬好的料液放入馬福爐中，以60℃/min的升溫速率升溫至700℃下保溫活化30min。將活化好的樣品從馬福爐中取出，冷卻后，將樣品倒入10mol/L的氫氧化鈉與水按體積比為1:10配制而成的氫氧化鈉溶液中浸泡30min。再將樣品用80℃熱水洗滌至pH中性，將洗滌好的樣品放入電熱鼓風烘箱中，在120℃干燥3h，取出后放在干燥器中冷卻。最后將制得的活化后的樣品粉碎過250目篩，制得漢麻桿基活性碳。
固定化微生物溢油修復劑的制備：將上述制得的漢麻桿基活性碳與濃度為6.5×1010cell/mL的銅綠假單胞菌D-1按質量比1:3混合進行吸附，吸附飽和后形成混合懸濁液。取10mL上述混合懸濁液并加入100mL的40℃的已滅菌的濃度為6wt％的海藻酸鈉溶液，混勻后得到粘稠狀混合液，粘稠狀混合液用注射器吸取并注入到500mL的濃度為3.5wt％的CaCl2溶液中分散成球，交聯(lián)12h，得到固定化微生物溢油修復劑。
經檢測，該固定化微生物溢油修復劑中，生物基活性碳占修復劑的質量百分比為1.3wt％，包埋的微生物的濃度為5.1×109cell/g。將其用于石油烴的降解，對1g/L石油烴的降解率為93％。
對比例1-5：
對比例1-5與實施例1-5的區(qū)別僅在于，對比例1-5中不添加生物基活性碳，修復劑僅由海藻酸鈉-CaCl2包埋微生物制成。將其用于石油烴的降解，對1g/L石油烴的降解率為67-71％。
在上述實施例及其替換方案中，所述石油烴降解菌還可以為芽孢桿菌ASS-1。
鑒于本發(fā)明方案實施例眾多，各實施例實驗數(shù)據(jù)龐大眾多，不適合于此處逐一列舉說明，但是各實施例所需要驗證的內容和得到的最終結論均接近，對石油烴的降解率可達81-95％。故而此處不對各個實施例的驗證內容進行逐一說明，僅以實施例1-5作為代表說明本發(fā)明申請優(yōu)異之處。
本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權利要求書所定義的范圍。
盡管對本發(fā)明已作出了詳細的說明并引證了一些具體實施例，但是對本領域熟練技術人員來說，只要不離開本發(fā)明的精神和范圍可作各種變化或修正是顯然的。