本發(fā)明涉及天然高分子領(lǐng)域，具體涉及一種幾丁質(zhì)脫乙?；负推錁?gòu)建方法以及納米幾丁質(zhì)的制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

(1)幾丁質(zhì)和殼聚糖的分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

幾丁質(zhì)(俗稱，甲殼質(zhì)、甲克素、殼多糖)是自然界中唯一帶正電荷的天然高分子聚合物，屬直鏈氨基多糖，其單體結(jié)構(gòu)為(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖，如(Ⅰ)所示。

幾丁質(zhì)的主要來(lái)源是蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動(dòng)物的外殼與軟件動(dòng)物的器官(例如烏賊的軟骨)，以及某些真菌類的細(xì)胞壁等。其蘊(yùn)藏量在地球上的天然高分子中占第二位，估計(jì)每年自然界生物的合成量可達(dá)幾百億噸,僅次于纖維素。一般由蝦蟹殼提煉的幾丁質(zhì)，約含有15％的胺基(-NH₂)與85％的乙?；?-COCH₃)。幾丁質(zhì)的分子量一般在100萬(wàn)以上(1000KDa)，在自然條件下不溶于水，也不溶于酸堿或有機(jī)溶劑，因此很難被有效利用。殼聚糖是幾丁質(zhì)的衍生物，在一定條件下，幾丁質(zhì)經(jīng)降解和脫酰反應(yīng)，50％以上的酰基被脫去，分子量小到一定程度時(shí)，其產(chǎn)物能溶解在弱酸中，這個(gè)產(chǎn)物稱之為殼聚糖(或甲殼胺)¹，其分子結(jié)構(gòu)包括：氨基葡萄糖【GlcN，(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖)】和N-乙酰葡萄糖【GlcNAc)(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖】?jī)煞N單體結(jié)構(gòu)，如(Ⅱ)所示。

在弱酸中，氨基質(zhì)子化后，殼聚糖便成為帶正電荷的聚合物，如(Ⅲ)所示，從而具有生物活性，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、植物病蟲害防治等領(lǐng)域。

理論講，不大可能通過(guò)脫乙?；姆椒ㄉa(chǎn)100％脫乙酰度的殼聚糖。目前所有殼聚糖的產(chǎn)品都是部分脫乙酰，每個(gè)糖基上也許都有N-乙?；?，也許不一定都有N—乙?；?。凡N—乙酰度在50％以上產(chǎn)品，仍應(yīng)稱之為幾丁質(zhì)¹，因?yàn)樗隙ú蝗苡谙∷嶂?。幾丁質(zhì)脫乙酰化的程度越高，發(fā)揮的生理效應(yīng)也越強(qiáng)。當(dāng)幾丁質(zhì)脫乙酰度達(dá)到90％以上，國(guó)際醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)食品學(xué)會(huì)將此物質(zhì)命名為除糖、蛋白質(zhì)、脂及、維生素和礦物質(zhì)五大生命要素后的第六大生命要素，因此越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。但是，目前很多文獻(xiàn)報(bào)道中“幾丁質(zhì)”或“甲克素、甲殼質(zhì)”在各方面的應(yīng)用，多將幾丁質(zhì)和殼聚糖混為一談，造成概念上的混亂，誤導(dǎo)人們對(duì)這兩種產(chǎn)品的使用。

(2)幾丁質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)

和纖維素一樣，天然幾丁質(zhì)也是以纖維狀形式存在，通過(guò)分子間和分子內(nèi)的氫鍵將N-乙酰葡萄糖分子緊密結(jié)合在一起，形成具有晶體和非晶體兩種結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)纖維²。幾丁質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)有三種，即α，β和γ型^3，4。α-幾丁質(zhì)(α-Chitin)由兩條反向平行鏈組成，β-幾丁質(zhì)(β-Chitin)由兩條同向平行鏈組成，γ-幾丁質(zhì)(γ-Chitin)由三條鏈組成，兩條同向，一條反向。如(Ⅳ)所示，其中(A)為α-幾丁質(zhì)，(B)為β-幾丁質(zhì)。

不同來(lái)源的幾丁質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)也不相同。蝦蟹外殼主要是α-型，β-型幾丁質(zhì)是魷魚的羽狀殼中，真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)是γ-型且結(jié)晶度較低。α-型和β-型幾丁質(zhì)最豐富，因結(jié)晶度高，最穩(wěn)定，不易熔化，不易溶解，同時(shí)也不易溶于一般有機(jī)溶劑。不同分離純化的天然α-，β-幾丁質(zhì)在C-2位上連接有胺基，可在酸性條件下質(zhì)子化。α-型幾丁質(zhì)資源豐富，易于工業(yè)化上產(chǎn)。

(3)幾丁質(zhì)的合成

1)幾丁質(zhì)和殼聚糖的合成方法

純凈幾丁質(zhì)的制備一般不需要復(fù)雜的工序和化學(xué)反應(yīng)。目前常用的方法是將原料(如蝦或蟹殼)用稀的氫氧化鈉液除去蛋白質(zhì)，然后用鹽酸除去鈣鹽，最后，烘干粉碎就是幾丁質(zhì)了。幾丁質(zhì)低聚糖的制備方法有酸降解法、酶法、氧化降解法、合成法等⁵。傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)殼聚糖是化學(xué)脫酰反應(yīng)或水解法，其原理是通過(guò)水解破壞幾丁質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(主要是破壞非晶體結(jié)構(gòu)部分)，使分子鍵斷裂，分子鏈中部分N-乙酰葡萄糖脫酰，提高其親水性¹。但化學(xué)脫酰或水解法反應(yīng)條件要求較高，不宜控制，且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，耗能，環(huán)境污染(廢水，化學(xué)廢料)，殼聚糖工藝生產(chǎn)流程^6，7，如(Ⅴ)所示。利用酶解法可解決這些問題，包括使用甲殼素酶，殼聚糖酶和溶菌酶進(jìn)行水解。但此類酶價(jià)格昂貴且不易獲得，造成產(chǎn)品成本過(guò)高^8，9。

2)已報(bào)導(dǎo)納米幾丁質(zhì)的制備方法

近年來(lái)，用鹽酸水解制備納米幾丁質(zhì)的方法有很多報(bào)道^2,10,11。有報(bào)道稱，酸水解制備的納米幾丁質(zhì)顆粒大小為寬10-15nm，長(zhǎng)200-500nm²，也有報(bào)導(dǎo)納米顆粒在150-800nm長(zhǎng)，寬5-70nm¹¹。納米幾丁質(zhì)顆粒依然偏大，其產(chǎn)品的脫乙酰度(電荷電量)鮮有報(bào)道，最佳工業(yè)化生產(chǎn)納米幾丁質(zhì)的條件也未見報(bào)道。在如此嚴(yán)厲的條件下用酸水解幾丁質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生大量的浪費(fèi)，也會(huì)對(duì)工業(yè)帶來(lái)?yè)p失。因此，迫切需要研發(fā)出一種反應(yīng)條件溫和的、浪費(fèi)少的新型的幾丁質(zhì)納米化方法。

(4)幾丁質(zhì)(chitin)及殼聚糖(chitosan)的應(yīng)用

由于幾丁質(zhì)的天然性質(zhì)和獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，越來(lái)越受到科學(xué)界的重視。大量研究表明，幾丁質(zhì)具有無(wú)毒、生物相容、生物可降解性等性，但幾丁質(zhì)及其衍生物產(chǎn)品在醫(yī)藥、生物、農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，主要是指殼聚糖或低分子量的幾丁寡糖，如用于廢水處理^12,13，食品和飼料^14,15，和藥物/生物活性物質(zhì)傳輸^16,17,18等的物質(zhì)。幾丁質(zhì)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用作病蟲害防治^19,20,21，種子包衣，水果和蔬菜的涂層^{22,23,24,25,26}，以及用于提高植物生長(zhǎng)，誘發(fā)植物抗性和提高植物免疫力作用的活性物質(zhì)^27,28,29,30無(wú)一不是指殼聚糖。很多中文文獻(xiàn)在報(bào)道或引用外文資料時(shí)，簡(jiǎn)單地把chitosan(殼聚糖)當(dāng)做幾丁質(zhì)(chitin)，造成了學(xué)術(shù)名稱的混亂和應(yīng)用上的誤導(dǎo)。但納米幾丁質(zhì)除了繼承幾丁質(zhì)的基本性質(zhì)外，還有很高的比表面積、結(jié)晶度和聚陽(yáng)離子的性質(zhì)，被視為綜合性能優(yōu)異的天然高分子材料。利用水解聯(lián)合特異性脫乙酰酶制備成納米的幾丁質(zhì)，比表面積較大且攜帶一定量的聚陽(yáng)離子，其納米顆粒具有顯著的生物活性^31,32,33。因此它將成為新一類植物增長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，或新型農(nóng)藥的輔助劑。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的現(xiàn)有技術(shù)的問題是：現(xiàn)有的化學(xué)脫?；蛩饷擋?，反應(yīng)條件要求較高，不宜控制，且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，耗能，環(huán)境污染(廢水，化學(xué)廢料)；而現(xiàn)有的酶法脫酰，包括甲殼素酶，殼聚糖酶和溶菌酶，其酶價(jià)格昂貴且不易獲得，造成產(chǎn)品成本過(guò)高，而且得到的納米幾丁質(zhì)顆粒偏大，脫乙酰度也是良莠不齊，更是不易于應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種幾丁質(zhì)脫乙?；负推錁?gòu)建方法，以及由幾丁質(zhì)脫乙酰基酶制備得到的納米幾丁質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用。

具體而言，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案。

一方面，本發(fā)明提供了一種幾丁質(zhì)脫乙?；?，所述幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示，或者在SEQ ID NO.2中限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有幾丁質(zhì)脫乙?；富钚缘挠蒘EQ ID NO.2衍生的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選的，所述幾丁質(zhì)所乙?；妇幋a的基因核苷酸序列為SEQ ID NO.1。

另一方面，本發(fā)明提供了一種幾丁質(zhì)脫乙?；傅臉?gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)：構(gòu)建幾丁質(zhì)脫乙酰酶重組表達(dá)載體質(zhì)粒；

(2)：將步驟(1)所得的重組表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物；

(3)：分離純化步驟(2)所得到的重組蛋白，即SEQ ID NO.2中氨基酸所示的幾丁質(zhì)脫乙酰酶；或者在SEQ ID NO.2中限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸且具有幾丁質(zhì)脫乙?；富钚缘挠蒘EQ ID NO.2衍生的蛋白質(zhì)。

第三方面，本發(fā)明提供了以上所述的幾丁質(zhì)脫乙?；冈谥苽浼{米幾丁質(zhì)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

第四方面，本發(fā)明提供了一種納米幾丁質(zhì)的制備方法，包括如下步驟：

(1)在酸的作用下，水解含有幾丁質(zhì)的原料，然后去除酸，加入溶劑后得到預(yù)制備的納米幾丁質(zhì)懸浮液；

(2)向納米幾丁質(zhì)懸浮液中加入幾丁質(zhì)脫乙?；福撘阴５玫郊{米幾丁質(zhì)。

優(yōu)選的，步驟(1)中，水解溫度為70-90℃，優(yōu)選為70-85℃，水解時(shí)間為2-4h，優(yōu)選為2-3h。

優(yōu)選的，步驟(1)中所述酸選自鹽酸、硫酸、硝酸中的一種，優(yōu)選為鹽酸，所述鹽酸的濃度優(yōu)選為3M-5M。

優(yōu)選的，步驟(1)加入溶劑后還包括超聲破碎的步驟，得到預(yù)制備的納米幾丁質(zhì)懸浮液，所述溶劑優(yōu)選為去離子水。

優(yōu)選的，步驟(2)中，脫乙酰溫度為50-60℃，反應(yīng)時(shí)間為30-60min。

優(yōu)選的，步驟(2)中幾丁質(zhì)脫乙酰酶與步驟(1)中的納米幾丁質(zhì)懸浮液的比例為(1-10):(3000-5000)(wt/wt)。

優(yōu)選的，步驟(2)中加入催化劑進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)，所述催化劑優(yōu)選為氯化鈷。

第五方面，本發(fā)明提供了一種納米幾丁質(zhì)，其采用以上任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到。

第六方面，本發(fā)明提供了以上所述的納米幾丁質(zhì)在廢水處理、食品和飼料、制藥、農(nóng)藥制劑、肥料和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明所取得的有益效果為：本發(fā)明在pVT-CDase的作用下，生產(chǎn)納米幾丁質(zhì)，其脫乙酰化程度較高，納米粒度較小，且均勻，同時(shí)縮短酸解過(guò)程，達(dá)到節(jié)省成本，提高效能和產(chǎn)品質(zhì)量的功效。本發(fā)明的制備方法，反應(yīng)條件溫和，避免了浪費(fèi)，對(duì)應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)上生產(chǎn)納米幾丁質(zhì)具有極大的益處，而且、對(duì)環(huán)境保護(hù)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義和市場(chǎng)前景，并能取得巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例一中pVT-CDase基因的瓊脂糖電泳結(jié)果，其中1為pET19(b)/pVT-CDase，2為酶切后克隆片段，M為DNA marker大小。

圖2為實(shí)施例一表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果，其中1為蛋白質(zhì)marker的分子量，2，3，4分別為誘導(dǎo)表達(dá)的裂解上清液的SDS-PAGE結(jié)果圖。

圖3為實(shí)施例一制備得到的納米幾丁質(zhì)的原子力顯微鏡圖。

圖4為實(shí)施例一制備得到的納米幾丁質(zhì)的Zeta potential。

圖5為實(shí)施例一制備得到的納米幾丁質(zhì)的電導(dǎo)率及電荷密度測(cè)定結(jié)果圖。

圖6為對(duì)比例一經(jīng)酸水解制備得到的納米幾丁質(zhì)的原子力顯微鏡圖。

圖7為對(duì)比例二經(jīng)酶解再酸解之后得到的納米幾丁質(zhì)的原子力顯微鏡圖。

具體實(shí)施方式

如上所述，本發(fā)明的目的在于，提供一種特異性幾丁質(zhì)脫乙?；讣安捎脦锥≠|(zhì)脫乙?；钢苽浼{米幾丁質(zhì)的方法和應(yīng)用。

其中，在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述幾丁質(zhì)脫乙?；傅陌被嵝蛄袨镾EQ ID NO.2所示，或者在SEQ ID NO.2中限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有幾丁質(zhì)脫乙?；富钚缘挠蒘EQ ID NO.2衍生的蛋白質(zhì)。

在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述納米幾丁質(zhì)的制備方法包括如下步驟：

(1)在酸的作用下，化學(xué)水解含有幾丁質(zhì)的原料，化學(xué)水解的產(chǎn)物經(jīng)離心、透析除去游離的酸，加入去離子水，并進(jìn)行超聲破碎，使幾丁質(zhì)顆粒均勻分散在去離子水中，得到預(yù)制備的納米幾丁質(zhì)懸浮液；

(2)向納米幾丁質(zhì)懸浮液中加入幾丁質(zhì)脫乙?；?，在催化劑的作用下，進(jìn)行脫乙酰得到納米幾丁質(zhì)。

本發(fā)明首先通過(guò)酸水解，將較大的幾丁質(zhì)纖維降解為微納米級(jí)別的顆粒，進(jìn)一步用幾丁質(zhì)脫乙酰酶進(jìn)行脫?；苽涞玫缴锘钚愿鼜?qiáng)的納米晶須。

本發(fā)明所用到的原料可以為任何含有幾丁質(zhì)的原料，優(yōu)選為蝦皮。

下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)的說(shuō)明。但是，這些實(shí)施例僅是用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。

其中，本發(fā)明中用到的試劑、儀器的廠家及型號(hào)如下：

CoCl₂，分析純，廠家：天津市盛鑫偉業(yè)貿(mào)易有限公司；

原子力顯微鏡，型號(hào)MFP-3D-Bio廠家：牛津儀器Asylum Research；

Zeta電位分析儀，型號(hào)Nano ZS90，廠家：Malvern Instruments Ltd.

PCR儀，型號(hào)T100，美國(guó)Bio-Rad；

異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，

氨芐青霉素，分析純，購(gòu)自：上海勵(lì)瑞生物科技有限公司；

質(zhì)粒，包括pUC57，pET19，購(gòu)自：南京金斯瑞生物科技有限公司；

蝦皮幾丁質(zhì)，購(gòu)自：Sigma Aldrich。

實(shí)施例一

(一)特異性脫乙酰酶的基因構(gòu)建(pVT-CDase)、基因克隆和蛋白表達(dá)

1.特異性脫乙酰酶基因的構(gòu)建

pVT-CDase基因來(lái)源于菜豆炭疽病原真菌(Colletotrichum lindemuthianum)基因序列，記載在GenBank(GenBank:AY633657.1.protein ID:AAT68493.1)中，采用重組基因方法，經(jīng)基因優(yōu)化，構(gòu)建用于細(xì)菌表達(dá)的基因序列。基因重組、基因優(yōu)化和基因克隆構(gòu)建的質(zhì)粒由南京金斯瑞公司完成并保存。基因序列(SEQ ID No.1)為：

TATACCATGGGCCACTTTAGCACGCTGTTCGGCGCGGCGGCAACGGCGGCACTGGCAGGTTCCACCAACGCATCACCGCTGGCACGTCGTCAGGTCCCGGTCGGCACCCCGATTCTGCAGTGCACGCAACCGGGCCTGGTGGCACTGACCTATGATGACGGTCCGTTTACCTTCACGCCGCAGCTGCTGGATATCCTGAAACAAAATGACGTGCGTGCTACCTTTTTCGTTAACGGCAACAATTGGGCGAATATTGAAGCCGGTAGTAACCCGGATACCATCCGTCGCATGCGTGCAGACGGTCATCTGGTTGGTTCACATACCTACGCACACCCGGATCTGAACACGCTGAGCTCTGCTGACCGTATTAGCCAGATGCGCCACGTCGAAGAAGCGACCCGTCGCATCGATGGCTTTGCGCCGAAATATATGCGTGCACCGTACCTGTCCTGCGATGCAGGTTGTCAGGGTGACCTGGGCGGTCTGGGTTATCATATTATCGATACCAATCTGGATACGAAAGACTACGAAAACAATAAACCGGAAACCACGCACCTGTCAGCGGAAAAATTCAACAATGAACTGTCGGCAGATGTGGGCGCTAACAGTTATATTGTTCTGTCCCATGACGTCCACGAACAGACCGTGGTTAGCCTGACGCAAAAACTGATCGATACCCTGAAATCTAAAGGTTACCGCGCCGTCACGGTGGGCGAATGTCTGGGCGACGCACCGGAAAATTGGTACAAAGCGCATCATCATCATCATCACTAACTCGAG

pVT/CDase基因大小為780bp，如圖1所示，含NcoI、XhoI兩種內(nèi)切酶和His Tag。其中附圖1為幾丁質(zhì)脫乙?；?pVT-CDase)基因的瓊脂糖電泳結(jié)果，其中標(biāo)號(hào)1為pET19(b)/pVT-CDase，標(biāo)號(hào)2為酶切后克隆片段，標(biāo)號(hào)M為DNA marker大小，從大到小依次為8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp和500bp。

2.基因克隆

pVT-CDase基因克隆所用載體為高復(fù)制質(zhì)粒:pUC57；高表達(dá)質(zhì)粒：pET19(b)。

將pVT-CDase基因插入到融合表達(dá)載體pET19(b)的多克隆位點(diǎn)NcoI和xhoI之間，并將攜帶pVT-CDase基因的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主菌E.coli BL21(DE3)菌株中。

3.蛋白表達(dá)

基因表達(dá)蛋白質(zhì)的氨基酸序列中含255個(gè)Amino Acids。其蛋白序列SEQ ID No.2為：

MGHFSTLFGAAATAALAGSTNASPLARRQVPVGTPILQCTQPGLVALTYDDGPFTFTPQLLDILKQNDVRATFFVNGNNWANIEAGSNPDTIRRMRADGHLVGSHTYAHPDLNTLSSADRISQMRHVEEATRRIDGFAPKYMRAPYLSCDAGCQGDLGGLGYHIIDTNLDTKDYENNKPETTHLSAEKFNNELSADVGANSYIVLSHDVHEQTVVSLTQKLIDTLKSKGYRAVTVGECLGDAPENWYKAHHHHHH。

將含有pET19(b)-pVT-CDase表達(dá)載體的BL21(DE3)菌株于37℃活化過(guò)夜后，按1:800稀釋的量接入含有100μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基500mL中，菌液37℃條件下培養(yǎng)至OD0.6～0.8，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，終濃度為1mmol/L)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)6h。培養(yǎng)液經(jīng)5000×g/4℃離心5min收集菌體。

將收集的菌液用PBS重懸，冰上放置30分鐘，用超聲破波裂解法(設(shè)置為35％output，5s×5s，總計(jì)1min)提取周質(zhì)蛋白，1200rpm/4℃離心，保留上清液。

經(jīng)此方法表達(dá)的為周質(zhì)蛋白，分子量為27.92KDa。該蛋白的理論pI 6.07，可用Ni柱(HisTrap TM FF Crude)純化His-tag蛋白質(zhì)，用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布，如圖2所示。其中，1為蛋白質(zhì)marker的分子量，2，3，4分別為誘導(dǎo)表達(dá)的裂解上清液的SDS-PAGE結(jié)果圖，介于30kd和40kd之間的為糖基化的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶，介于20kd和30kd之間的為未糖基化的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶。

(二)pVT-CDase酶法制備納米幾丁質(zhì)的方法

pVT-CDase是一種特異性幾丁質(zhì)脫乙酰酶，主要用于α-幾丁質(zhì)脫乙酰。

具體方法如下：

(1)取蝦皮1g，然后加入3M的HCl 300mL，在80℃條件下處理2h；反應(yīng)產(chǎn)物透析去除鹽酸殘留；

(2)將pVT-CDase按10:3000(wt/wt)的比例加入酸水解透析后幾丁質(zhì)懸浮液中，然后用0.1MNaOH將反應(yīng)液調(diào)至pH8.0；

(3)加入CoCl₂至最終濃度0.1mM，增加離子強(qiáng)度，催化脫酰反應(yīng)，其中CoCl₂作為反應(yīng)的催化劑；

(4)在恒溫60℃的條件下，攪拌反應(yīng)30min，然后加熱至100℃，繼續(xù)攪拌10min終止反應(yīng)；

(5)1200rpm，4℃離心5min，上清液即為最終產(chǎn)品；

(6)用原子力顯微鏡表征，經(jīng)pVT-CDase處理后的納米幾丁質(zhì)大小在50nm左右，如圖3所示。ZetaSizer檢測(cè)納米粒子粒度，通過(guò)光散射法納米幾丁質(zhì)顆粒(0.03％wt/v)在水中的分散度和Zeta potential，如圖4所示。經(jīng)檢測(cè)，0.03％納米幾丁質(zhì)Zeta potential為58±1mV，表明其聚陽(yáng)離子性質(zhì)。

電導(dǎo)滴定法測(cè)定綜合電荷電量。用0.3-0.5％(wt/v)的納米幾丁質(zhì)樣品50mL，用0.1N HCl將pH值調(diào)至3.4，然后用0.005N的NaOH滴定。根據(jù)有效OH-消耗量，計(jì)算樣品綜合電荷密度(58mmol/g)，如圖5所示。

實(shí)施例二

實(shí)施例二采用同實(shí)施例一相同的方法制備pVT-CDase酶，同時(shí)應(yīng)用pVT-CDase酶制備納米幾丁質(zhì)。

(1)取蝦皮1g，然后加入5M的HCl，在70℃條件下處理3h；

(2)將pVT-CDase按5:3000(wt/wt)的比例加入酸水解透析后幾丁質(zhì)懸浮液中，然后用0.1MNaOH將反應(yīng)液調(diào)至pH8.0；

(3)加入CoCl₂至最終濃度0.1mM，增加離子強(qiáng)度，催化脫酰反應(yīng)；

(4)在恒溫55℃的條件下，攪拌反應(yīng)45min，然后加熱至100℃，繼續(xù)攪拌10min終止反應(yīng)；

(5)1200rpm，4℃離心5min，上清液即為最終產(chǎn)品；

(6)用原子力顯微鏡表征，經(jīng)pVT-CDase處理后的納米幾丁質(zhì)大小在50-100nm的范圍內(nèi)。

ZetaSizer檢測(cè)納米粒子粒度，通過(guò)光散射法納米幾丁質(zhì)顆粒(0.03％wt/v)在水中的分散度和Zeta potential。經(jīng)檢測(cè)，0.03％納米幾丁質(zhì)Zeta potential為38.9±1mV，表明其聚陽(yáng)離子性質(zhì)。

實(shí)施例三

實(shí)施例三采用同實(shí)施例一相同的方法制備pVT-CDase酶，同時(shí)應(yīng)用pVT-CDase酶制備納米幾丁質(zhì)。

(1)取蝦皮1g，然后加入3M的HCl，在90℃條件下處理4h；

(2)將pVT-CDase按1:3000(wt/wt)的比例加入酸水解透析后幾丁質(zhì)懸浮液中，然后用0.1MNaOH將反應(yīng)液調(diào)至pH8.0；

(3)加入CoCl₂至最終濃度0.1mM，增加離子強(qiáng)度，催化脫酰反應(yīng)；

(4)在恒溫50℃的條件下，攪拌反應(yīng)60min，然后加熱至100℃，繼續(xù)攪拌10min終止反應(yīng)；

(5)1200rpm，4℃離心5min，上清液即為最終產(chǎn)品；

(6)用原子力顯微鏡表征，經(jīng)pVT-CDase處理后的納米幾丁質(zhì)大小在150-230nm的范圍內(nèi)。

ZetaSizer檢測(cè)納米粒子粒度，通過(guò)光散射法納米幾丁質(zhì)顆粒(0.03％wt/v)在水中的分散度和Zeta potential。經(jīng)檢測(cè)，0.03％納米幾丁質(zhì)Zeta potential為38.4±1mV，表明其聚陽(yáng)離子性質(zhì)。

對(duì)比例一

對(duì)比例一與實(shí)施例一的不同之處在于，僅僅經(jīng)過(guò)酸水解制備納米幾丁質(zhì)，不經(jīng)過(guò)本發(fā)明制備的pVT-CDase酶處理，即對(duì)比例一包含如下步驟：

(1)取蝦皮1g，然后加入3M的HCl，在80℃條件下處理2h；反應(yīng)產(chǎn)物透析去除鹽酸殘留；

(2)1200rpm，4℃離心5min，上清液即為最終產(chǎn)品；

(3)用原子力顯微鏡表征，經(jīng)酸處理后的納米幾丁質(zhì)的原子力纖維鏡圖如圖6所示，從圖6不難看出，僅僅采用酸進(jìn)行水解，得到的納米幾丁質(zhì)，納米幾丁質(zhì)粒徑較大，而且粒徑均一性較差。

對(duì)比例二

對(duì)比例二與實(shí)施例的不同之處在于，對(duì)比例二首先采用本發(fā)明制備的pVT-CDase酶處理，然后進(jìn)行酸解，其制備過(guò)程如下：

(1)取蝦皮1g，將pVT-CDase按5:3000(wt/wt)的比例加入；

(2)加入CoCl₂至最終濃度0.1mM，增加離子強(qiáng)度，催化脫酰反應(yīng)，其中CoCl₂作為反應(yīng)的催化劑；

(3)在恒溫60℃的條件下，攪拌反應(yīng)30min，然后加熱至100℃，繼續(xù)攪拌10min終止反應(yīng)；

(4)1200rpm，4℃離心5min，取上清液；

(5)向上清液中加入3M的HCl，在80℃條件下處理2h；反應(yīng)產(chǎn)物透析去除鹽酸殘留；

(6)用0.1MNaOH將反應(yīng)液調(diào)至pH8.0；

(7)1200rpm，4℃離心5min，上清液即為最終產(chǎn)品；

(8)用原子力顯微鏡表征，對(duì)比例二制備得到的納米幾丁質(zhì)如圖7所示。從圖7可以看出，采用對(duì)比例二的方法，即先進(jìn)行酶解，然后再進(jìn)行酸解的方法，得到的納米幾丁質(zhì)，其粒徑大也分布不均勻，而且容易聚集成團(tuán)。

綜上所述，采用本發(fā)明的幾丁質(zhì)脫乙?；钢苽涞玫降募{米幾丁質(zhì)，其粒徑均一，納米幾丁質(zhì)粒徑較小且均勻，產(chǎn)品的質(zhì)量較高。而且采用本發(fā)明的方法，反應(yīng)提交溫和，從而避免了浪費(fèi)。

最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。