本發(fā)明涉及生物合成領(lǐng)域，具體涉及固定化鐵螯合物酶的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鐵對(duì)于幾乎所有微生物都是必須的，細(xì)菌以鐵鰲合物形式溶解鐵離子并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿而吸收利用。無(wú)論在革蘭氏陽(yáng)性或陰性菌，鐵螯合物均是在三磷酸腺苷(ATP)依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)下被主動(dòng)攝取。由于細(xì)菌的生存對(duì)鐵離子存在依賴，因此攝取鐵離子存在一定的必要性，若將抗生素與鐵螯合物偶聯(lián)，則抗生素可利用鐵螯合物而被細(xì)菌主動(dòng)內(nèi)吞，提高抗生素的作用效率。Albomycin則是一個(gè)利用該原理的天然抗生素，其是一個(gè)含羥基氧肟酸型鐵螯合物的天然抗生素，在進(jìn)入細(xì)菌菌體后，Albomycin中鐵螯合物部分和硫代呋喃糖苷胞嘧啶部分分離，由硫代呋喃糖苷胞嘧啶部分發(fā)揮抗菌作用。

利用鐵螯合物將天然抗生素或合成抗生素導(dǎo)入細(xì)菌菌體可以避免大多數(shù)抗生素依賴被動(dòng)滲透的缺陷，繞開(kāi)部分耐藥機(jī)理的同時(shí)可以降低抗生素的用量。鐵螯合物與喹諾酮類藥物的偶合物對(duì)耐藥的金黃色葡萄球菌發(fā)揮了良好的抗菌作用，其MIC可低至1.0μM(Timothy AW等Bioconjug.Chem 2013，20：24(3)：473-486)。因此，制備和提取鐵螯合物的研究受到越來(lái)越多的重視。我們?cè)谏暾?qǐng)?zhí)枮?01410352810.3的中國(guó)發(fā)明專利中公開(kāi)了鐵螯合物的分離純化方法，提出了從鏈霉菌的發(fā)酵液中獲得鐵螯合物的方法，以此為基礎(chǔ)分析和制備鐵螯合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一方面提供了固定化鐵螯合物酶的制備方法，其包括以下步驟：鏈霉菌ATCC700974培養(yǎng)得到培養(yǎng)液；培養(yǎng)液離心得到菌體；用pH值為6～8的磷酸緩沖液將菌體混勻，細(xì)胞破碎得到破碎液；將破碎液離心，收集上清液得到酶液；將海藻酸鈉溶解于酶液中，海藻酸鈉與酶液的質(zhì)量體積比為1％～4％；將含有海藻酸鈉的酶液滴入質(zhì)量體積比為3％～6％的氯化鈣溶液中；用去離子水洗滌得到固定化小球；將固定化小球置于質(zhì)量體積比為0.05％～2％的戊二醛溶液中；微波3分鐘后洗滌，得到固定化鐵螯合物酶。

進(jìn)一步的，鏈霉菌ATCC700974培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：15～30g淀粉、1～2g KH₂PO₄、8～12g Na₂HPO₄·H₂O、1～5g NaCl、1～5g(NH₄)₂SO₄、0.1～0.2g MgSO4·7H₂O、0.5～1g CaCl₂·2H₂O、0.01～0.02g ZnSO₄·7H₂O，溶于1000ml去離子水中，pH值調(diào)至6.8；所述鏈霉菌ATCC700974培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為28℃。

進(jìn)一步的，鏈霉菌ATCC 700974培養(yǎng)包括：在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)，向每1000ml培養(yǎng)基中加入0.3～0.6g FeCl₃·6H₂O和1～10g L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽。

進(jìn)一步的，鏈霉素ATCC 700974培養(yǎng)包括：在培養(yǎng)72h后，向每1000ml培養(yǎng)液中加入0.3～0.6g FeCl₃·6H₂O并將培養(yǎng)液的pH值調(diào)至7.0。

進(jìn)一步的，氯化鈣溶液中含有質(zhì)量體積比為0.1～0.5％的殼聚糖。

本發(fā)明第二方面提供了固定化鐵螯合物酶在鐵螯合物制備中的應(yīng)用，其特征在于，固定化鐵螯合物酶的底物溶液是N⁵-乙酰基-N⁵-羥基鳥(niǎo)氨酸溶液。

進(jìn)一步的，底物溶液的pH值為7.0。

進(jìn)一步的，底物溶液中含有三磷酸腺苷二鈉鹽，三磷酸腺苷二鈉鹽與N⁵-乙?；?N⁵-羥基鳥(niǎo)氨酸的摩爾比為1∶1～3∶1。

進(jìn)一步的，底物溶液中含有FeCl₃，F(xiàn)eCl₃與N⁵-乙?；?N⁵-羥基鳥(niǎo)氨酸的摩爾比為1∶1～1∶3。

進(jìn)一步的，固定化鐵螯合物酶在25～30℃下與底物溶液接觸。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

鏈霉菌ATCC700974的種子培養(yǎng)

培養(yǎng)基(ISP2)：0.4g酵母粉、0.4g葡萄糖、1g麥芽糖，溶于100ml，pH值調(diào)至7.3。

培養(yǎng)溫度：28℃

培養(yǎng)時(shí)間：72h。

鏈霉菌ATCC700974的菌體培養(yǎng)

培養(yǎng)基：20g淀粉、1.5g KH₂PO₄、10g Na₂HPO₄·H₂O、2g NaCl、2g(NH₄)₂SO₄、0.2g MgSO4·7H₂O、0.6g CaCl₂·2H₂O、0.02g ZnSO₄·7H₂O、0.3g FeCl₃·6H₂O和1～10g L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽，溶于1000ml去離子水中，pH值調(diào)至6.8；

接種量：5％。

培養(yǎng)溫度：28℃。

培養(yǎng)時(shí)間：72h。

培養(yǎng)液補(bǔ)鐵

菌體培養(yǎng)72h后，向每1000ml培養(yǎng)液中加入0.3g FeCl₃·6H₂O，并將培養(yǎng)液的pH值調(diào)至7.0，繼續(xù)培養(yǎng)72h。

實(shí)施例2

酶液的制備

將培養(yǎng)液在5000r/min離心15分鐘，棄去上清液，將菌體轉(zhuǎn)移至大燒杯中；用pH值為7.0的磷酸緩沖液洗滌，5000r/min離心5分鐘，棄去上清，重復(fù)兩次；用pH值為7.0的磷酸緩沖液將菌體混勻，固體含量為約25％，利用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎3次，得到破碎液；將破碎液在10000r/min離心20min，收集上清液得到酶液。

酶的固定化

將海藻酸鈉溶解于酶液中，海藻酸鈉與酶液的質(zhì)量體積比為2％，在4℃靜置至無(wú)氣泡；將含有海藻酸鈉的酶液用注射器逐滴地滴入氯化鈣溶液中，氯化鈣溶液的質(zhì)量體積比為4％；氯化鈣溶液中含有質(zhì)量體積比為0.25％的殼聚糖；用去離子水洗滌，除去多余的殼聚糖和氯化鈣后瀝干，得到固定化小球；將固定化小球置于質(zhì)量體積比為0.1％的戊二醛溶液中；微波3分鐘后用去離子水洗滌，除去多余的戊二醛后瀝干，得到固定化鐵螯合物酶。

實(shí)施例3

底物溶液的配置

稱取：0.19g N⁵-乙?；?N⁵-羥基鳥(niǎo)氨酸、0.55g三磷酸腺苷二鈉鹽、0.09g FeCl₃·6H₂O，溶于100ml pH值為7.0的磷酸緩沖液中。

催化反應(yīng)

固定化鐵螯合物酶在28℃下與底物溶液接觸，反應(yīng)12h。

產(chǎn)物檢測(cè)

用移液槍吸取反應(yīng)后的溶液1ml，加入少量草酸銨溶液混勻后過(guò)濾，在Thermo LTQ XL上對(duì)鐵螯合物產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示存在m/z＝548[M+NH₄]，與預(yù)測(cè)理論值相符。

實(shí)施例4

底物溶液的配置

稱?。?.19g N⁵-乙?；?N⁵-羥基鳥(niǎo)氨酸、1.10g三磷酸腺苷二鈉鹽、0.27g FeCl₃·6H₂O，溶于100ml pH值為7.0的磷酸緩沖液中。

催化反應(yīng)

固定化鐵螯合物酶在28℃下與底物溶液接觸，反應(yīng)24h。

產(chǎn)物檢測(cè)

用移液槍吸取反應(yīng)后的溶液1ml，加入少量草酸銨溶液混勻后過(guò)濾，在Thermo LTQ XL上對(duì)鐵螯合物產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示存在m/z＝548[M+NH₄]，與預(yù)測(cè)理論值相符。

實(shí)施例5

底物溶液的配置

稱?。?.19g N⁵-乙?；?N⁵-羥基鳥(niǎo)氨酸、1.65g三磷酸腺苷二鈉鹽、0.27g FeCl₃·6H₂O，溶于100ml pH值為7.0的磷酸緩沖液中。

催化反應(yīng)

固定化鐵螯合物酶在28℃下與底物溶液接觸，反應(yīng)8h。

產(chǎn)物檢測(cè)

用移液槍吸取反應(yīng)后的溶液1ml，加入少量草酸銨溶液混勻后過(guò)濾，在Thermo LTQ XL上對(duì)鐵螯合物產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示存在m/z＝548[M+NH₄]，與預(yù)測(cè)理論值相符。