本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種制備PfuDNA聚合酶的方法。
背景技術(shù)：
：1985年，美國(guó)Cetus公司發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)，是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法，即雙鏈DNA在高溫下變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶、dNTP、特異引物的參與下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。DNA聚合酶(DNApolymerase)，是細(xì)胞DNA復(fù)制的重要酶，主要應(yīng)用在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)中。DNA聚合酶主要分為六個(gè)類型：A、B、C、D、X、Y，通常所用的屬于B型聚合酶。PfuDNA聚合酶是保真性最好的聚合酶之一。PfuDNA聚合酶(PfuDNApolymerase)是在嗜熱的古核生物火球菌屬內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，一類能在活體內(nèi)進(jìn)行DNA復(fù)制的酶。該酶含有2個(gè)蛋白亞基(P45和P50),為多聚體,分子量約為90kDa。該酶同時(shí)具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性,因此在聚合反應(yīng)中可糾正錯(cuò)誤摻入的堿基,忠實(shí)性極高。體外實(shí)驗(yàn)中，在聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)中，使用Pfu聚合酶可以快速，高保真的擴(kuò)增DNA片段。最初使用的PfuDNA聚合酶直接從菌體中分離純化，但難以得到大量的酶，后來的研究者將其基因重組到其它宿主細(xì)胞中得以表達(dá)，再經(jīng)提取純化即可滿足應(yīng)用要求。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)所述，PfuDNA聚合酶的提取一般需要兩個(gè)步驟，第一個(gè)步驟為破壁，將得到的重組菌體用超聲、溶菌酶等方法或者兩種方法結(jié)合來破碎細(xì)胞壁，此步驟需要冰浴低溫，防止酶變性失活。第二個(gè)步驟為熱變性，將破碎后的細(xì)胞或?qū)⑵扑楹蟮募?xì)胞離心取上清液置于75-80℃的水浴中20-30min，利用聚合酶的耐熱性，去除其余大部分不耐熱雜質(zhì)蛋白，減小后續(xù)純化分離的雜質(zhì)干擾，這也是其它重組耐熱DNA聚合酶的常用的提取方法。目前PfuDNA聚合酶在全球每年有幾十億美元的銷售額，其價(jià)格仍較為昂貴，因此有必要對(duì)高表達(dá)PfuDNA聚合酶系統(tǒng)進(jìn)行深入研究，以便降低生產(chǎn)成本，并且有利于其推廣。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一種PfuDNA聚合酶的制備方法，具體步驟如下：(1)克隆SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；(2)將步驟(1)所得的核苷酸片段和質(zhì)粒pET32a進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-Pfu；(3)將重組質(zhì)粒pET32a-Pfu轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21中，獲得表達(dá)菌株；(4)表達(dá)菌株利用LB培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)至OD600值為0.6后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)16-20小時(shí)后；解離菌體，過濾；獲得重組PfuDNA聚合酶。在本發(fā)明中，所述PfuDNA聚合酶的氨基酸序列為本領(lǐng)域已知的，具體序列可參見Genebank登錄號(hào)BAA02362.1。核苷酸序列SEQIDNO：1是該氨基酸序列的編碼序列，通過一定的密碼子優(yōu)化，從而使PfuDNA聚合酶在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LB培養(yǎng)液的組成為胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl10g/L；維生素C0.3g/L；葡萄糖1g/L；乳糖0.1g/L；硫酸鎂0.5g/L；余量為水，pH值為7.6。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(4)中，所述解離菌體為采用溶菌酶解離菌體；所述過濾為以層析柱和透析袋連續(xù)過濾。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述溶菌酶的濃度為4mg/ml；所述層析柱為Bio-Rex70的離子交換柱樹脂。附圖說明圖1本發(fā)明制備的pfuDNA聚合酶蛋白電泳圖具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(SambrookJ,etal.2008.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEd.)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1：基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的克隆與分析將Pfu基因(序列如SEQIDNO：1所示)和pET32a質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切，在37℃金屬浴3-4h后，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。將目的片段PfuDNA聚合酶基因和質(zhì)粒pET32a進(jìn)行連接，16℃過夜，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒命名為pET32a-Pfu。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21中，獲得表達(dá)菌株，命名為PfuDNA聚合酶菌株實(shí)施例2：PfuDNA聚合酶菌株的培養(yǎng)及誘導(dǎo)配制LB液體搖瓶(500ml的LB液體培養(yǎng)基，分裝在2個(gè)500ml的三角瓶中，即每瓶裝250mlLB培養(yǎng)液，其組成為胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl10g/L；維生素C0.3g/L；葡萄糖1g/L；乳糖0.1g/L；硫酸鎂0.5g/L；余量為水，pH值為7.6，下同；滅菌后待用)。取出PfuDNA聚合酶菌種，接種在4ml的LB+Amp(100μg/ml)液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)。每個(gè)三角瓶裝250ml的LB液體培養(yǎng)基，加入Amp(抗生素的終濃度為100μg/ml)，并用1.25ml的培養(yǎng)的菌種接種；37℃至OD600值為0.6后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)16-20小時(shí)。實(shí)施例3：PfuDNA聚合酶純化器具準(zhǔn)備層析柱選用Bio-Rex70的離子交換柱樹脂(干粉的大小是meshsize100-200。溶脹后的結(jié)合能力為5-10mg蛋白質(zhì)/ml)。稱取7g的Bio-Rex70的干樹脂，放在小燒杯中，用ddH2O洗，去掉漂浮的小顆粒，室溫溶脹2小時(shí)，期間換幾次ddH2O；用含50mMKCl的溶液C預(yù)平衡，待用；用含50mMKCl的溶液C平衡好的樹脂。裝好樹脂后再用6-10倍柱床體積的含50mMKCl的溶液C平衡柱子。檢查進(jìn)入柱子和流出柱子的溶液C的pH值不變。實(shí)施例4：蛋白質(zhì)提取及純化4℃，4000rpm，離心20分鐘收集菌體；重懸在30ml的溶液A中，沖洗收集的菌體；4℃，8000rpm，離心10分鐘收集菌體；重懸在20ml溶液A中，混勻。加入80mg的溶菌酶，使終濃度達(dá)到4mg/ml；在室溫(25℃)下保持15分鐘；加入20ml的溶液B，75℃水浴保溫1小時(shí)，期間晃動(dòng)幾次；4℃，10000rpm，離心20分鐘，棄沉淀，收集上清液；磁力攪拌器攪拌，在上清液中逐滴加入5％PEI，使終濃度達(dá)到0.15％(體積)；室溫下(25℃)繼續(xù)攪拌10分鐘；4℃，10000rpm，離心15分鐘，收集沉淀；用12ml的含25mMKCl的溶液C重懸，并洗滌沉淀；4℃，8000rpm，離心15分鐘，收集沉淀；用12ml的含25mMKCl的溶液C重懸，并洗滌沉淀；4℃，5000rpm，離心10分鐘，收集上清液，測(cè)量收集上清液的體積；加入2倍體積的不含KCl的溶液C，使收集上清液的最終KCl的濃度達(dá)到50mM。將上清液裝在平衡好的層析柱上；層析柱平衡使用6倍體積(約60ml)以上的含50mMKCl的溶液C，再次平衡；樣品用含200mMKCl的溶液C洗脫，一般準(zhǔn)備50ml洗脫液。實(shí)施例5PfuDNA聚合酶濃度測(cè)定及酶活測(cè)定(1)PfuDNA聚合酶濃度采用Bradford法進(jìn)行測(cè)定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明經(jīng)純化后的洗脫液(實(shí)施例4制備)中蛋白濃度為2.9mg/ml。通過Gelpro32軟件分析洗脫液電泳圖，結(jié)果表明PfuDNA聚合酶純度高達(dá)95％。(2)以小牛胸腺DNA為模板，并用市售商用PfuDNA聚合酶1U作為對(duì)照，反應(yīng)體系為2ul(200mMTris-HCl(PH8.8)，100mMKCl，100mM(NH4)2SO4，1％TritonX-100，1mg/mlBSA，20mMMgSO4)；1ul的DNA模板，2uldNTP，1ul引物，PfuDNA聚合酶(實(shí)施例4制備)及水；PCR反應(yīng)設(shè)置見下表結(jié)果表明，本發(fā)明PfuDNA聚合酶與市售1U聚合酶相比，酶比活為22900U/mg。實(shí)施例6編碼核苷酸序列及LB培養(yǎng)基對(duì)PfuDNA聚合酶產(chǎn)量的影響采用不同的編碼核苷酸序列或者LB培養(yǎng)液重復(fù)實(shí)施例1-4的制備試驗(yàn)，按照實(shí)施例5的方法測(cè)定獲得的PfuDNA聚合酶的濃度，結(jié)果如下：PfuDNA聚合酶的濃度對(duì)比例10.7mg/ml對(duì)比例21.1mg/ml對(duì)比例31.6mg/ml對(duì)比例41.3mg/ml對(duì)比例51.2mg/ml對(duì)比例1為編碼核苷酸序列參見Genebank登錄號(hào)D12983.1中第237位-2564位堿基序列，其他制備方法同實(shí)施例1-4對(duì)比例2為編碼核苷酸序列參見Genebank登錄號(hào)KF836420.1公開的核苷酸序列，其他制備方法同實(shí)施例1-4對(duì)比例3為L(zhǎng)B培養(yǎng)基為胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl10g/L；葡萄糖1g/L；乳糖0.1g/L；硫酸鎂0.5g/L；余量為水，pH值為7.6，其他制備方法同實(shí)施例1-4對(duì)比例4為L(zhǎng)B培養(yǎng)基為胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl10g/L；乳糖0.1g/L；硫酸鎂0.5g/L；余量為水，pH值為7.6，其他制備方法同實(shí)施例1-4對(duì)比例5為L(zhǎng)B培養(yǎng)基為胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl10g/L；維生素C0.3g/L；葡萄糖1g/L；乳糖0.1g/L；硫酸鎂0.5g/L；余量為水，pH值為7.0，其他制備方法同實(shí)施例1-4相關(guān)溶液配方如下：溶液A配方：5ml1MTris-HCl，pH8.0；0.9gDextrose(glucose)；0.2ml0.5MEDTA；加滅菌的ddH20至體積為100ml。溶液B配方：10mMTris(pH8.0)；50mMKCl；1mMEDTA；1mMPMSF；0.5％Tween20；0.5％NP-40；加滅菌的ddH20至體積為100ml。4×溶液C配方：20mMHEPES(pH7.9)；1mMEDTA；0.5mMPMSF；0.5％Tween20；0.5％NP-40；加滅菌的ddH20至體積為250ml。4×溶液D配方：20mMHEPES(pH7.9)；100mMKCl；0.1mMEDTA；0.5mMPMSF；1mMDTT；加滅菌的ddH20至體積為250ml。1×PCR反應(yīng)緩沖液配方：500mMKCl，100mMTris-HCl,pH9.0(25℃)，20mMMgCl2，0.1％明膠，1％TritonX-100。1×TAE緩沖液：用50×TAE緩沖液母液稀釋。Tris堿242g，冰醋酸57.1ml，Na2EDTA·2H2O37.2g，加滅菌的ddH20至體積為1000ml。盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3