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一種納米?雙環(huán)狀適配體探針及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:12097357閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種納米-雙環(huán)狀適配體探針,其特征在于:所述的探針由納米材料和具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀適配體組成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米-雙環(huán)狀適配體探針,其特征在于:該探針是由羧基修飾的樹枝狀納米PAMAM分子,與FAM基團(tuán)和biotion基團(tuán)修飾的具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀適配體探針dApR通過streptavidi相結(jié)合所組成的。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種納米-雙環(huán)狀適配體探針,其特征在于:環(huán)狀適配體探針dApR的合成,是由堿基數(shù)目不同的一個單環(huán)狀適配體和一個單環(huán)狀寡核苷酸雜交互補(bǔ)得到的,其中,單環(huán)狀適配體和單環(huán)狀寡核苷酸均由與之相對應(yīng)的線性單鏈DNA閉環(huán)反應(yīng)得到;線性單鏈DNA包括線性適配體鏈Ap和線性寡核苷酸鏈C1;其中,所述的線性適配體鏈Ap為:

5'-GGTTAGATTTCTAGACTCATAT(biotin)AGCTCAATCAAT

CTACGACTCGAT(FAM)C TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTAC-3';

線性適配體鏈閉環(huán)所需要的模板T-Ap為:

5'-GTC TAG AAA TCT AAC CGT ACA GTA TTT TCC-3';

其中,線性寡核苷酸鏈C1為:

5'- AGCTATATGAGTCTA GGTCGT AGATTGATTG -3';

所述的線性寡核苷酸鏈閉環(huán)所需要的模板T-C1為:

5'- ATA TAG CTC AAT CAA T -3'。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的的一種納米-雙環(huán)狀適配體探針,其特征在于,所述的環(huán)狀適配體探針dApR的合成方法包括如下步驟:

(1)將線性適配體鏈 Ap或線性寡核苷酸C1加入到含有 ATP 和Polynucleotide Kinase酶的緩沖液體系中,37℃金屬浴條件下震蕩反應(yīng)30 min后,90℃退火5min,降至室溫,得到磷酸化的Ap或C1溶液;

(2)將步驟(1)的得到的T- Ap或T-C1按照Ap和T- Ap或C1和T-C1的反應(yīng)摩爾比為1:1.3的比例分別加入到步驟(1)得到的溶液中,并分別加入10×Ligase Buffer 及dd H2O,混勻,置于恒溫金屬浴中90℃退火5min后,55 ℃振蕩反應(yīng)2 h,待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后,加入T4 DNA Ligase ,于金屬浴16 ℃反應(yīng)2 h,反應(yīng)結(jié)束后,65℃失活10min,降至室溫,得到Ap和T- Ap或C1和T-C1相雜交互補(bǔ)而形成具有雙鏈結(jié)構(gòu)的環(huán)狀DNA;

(3)向步驟(2)得到的體系中分別加入dd H2O 、10×T4 DNA Polymerase Buffer 及T4 DNA Polymerase,混勻后于恒溫金屬浴中37℃振蕩反應(yīng)16 h,結(jié)束后85 ℃失活10 min,降至室溫,得到單鏈的環(huán)狀適配體ApR和單鏈環(huán)狀寡核苷酸C1;

(4)向步驟(3)獲得的體系中分別加入其體積1/10的3 M醋酸鈉溶液和2.5倍體積無水乙醇,充分混勻后,豎直于-20 ℃放置1 h,結(jié)束后離心棄去上清,保留底部沉淀;沉淀用500 μL 的70% 乙醇在-20℃下打散,于4℃離心棄去上清,保留底部沉淀,將產(chǎn)物干燥;得到純化后的單鏈的環(huán)狀適配體ApR和單鏈環(huán)狀寡核苷酸C1;

(5)將步驟(4)得到的堿基數(shù)目較多的單鏈的環(huán)狀適配體ApR和堿基數(shù)目較少的單鏈環(huán)狀寡核苷酸C1進(jìn)行互補(bǔ)雜交,得到含功能區(qū)和雙環(huán)DNA區(qū)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)適配體探針dApR。

5.一種如權(quán)利要求1所述的的一種納米-雙環(huán)狀適配體探針制備方法,其特征在于,包括如下步驟:

(1)取末端為128個羧基的4.5代聚酰胺-胺型樹枝狀分子溶于 ddH2O中,并按照10倍于4.5代聚酰胺-胺型樹枝狀分子的等摩爾比例加入EDC、NHS后,溫和攪拌活化反應(yīng)2 h;將上述反應(yīng)得到的產(chǎn)物置于10000 MWCO透析袋中,透析24h,得到末端羧基活化的4.5代聚酰胺-胺型樹枝狀分子溶液;

(2)向步驟(1)得到的溶液中加入鏈霉親和素,溫和攪拌反應(yīng)過夜,次日加入環(huán)狀結(jié)構(gòu)適配體探針dApR,溫和攪拌反應(yīng)2 h,4.5代聚酰胺-胺型樹枝狀分子、dApR和鏈霉親和素的摩爾比(2-4):(2-4):1;反應(yīng)結(jié)束后,用50,000超濾管離心,最終得到納米-雙環(huán)狀適配體探針G-dApR。

6.如權(quán)利要求1 所述的納米-雙環(huán)狀適配體探針在制備檢測血癌細(xì)胞并抑制其活性方面試劑的應(yīng)用。

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