專利名稱：miR397在培育抗旱性植物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物育種，具體涉及miR397在培育抗旱性植物中的應用。
背景技術(shù)：
糧食問題是當今世界所面臨的幾個難題之一。通過提高單產(chǎn)或擴大種植面積、增加農(nóng)業(yè)投入改造中低產(chǎn)田等途徑來增加糧食產(chǎn)量都會碰到需要克服逆境限制或減輕逆境危害的問題。因此，認識植物對逆境的反應機制，提高植物的抗逆性，已成為農(nóng)業(yè)進一步增產(chǎn)的重要基礎(chǔ)研究，倍受世界各國政府和科學家的關(guān)注，也是當前生命科學研究的熱點。
隨著人類的經(jīng)濟發(fā)展和人口膨脹，土壤的鹽漬化和水資源短缺現(xiàn)象日趨嚴重，這些因素嚴重地影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境，土壤的鹽漬化和干旱化趨勢已成全球關(guān)注的問題，因此尋求植物特別是農(nóng)作物耐鹽、抗旱途徑是十分必要的。
miRNACmicroRNA)是一組非編碼單鏈RNA，廣泛存在于動物和植物等多細胞生物中，它可以通過與靶基因mRNA的特定位點結(jié)合，誘導該mRNA的降解或抑制該蛋白質(zhì)的合成，在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平導致基因沉默，從而參與基因的表達調(diào)控。miRNAs參與了幾乎所有的生命活動，并起著重要作用。
在植物中，DCL1酶在細胞核內(nèi)識別miRNA前體(pre-miRNA)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，將其切割成miRNA: miRNA*雙體，然后由HST蛋白將其轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中進行進一步的加工。在不同的植物組織、器官和發(fā)育時期，miRNA的表達譜是不同的，并且部分miRNA在不同的外界環(huán)境下也有著不同的表達水平。因此，研究miRNA表達譜對miRNA生物功能的研究是非常重要的。
植物miRNA主要參與植物發(fā)育調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、自身生物合成調(diào)控等。 例如miR156的靶基因是SPL轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，過量表達miR156會導 致植物營養(yǎng)生長時期的延長和遲花的現(xiàn)象；在擬南芥中，miR159切割一類受 赤霉素調(diào)控的MYB家族基因，組成型表達miR159會引起短日照情況下開花 的推遲和花粉的不正常發(fā)育；miR165/166調(diào)控葉子的極性、維管組織的發(fā)育， 擬南芥有五個HD-ZIPIII基因(REV、 PHB、 PHV、 ATHB-8及ICU4)參與調(diào) 節(jié)發(fā)育方面重要的方面，比如維管束的形成、在器官中建立或維持離軸及近軸 的極性，所有這些基因內(nèi)部都存在miR165/miR166的靶位點，miRNA調(diào)節(jié)對 于維持正常器官的極性，維管系統(tǒng)及分生組織的發(fā)育是必不可少的。
另外，還有一些植物miRNA參與逆境生理。例如miR393與生長素信 號介導的病原菌抗性，miR393的耙蛋白為F-box類的生長素因子(TIRl,AFB2， AFB3)，這些蛋白是生長素信號的轉(zhuǎn)導的重要節(jié)點，miR393的表達量提高會 減少TIR1的表達，并進一步抑制生長素信號轉(zhuǎn)導，從而使植物對病菌感染產(chǎn) 生抵抗能力；miR398的表達受氧化脅迫的作用下下調(diào)表達，在擬南芥中， miR398的靶蛋白是超氧化物岐化酶CSD1和CSD2，它們在植物中可以清除 氧負離子自由基，在植物抗氧化作用中起重要作用，組成型表達抗miR398切 斷CSD基因的轉(zhuǎn)基因植物，對強紫光照射、重金屬等高氧化狀態(tài)的逆境有更 好的抗性；miR399與植物無機磷吸收存在聯(lián)系，miR399的表達受磷(Pi)饑 餓的誘導而上調(diào)，這種上調(diào)在額外加入Pi之后馬上被抑制，miR399的靶基因 為一種UBC (Ubiquitin-conjugating E2 enzyme)蛋白，組成型表達miR399 會引起植物體內(nèi)Pi的代謝失調(diào)，使植物體內(nèi)積累過多的Pi，導致植物呈現(xiàn)Pi中毒的癥狀。
干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫是制約植物生長發(fā)育的最常見不利環(huán)境因 子。對需水量極大，并且作為重要糧食作物而言，提高其抗旱性是一項極其重 要的工程。
已有t艮導顯示(Jian-Kang Zhu， Xiangyang Hu， Jian-Hua Zhu， role of microRNA in plant salt tolerance, Pub.No.: US 2007/0214521 Al)，過表達
miR397可以顯著提高雙子葉植物擬南芥對高鹽環(huán)境的抵抗力，由此看以看出m iR397可能會對植物起到一定的抗逆作用，但目前尚未有miR397對植物抗旱作 用的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對當前植物尤其是農(nóng)作物生長需水量大，易受干旱影響 這一重大問題，將miRNA調(diào)控技術(shù)引入植物的品種改良中，從而提供miR397
在培育抗旱性植物中的應用。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的
本發(fā)明人首先選擇重要糧食作物——水稻作為研究對象，通過分析miR39 7的順式調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)其可能與水稻的逆境應激反應相關(guān)。于是本發(fā)明人對 水稻進行干旱，高鹽和冷凍處理后，提取處理樣品和未處理樣品(對照)的總 RNA，并通過northem blot檢測樣品中miRNA的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理樣品 中miR397的表達量均有不同程度上調(diào)趨勢，其中干旱處理樣品上調(diào)程度最為 顯著，且干旱處理5h時miR397表達量的上調(diào)要比干旱處理12h時miR397表達量 的上調(diào)更為顯著。由此可以得出初步的結(jié)論，miR397的表達量可能和水稻抗 旱性有一定的關(guān)系。為了進一步驗證miR397與水稻抗旱性的關(guān)系，本發(fā)明構(gòu)建了過表達 miR397的水稻突變株，該突變株在相對低溫(15~20°C)下生長狀況優(yōu)于野生 型水稻，結(jié)實情況與野生型水稻無明顯差異。對該條件下生長至20天的水稻 進行模擬干旱和干旱后復蘇處理，觀察結(jié)果顯示，過表達miR397的突變株存 活率與恢復生長程度明顯高于野生型，即突變株水稻的抗旱性優(yōu)于野生型水 稻。
綜上所述可以得出結(jié)論miR397的表達水平和水稻的抗旱性是有關(guān)系的， 而且過表達miR397可以在不減緩生長或降低結(jié)實率的前提下，顯著提高水稻 的抗旱性，因此miR397可以用于培育抗旱性水稻。
此外，本發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，miR397及其靶基因在各種高等植物(如 水稻、高粱、油菜、葡萄和楊樹等農(nóng)林作物)中都是保守的，因此miR397的 過表達能對植物(雙子葉、單子葉)都能起到抗旱性的作用，miR397可用于 植物尤其是農(nóng)作物的抗旱性育種中。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1. 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)過表達miR397可以在不減緩生長或降低結(jié)實率的前提下， 顯著提高水稻的抗旱性，這一結(jié)果為培育抗旱性水稻以及抗旱性植物提供了一 種全新的并且簡單有效的方法，可投入大規(guī)模推廣使用；
2. 本發(fā)明通過分子生物學技術(shù)培育抗旱性水稻，不但水稻的抗旱性效果 好，而且不會對環(huán)境造成污染，食用安全。


圖1為northern檢測干旱處理后水稻中miR397的表達水平電泳圖； 其中，l為5h未處理對照，2為干旱處理5h樣品，3為高鹽處理5h樣品，4為12h未處理對照，5為千旱處理12h樣品，6為高鹽處理12h樣品； 圖2為southern blot鑒定電泳圖； 其中，l為野生型對照，2 11為各T2代突變株； 圖3為northern檢測各T3代突變株中miR397的表達水平電泳； 其中，l為野生型對照，2 10為各T3代突變株； 圖4為干旱處理前的野生型與突變株水稻；
其中，1為野生型，2為過表達miR397a的突變株，3為過表達miR397b 的突變株；
圖5為干旱處理1天后的野生型與突變株水稻；
其中，1為野生型，2為過表達miR397a的突變株，3為過表達miR397b 的突變株；
圖6為干旱處理1天，復蘇10天后的野生型與突變株水稻；
其中，1為野生型，2為過表達miR397a的突變株，3為過表達miR397b
的突變株。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的闡述，但具體實施例并不對本發(fā)
明做任何限定。
實施例l水稻干旱處理及總RNA提取
本實施例對2周齡的水稻幼苗(使用Yoshida培養(yǎng)液)進行干旱處理，即用 20。/。PEG6000模擬干旱條件對水稻幼苗分別處理5h和12h，然后提取處理后水 稻幼苗的總RNA，同時提取未進行干旱處理的水稻幼苗的總RNA作為對照組。
本實施例采用本領(lǐng)域常用的酚氯仿異戊醇法提取水稻總RNA，其具體步驟如下
(1) 稱lg水稻樣品液氮研磨成細粉，加入10mL RNA zol (100ml中含有異硫氰酸胍47.2g ， lMPH7.0的檸檬酸鈉2.5ml， 10%月桂?；徕c5ml)和lmL醋酸鈉(2M， pH4.0)，繼續(xù)研磨；
(2) 加入10mL的水飽和酚，4mL的氯仿異戊醇(49:1，體積比)混合液，混勻后轉(zhuǎn)入離心管，渦旋lmin，冰上放置5分鐘，然后4X:， 12000rpm離心15min;
(3) 離心后取上清，并向上清液中加入等體積的酚氯仿異戊醇(50:49:1，體積比)混合液，渦旋lmin，冰上放置5分鐘，然后4°C ， 12,000rpm離心15min;
(4) 離心后取上清，重復步驟(3) 2~3次；
(5) 離心后取上清，并向上清液中加入異丙醇(異丙醇和上清液的體積比為0.6: 1)，冰上放置30min lh;
(6) 4°C， 12,000rpm離心15min，棄上清，往管中加入1.2mL DEPC處理水溶解管底沉淀，然后每管600|il分裝轉(zhuǎn)入1.5mL的離心管；
(7) 向上述1.5L離心管中加入600^d的酚:氯仿:異戊醇(50:49:1，體積比)混合液，上下顛倒混勻后，冰上放置5分鐘，室溫12,000rpm離心15min;
(8) 離心后取上清，重復步驟(7) 2~3次；
(9) 離心后取上清，將上清液每管分裝300)aL分裝入新的離心管中，并向分裝后的離心管中加入1/10上清體積的3M NaAc (pH 5.2)和3倍上清體積的無水乙醇，混勻，-20"放置過夜；
(10) 4°C， 12,000rpm離心15min，棄除上清，70%乙醇洗兩次，95%乙醇洗一次，晾干，用15~3(HiL DEPC處理水溶解，-20匸保存?zhèn)溆?，即獲得水稻總RNA。
本實施例總RNA提取時所用到的各種試劑均為市售。實施例2 miRNA的Northern雜交
本實施例對實施例1提取的處理樣品組總RNA和對照組總RNA進行Northern blot檢測，所用方法均可參考本領(lǐng)域Northern雜交的常規(guī)操作。
取實施例1制備的水稻總RNA lpL進行甲醛變性膠電泳，變性電泳采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作。
待電泳完畢，取下電泳板后揭板，用一張和目標區(qū)域差不多大小的干濾紙覆在凝膠樣品區(qū)域上，用刀片切去多余的凝膠，利用濾紙把膠翻轉(zhuǎn)，剝離另一塊電泳板。在膠上蓋一張等面積的預先用0.5xTBE浸潤的Hybond W尼龍膜，將濾紙-凝膠-尼龍膜放于電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad)電極之間，膠在上面，尼龍膜在下面，上下各墊10層用0.5xTBE浸濕并趕走氣泡的濾紙。用0.8 mA/cm2尼龍膜的電流強度，通電45分鐘。之后關(guān)閉電源，取下尼龍膜。尼龍膜在253nm紫外燈下正反兩面分別交聯(lián)3分鐘，將RNA及分子量標記固定于膜上。將交聯(lián)好的尼龍膜放入雜交管中，加入5 10mL雜交液(雜交液的配制可參考本領(lǐng)域Northern雜交所采用的常規(guī)雜交液配制)，42"C預雜交1小時，然后加入同位素標記探針20pL， 42"C雜交過夜。雜交完畢，將雜交液倒出，用洗膜液(2XSSPE， 0.5% SDS)于室溫下洗3次，每次10分鐘。將雜交膜包入保鮮膜中，壓磷屏3小時以上，再用磷屏掃描儀Typhoon 8600 imager掃描，并保存結(jié)果。
本實施例的Northern雜交檢測結(jié)果如圖1所示，干旱，高鹽，冷凍處理的樣品中miR397的表達量均有不同程度上調(diào)趨勢，其中干旱處理樣品上調(diào)程度最為顯著，且干旱處理5h時miR397表達量的上調(diào)要比干旱處理12h時miR397表達量的上調(diào)更為顯著。
實施例3過表達miR397水稻突變株的構(gòu)建
本實施例在實施例2的檢測結(jié)果基礎(chǔ)上，進一步構(gòu)建了過表達miR397的水稻突變株，其具體步驟如下所示
1. miR397組成型表達質(zhì)粒的構(gòu)建
本實施例選擇載體pCAMBIA1390 (市售)，并且在該載體的酶切位點///"dll和之間插入CaMV35S啟動子，該啟動子以后可以作為控制miR397表達的組成型啟動子。這里的試驗操作采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
從以實施例1制備的處理樣品總RNA為模板，克隆miR397基因，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，并且在擴增產(chǎn)物兩端加上ZZwI和五coi I的酶切位點。PCR擴增反應條件參考PCR擴增反應試劑盒說明。
PCR結(jié)束后回收擴增產(chǎn)物并進行和雙酶切，同時對pCAMBIA1390載體也進行力d和Ecoi I雙酶切，然后將兩個雙酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接起來即構(gòu)建成miR397組成型表達質(zhì)粒。
上述所涉及的擴增產(chǎn)物回收，雙酶切反應，T4連接等反應均采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作，實驗中所涉及的載體、試劑等均為市售。
2、 miR397組成型表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織
將上述構(gòu)建的miR397組成型表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(市售)，所述轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)操作，然后將該轉(zhuǎn)化有miR397過表達質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌菌種，在含有利福平，卡那霉素和潮霉素的YEP培養(yǎng)基(10g酵母膏，10 g蛋白胨，5 gNaCl， 15 g瓊脂)上進行劃線培養(yǎng)，28t:黑暗培養(yǎng)2 3天后挑取單菌落涂布于含有相同抗生素的YEP培養(yǎng)基上，28'C黑暗培養(yǎng)2天，刮取適量菌體懸浮于含有100 li M乙酰丁香酮的液體共培養(yǎng)基中，使之稀釋至OD550為0.3左右，28i:搖床(140rpm)培養(yǎng)40分鐘，即制備得到根癌農(nóng)桿菌浸染液，可用于侵染。
取水稻的成熟種子剝?nèi)シf殼，用75%酒精浸泡1分鐘后用無菌水清洗多次，然后用1%次氯酸鈉處理兩次，每次20分鐘，期間搖動多次，無菌水清洗多次后用無菌濾紙吸干水分，接到誘導培養(yǎng)基(N6大量元素，B5微量元素，B5維生素，F(xiàn)e-EDTA， 2mg/L2，4-D， 30g/L蔗糖，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，3.0g/L植物凝膠)上，將誘導出的胚性愈傷組織接到新鮮的誘導培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 3個星期再挑取生長狀態(tài)好的愈傷組織接到新鮮的誘導培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)。
挑取淡黃色、顆粒狀、結(jié)構(gòu)致密、生長狀態(tài)好的愈傷組織到無菌三角瓶中適當干燥處理后，加入上述制備好的根癌農(nóng)桿菌侵染液侵染20分鐘，期間適當搖動幾次。侵染后將愈傷組織放在加有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，風干1 2小時。然后把愈傷組織接到加有一層濾紙的共培養(yǎng)基上，再風干半小時左右后，置于26。C黑暗培養(yǎng)2 3天。
3、轉(zhuǎn)基因水稻陽性愈傷組織的篩選與分化
取出共培養(yǎng)后的愈傷組織放在加有三層濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，干燥1天左右，再接到篩選培養(yǎng)基上，置于26"C黑暗培養(yǎng)14 21天。共篩選兩次。挑取生長狀態(tài)好的抗性愈傷組織接到預分化培養(yǎng)基上，26t:光照培養(yǎng)。21天后，把生長狀態(tài)好及出現(xiàn)綠點的抗性愈傷組織接到分化培養(yǎng)基上，使愈傷組織進行200910037075.6
再生。
待抗性愈傷組織分化出的小苗長到4 6 cm時，將其轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上， 繼續(xù)在26"C光照培養(yǎng)。待小苗長至10 12cm，葉片寬大、顏色深綠且根系生 長健全后，洗掉培養(yǎng)基及其基部附著的愈傷組織，在室外進行盆栽種植，即得 到轉(zhuǎn)基因水稻(過表達miR397)。
上述篩選培養(yǎng)基的配方為N6培養(yǎng)基大量+MS培養(yǎng)基微量+B5培養(yǎng)基少 量+lg/L水解酪蛋白+lg/L脯氨酸+2mg/L (2， 4-D) +30g/L蔗糖+潮霉素 50mg/L+頭孢500mg/L+4g/L植物凝膠，篩選培養(yǎng)基的終PH=5.8。
上述預分化培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基+lg/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖 +lmg/L (2， 4-D) +頭孢50011^/1>潮霉素5011^/1^+4§^植物凝膠，預分化培 養(yǎng)基的終PH:5.8。
上述分化培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基+2mg/L (6-BA) +0.5mg/L萘乙酸 + lmg/L激動素+30g/L蔗糖+3。/。山梨醇+4g/L植物凝膠，分化培養(yǎng)基的終 PH=5.8。
上述生根培養(yǎng)基的配方為1/2 MS培養(yǎng)基。
本實施例中所采用的MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基等的配方均 采用本領(lǐng)域的常規(guī)配方。上述各培養(yǎng)基配方中所涉及的試劑均為市售。 實施例4轉(zhuǎn)基因水稻的southern blot鑒定
本實施例采用southern blot檢測來篩選實施例3所得轉(zhuǎn)基因水稻的陽性突 變株。
以水稻基因組DNA為模版，克隆miR397基因，上游引物的核苷酸序列 如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，PCR擴增反應條件同實施例3，均參考PCR擴增試劑盒的說明，將擴增得到的miR397 序列作為本實施例southernblot檢測的探針。
本實施例的southern blot檢測可參考本領(lǐng)域的常規(guī)做法，檢測結(jié)果如圖2 所示，大部分突變株檢測為陽性，成功在基因組中插入目的片斷。
將上述southern blot鑒定篩選出的陽性突變株培養(yǎng)至T3代，培養(yǎng)結(jié)果發(fā) 現(xiàn)突變株的生長與結(jié)實情況與野生型水稻無明顯差異，然后進一步使用 northern blot檢測(參照northern blot操作試劑盒的說明)各T3代突變株的 miR397表達水平，結(jié)果如圖3所示，所有突變株的miR397的表達水平均有 不同程度的上調(diào)。選擇miR397表達量最高的T3代突變株進行隨后試驗。
含有表達載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的愈傷組織誘導分化而成的植株用T。代表， T,代表示To代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T2代表示T,代自交產(chǎn)生 的種子及由它所長成的植株。T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的 植株。
實施例5干旱處理野生型與轉(zhuǎn)基因水稻
將野生型水稻和實施例4篩選得到的miR397表達量最高的T3代突變株 于相對低溫(15~20°C)下萌發(fā)，并用水培養(yǎng)20天。
將幼苗同時轉(zhuǎn)入含有15% PEG6000 (1L水中含有15g PEG6000)的水中 模擬干旱處理24h，至幼苗葉子巻曲干枯，然后更換成水進行復蘇10天。
本實施例對野生型和轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱處理以及旱后復蘇研究結(jié)果如圖 4、圖5和圖6所示，處理1天后，野生型與突變株水稻均千枯，但復蘇10 天后，野生型水稻基本枯死，而突變株的水稻均恢復正常生長。miR397在培育抗旱性植物中的應用序列表 SEQUENCE LISTING
<110〉中山大學華南師范大學
〈120〉 niiR397在培育抗旱性植物中的應用
〈130〉
<160> 2
<170> Patentln version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 31
<212〉 腿 <213>人工序列
<400> 1
gaatctagaa cacgctctac ctacatcgtg t 31
<210> 2
<211> 31
〈212〉 腿 <213〉人工序列
<400> 2
attgaattct cacctcgtct gctggggacc t 3權(quán)利要求
1、miR397在培育抗旱性植物中的應用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述應用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子 葉植物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述應用，其特征在于所述植物為水稻、高粱、油菜、 葡萄或楊樹。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于該應用是通過篩選過表達 miR397的植物從而得到抗旱性植物。
全文摘要
本發(fā)明公開miR397在培育抗旱性植物中的應用。本發(fā)明人通過對水稻進行干旱處理并檢測處理后樣品miRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)干旱處理后樣品中miR397的表達量呈顯著上調(diào)趨勢，且干旱處理5h時miR397表達量的上調(diào)要比干旱處理12h時miR397表達量的上調(diào)更為顯著。然后本發(fā)明人構(gòu)建了過表達miR397的水稻突變株，該突變株在相對低溫下生長狀況優(yōu)于野生型水稻，結(jié)實情況與野生型水稻無明顯差異，并且模擬干旱和干旱后復蘇處理的結(jié)果顯示，突變株水稻的抗旱性優(yōu)于野生型水稻。這一結(jié)果為培育抗旱性水稻及抗旱性植物提供了一種全新的并且簡單有效的方法，可投入大規(guī)模推廣使用，且不會對環(huán)境造成污染，食用安全。
文檔編號C12N15/82GK101487021SQ20091003707
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日
發(fā)明者清 劉, 張玉嬋, 杰 徐, 李洪清, 王小菁, 王聰穎, 陳月琴 申請人:中山大學;華南師范大學